Name: 随机使用时移视频显微镜细胞迁移的定量分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: 了解如何使用视频延时显微镜技术实时定量分析细胞迁移。该方法通过胶原涂层培养板和划痕实验，连续监测细胞速度与位移，为癌症生物学研究提供动态数据。

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作者感谢Amanda Struckhoff在实验初期提供的帮助。本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目5RO1CA115706支持。

1. 胶原蛋白包被板的制备
<ol>
 <li>用 Opti-Mem 培养基将胶原蛋白稀释至终浓度为 10 μg/ml。</li>
 <li>向每个孔中加入 1.5 ml 步骤 1 所得溶液，对 6 孔板进行胶原包被。于 4 °C 孵育过夜。</li>
 <li>次日，用 1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤板 2 次，并将板保存在 PBS 中。</li>
</ol>
2. 细胞准备及在6孔板上的接种
注意：使用温热的培养基和 PBS 以确保细胞运动的最佳条件
<ol>
 <li>在含有10%胎牛血清（FBS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中稀疏培养MDA-MB-231（一种侵袭性乳腺癌细胞系）。本示例中使用MDA-MB-231细胞，但该方法适用于任何贴壁的癌性和非癌性细胞系。</li>
 <li>用预热的1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次，并通过胰酶消化收集细胞。在显微镜下检查细胞，确保胰酶处理已使细胞充分脱离。</li>
 <li>加入含10% FBS的DMEM培养基终止消化，轻轻离心（1000 ×g，5分钟）收集细胞。轻柔地将细胞沉淀重悬于含10% FBS的DMEM培养基中。</li>
 <li>通过轻柔吹打使细胞沉淀充分分散。应尽可能将细胞团块解离为单个细胞。</li>
 <li>计数细胞，并用含10% FBS的DMEM培养基稀释至终浓度为50,000 个细胞/ml。每孔加入2 ml细胞悬液。</li>
 <li>将培养板置于37 °C细胞培养箱中孵育过夜，直至开始进行活细胞延时显微成像。</li>
 <li>为确保细胞迁移有足够的空间，使用移液枪头划线制造伤口，用1×PBS洗涤培养板以去除划伤产生的碎片，然后加入含10% FBS的DMEM培养基。在显微镜下检查是否有漂浮细胞。若漂浮细胞较多，应重复洗涤步骤。此时，培养板已准备好用于显微镜下的图像采集。</li>
</ol>
3. 显微镜设置与自动图像采集
有多种成像软件可用于控制显微镜以实现自动图像采集。本文中，我们使用 Slidebook 5.0 成像软件，在 Olympus 显微镜（Olympus IX81）上进行自动采集，该系统配备 EM-Hamamatsu C9100 相机，非常适合对采集速度和光毒性要求极低的活细胞实验。系统包含一个载物台顶部环境控制培养室（Neue Live Cell）和一个自动 XY 载物台控制器（Prior Proscan）。图像使用 10X UPLANFL Ph1/0.30 物镜在明场模式下采集，并设定固定的时间间隔。以下方案描述了图像采集过程。
<ol>
 <li>打开显微镜、相机和活细胞成像装置。将培养板放置在显微镜载物台上。用 Neue Live Cell 环境控制腔室覆盖培养板，该腔室连接有 CO2 供气系统和温度传感器。将恒温器设定为 37°C，CO2 浓度设定为 5%。</li>
 <li>SlideBook 软件支持全自动物镜选择、波长选择，并可轻松在荧光与明场成像技术之间切换。为设置不同的焦距控制参数，请打开 SlideBook 软件 > 进入菜单栏 > 点击选择“焦距控制”> <img alt="静力平衡符号，ΣFx=0，示意图，物理学或工程学概念的教学关键词。" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig0btn1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 0 按钮 1">，然后选择以下参数：
 <ol>
 <li>在“物镜”框中，通过下拉窗口选择物镜以定义物镜类型。请注意，我们使用的是相差物镜，并已手动在聚光镜中选择相应的相差环。如果使用配备自动聚光镜的系统，该设置将通过软件程序自动完成。或者，若物镜转盘和聚光镜均非自动化，则需手动分别选择。</li>
 <li>在“滤光片组”框中：
 <ol>
 <li>从下拉框中选择设置，以将光路导向目镜或相机（在本系统中，“Live”对应目镜，“Widefield”对应相机），查看可用的滤光片。</li>
 <li>选择适用于明场照明的滤光片（在本系统中，该选项标记为“DIC”，表示明场光路的开放位置）。</li>
 <li>点击“Open Bright”以打开明场快门，选择光源。</li>
 </ol>
 </li>
 </ol>
 </li>
 <li>若需通过目镜观察样品，请在转盘上选择明场滤光片（在本系统中为位置“6”）。首先通过目镜初步观察样品，找到合适的视野并将样品调至清晰（步骤 3.2.1 至 3.2.2.3）。随后移动滤光片转盘，将光路切换至相机以进行图像采集（在本系统中为位置“1”）。</li>
 <li>自动载物台允许选择不同的 XY 坐标，以便在图像采集过程中捕获多个感兴趣区域。在 SlideBook 软件中，进入焦距控制，选择“XY”，通过目镜选择不同位置，然后点击“set point”锁定每个位置以进行图像采集（图 1）。</li>
 <li>精细调节屏幕上显示的相机图像的焦距。可通过显微镜的手动控制旋钮或计算机控制完成，后者可实现更精细的焦距调节。</li>
 <li>使用 “焦距控制” 窗口中的控件调节载物台的 z 轴位置。为获得最佳效果，应聚焦于靠近培养板接触面的平坦细胞突起。</li>
 <li>为辅助聚焦，可使用滑块调节曝光时间，使其处于适合聚焦的合理范围内。若已选择多个 XY 位置，则需对每个单独位置进行焦距调节：在焦距控制 > XY > visit point 中操作。注意：此步骤旨在确保各视野均正确聚焦，以获得最佳静态图像。</li>
 <li>使用软件设置图像采集窗口参数。在 SlideBook 中，通过菜单栏选择 <img alt="静力平衡；ΣFx=0，MA=0。梁上受力示意图，平衡装置；物理学教学概念。" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig0btn2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 0 按钮 2"> 打开采集界面。参见 图 2。然后检查以下参数：
 <ol>
 <li>检查采集类型 > 设为时间序列（time lapse）。</li>
 <li>检查滤光片组：宽场（Wide field）：DIC（用于明场图像）。</li>
 <li>“时间序列采集”指将要采集的时间点数量（可根据细胞类型变化）。持续时间指实验的总时长。时间单位（毫秒（ms）、秒（s）、分钟（m）或小时（h））可从下拉菜单中选择。</li>
 <li>“时间间隔”指一个时间点开始到下一个时间点开始之间的延迟。输入其中任意两个值后，第三个字段将自动计算。</li>
 <li>多点 XY 采集：若需采集超过一个 XY 位置，请选择“multipoint list”。</li>
 <li>为文件命名。在本示例中，我们将其命名为“231”。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>为避免因采集大量图像导致计算机意外关机，建议使用“spool 选项”保存文件。此选项为可选，但强烈推荐。具体操作为：在采集 控制 > 选择高级（Advanced） > Spool > 采集至内存，并在每个时间点后保存至 spool 文件。浏览并选择保存 SlideBook 文件的位置（图 3）。生成的视频文件之后可从指定位置导入。显微镜设置步骤已汇总于 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3585/Figure_3.1_merged.pdf" target="_blank">文件 3.1</a> 中。</li>
</ol>
4. 迁移图像处理与分析：速度与位移的计算
在此示例中，图像处理由 SlideBook5, 6 5.0 软件完成。还有多种其他程序可用于图像处理与分析，例如 ImageJ7。
<ol>
 <li>导入在不同时间点拍摄的不同视野的 SlideBook 文件。转到菜单栏&gt; 图像&gt; 导入&gt;Slide book spool&gt;选择所需文件（图 4a）。</li>
 <li>此处我们的目标是追踪单个细胞的运动。可通过自动追踪或手动追踪实现。在本示例中，我们采用手动追踪，因为这有助于更简便地排除伪影，而自动追踪则较难做到这一点。</li>
 <li>打开需要进行追踪的 SlideBook 文件。在菜单中：选择 Mask &gt; Particle Tracking Protocol &gt; Manual Particle Tracking Protocol（图 4b）。将弹出一个窗口，显示起始和结束时间点（图 4c）。</li>
 <li>通过点击每个细胞（细胞核）的中心开始追踪单个细胞的运动。从每段视频中追踪约 10 个细胞，并从不同位置至少选择三段不同的视频，以便从一次实验中分析约 30 个细胞。每项实验应重复三次。为确保无偏性，应从不同位置选择细胞，例如前部、中部、角落等区域的细胞。完成追踪后点击“OK”。</li>
 <li>可通过测量速度、速率或位移等参数的变化来分析随机迁移。为分析数据，请在菜单中&gt; 选择 mask &gt; particle tracking&gt;particle tracking protocol。按以下说明选择追踪参数（图 5a）：
 <ol>
 <li>Track with - 从下拉列表中选择您希望追踪的参数。在本示例中，我们使用了 Center of Area（对象中心的坐标）。</li>
 <li>点击“track and continue”。追踪完成后，系统将自动进入下一步。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>选择每条轨迹所需的统计参数，例如位移和平均速度（见 图 5b）：
 <ol>
 <li>平均速度 - 总移动距离除以移动该距离所需的时间。</li>
 <li>总位移 - 对象移动的总距离。</li>
 <li>若要进入下一步，请点击“Calculate and Continue”；若仅需查看统计结果而不进入下一步，则选择“Calculate”。系统将生成一个文件，可将其保存为文本文件，并后续导出至 Excel。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>若要使用自动追踪协议追踪对象，首先需创建一个 Mask。
 <ol>
 <li>选择 Mask &gt; Segment Image&gt; 将出现分割窗口 &gt; 调整至达到阈值，使各对象彼此分离 &gt; 点击应用 &gt; 确定（见 图 5c）。第 4.5.1 步与此相同。</li>
 <li>移除小于 的对象 - 勾选此框，以选择性移除小于指定尺寸的对象。在编辑框中输入尺寸，并选择单位为微米或像素。此操作用于去除常由碎片引起的伪影。</li>
 <li>最小移动 - 输入确定一条轨迹所需追踪的最少时间点数。</li>
 <li>最大移动 - 输入任一对象在相邻时间点之间预期的最大移动距离。</li>
 <li>数据分析步骤与手动追踪相同（参见步骤 4.5.2 至 4.6.2）。</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
5. 代表性结果
以速度和位移为量化指标的随机迁移分析示例（图6）。将文件导出至 Excel 后，使用箱形图（box and whiskers plot）绘制数据。采用 Mann-Whitney 检验对实验组与对照组之间的总位移和平均速度进行统计学比较。实验组的平均速度较对照组有所增加。实验组的总位移较对照组有所增加。
对照组与实验组的活细胞成像：将对照组 MDA-MB-231 细胞和实验组 MDA-MB-231 细胞接种于胶原蛋白包被的培养皿中，过夜培养。使用配备 EM-Hamamatsu 相机的 Olympus 显微镜进行延时视频显微观察。在细胞随机迁移过程中，每隔 1 小时采集一次图像，共持续 18 小时。请参见对照样本和实验样本随机迁移的视频 1和视频 2。
显微镜设置：
<img alt="显微镜图像采集、相机设置调整的焦距控制软件界面示意图" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 设置多个图像采集点。
<img alt="显微镜延时成像采集设置界面；曝光、滤光片设置及持续时间调整。" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 采集控制操作步骤示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3585/3585fig2large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清大图</a>。
<img alt="捕获首选项设置对话框、卷轴模式选项、文件保存目录浏览。" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 如何保存多张图像。
迁移的图像处理与分析
<img alt="SlideBook 软件界面；用于图像分析和数据处理工具的导入选项" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig4a.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4a"> 
图 4a. 导入图像进行数据分析的步骤。
<img alt="显示细胞显微图像的颗粒追踪软件界面，可见手动追踪设置选项" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig4b.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4b"> 
图 4b. 使用颗粒追踪方案分析数据的步骤。
<img alt="手动输入路径对话框，质心特征，时间点追踪设置。" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig4c.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4c"> 
图 4c. 显示被追踪粒子路径长度的窗口。
数据分析步骤。
<img alt="粒子示踪分析流程界面；用于2D/4D图像分析的轨迹创建；手动设置显示。" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig5a.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5a"> 
图5a. 粒子示踪分析流程参数的步骤示意图。
<img alt="用于路径统计分析的粒子追踪协议界面；包含速度计算选项。" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig5b.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5b"> 
图 5b. 待分析路径统计参数的选择。
<img alt="细胞分割方法；用于数据处理的微分干涉差（DIC）显微镜图像分析软件界面。" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig5c.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5c"> 
图 5c. 创建掩膜以实现自动追踪流程的步骤。
<img alt="显示平均速度和位移统计分析的箱线图；显著差异，p&lt;0.0001。" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 6"> 
图 6. 平均速度（图 6a）和位移（图 6b）以须线图形式展示。与对照组相比，测试样本的速度和位移均有所增加。
视频
视频 1. 对照细胞的迁移。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3585/3585movie1.avi" target="_blank">点击此处观看视频</a>。
视频 2. 测试细胞的迁移。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3585/3585movie2.avi" target="_blank">点击此处观看视频</a>。
将对照组 MDA-MB-231 细胞和实验组 MDA-MB-231 细胞稀疏接种于胶原蛋白包被的培养皿中，过夜培养。使用配备 EM-Hamamatsu 相机的 Olympus 显微镜进行延时视频显微观察。在随机迁移过程中，每隔 1 小时拍摄一次图像，持续 18 小时。请参见对照组和实验组随机迁移的动态视频。

<ol><li>Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%3A+a+physically+integrated+molecular+process%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell migration: a physically integrated molecular process.</a> Cell. 84, 359-369 (1996).</li>
<li>Ridley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%3A+integrating+signals+from+front+to+back%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell migration: integrating signals from front to back.</a> Science. 302, 1704-1709 (2003).</li>
<li>Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+versus+directionally+persistent+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Random versus directionally persistent cell migration.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).</li>
<li>Valone, F. H., Austen, K. F., Goetzl, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+random+migration+of+human+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Modulation of the random migration of human platelets.</a> J. Clin. Invest. 54, 1100-1106 (1974).</li>
<li>Biehlmaier, O., Hehl, J., Csucs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition+speed+comparison+of+microscope+software+programs%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">Acquisition speed comparison of microscope software programs.</a> Microsc. Res. Tech. 74, 539-545 (2011).</li>
<li>Struckhoff, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+ROCK+in+tumor+cells+controls+CXCR4-driven+adhesion+events%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of ROCK in tumor cells controls CXCR4-driven adhesion events.</a> J. Cell. Sci. 123, 401-412 (2010).</li>
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<li>Greenberg, J. H., Seppa, S., Seppa, H., Tyl Hewitt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+collagen+and+fibronectin+in+neural+crest+cell+adhesion+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of collagen and fibronectin in neural crest cell adhesion and migration.</a> Dev. Biol. 87, 259-266 (1981).</li>
<li>Albini, A., Sporn, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumour+microenvironment+as+a+target+for+chemoprevention%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The tumour microenvironment as a target for chemoprevention.</a> Nat. Rev. Cancer. 7, 139-147 (2007).</li>
<li>Yu, Y. P., Luo, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myopodin-mediated+suppression+of+prostate+cancer+cell+migration+involves+interaction+with+zyxin%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Myopodin-mediated suppression of prostate cancer cell migration involves interaction with zyxin.</a> Cancer. Res. 66, 7414-7419 (2006).</li>
<li>Teng, T. S., Lin, B., Manser, E., Ng, D. C., Cao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stat3+promotes+directional+cell+migration+by+regulating+Rac1+activity+via+its+activator+betaPIX%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Stat3 promotes directional cell migration by regulating Rac1 activity via its activator betaPIX.</a> J. Cell. Sci. 122, 4150-4159 (2009).</li>
<li>Wozniak, M. A., Kwong, L., Chodniewicz, D., Klemke, R. L., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R-Ras+controls+membrane+protrusion+and+cell+migration+through+the+spatial+regulation+of+Rac+and+Rho%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">R-Ras controls membrane protrusion and cell migration through the spatial regulation of Rac and Rho.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 84-96 (2005).</li>
<li>Orr, A. W., Elzie, C. A., Kucik, D. F., Murphy-Ullrich, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombospondin+signaling+through+the+calreticulin%2FLDL+receptor-related+protein+co-complex+stimulates+random+and+directed+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Thrombospondin signaling through the calreticulin/LDL receptor-related protein co-complex stimulates random and directed cell migration.</a> J. Cell Sci. 116, 2917-2927 (2003).</li>
<li>Smith, A., Bracke, M., Leitinger, B., Porter, J. C., Hogg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LFA-1-induced+T+cell+migration+on+ICAM-1+involves+regulation+of+MLCK-mediated+attachment+and+ROCK-dependent+detachment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">LFA-1-induced T cell migration on ICAM-1 involves regulation of MLCK-mediated attachment and ROCK-dependent detachment.</a> J. Cell Sci. 116, 3123-3133 (2003).</li>
</ol>

我们没有需要披露的内容。

实时随机迁移实验能够准确、灵敏地分析细胞迁移参数，例如速度和位移。该方法不受终点测量值的限制，因此更具定量性。由于细胞在含血清的正常DMEM培养基中进行监测，从而减少了在无血清培养基中长时间孵育带来的不利影响。已有研究表明，细胞迁移依赖于细胞与基质之间接触的形成和解离8，因此该方法可用于研究不同基质对细胞迁移的影响。
其中一个关键步骤是将温度精确控制在37°C，并将CO2维持在5%，以确保最佳的细胞迁移效果。该实验允许灵活选择所需的时间点来监测迁移反应；然而，可能需要优化时间点的数量。例如，迁移速率较低的细胞可能需要比迁移速率较高的细胞更长的监测时间。
肿瘤微环境是致癌过程中的关键因素之一。癌症的发生源于肿瘤细胞与周围细胞（如内皮细胞、间质细胞和炎性细胞）之间的相互作用9。该实验方法可进行改进，用于研究肿瘤细胞的迁移如何受到微环境的影响。其中一种实现方式是，研究在不同细胞混合群体（如间质细胞和内皮细胞）中培养的荧光标记肿瘤细胞的迁移行为。该方法还可用于实时观...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>健明生物制品</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Opti-Mem</td><td>Invitrogen</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>胶原蛋白</td><td>BD Biosciences</td><td>354231</td><td></td></tr><tr><td>配备活细胞培养室的显微镜 &amp;和自动XY轴载物台控制器</td><td>Olympus Corporation</td><td>Olympus 1X81</td><td></td></tr><tr><td>环境控制箱</td><td>纽厄</td><td>新型活细胞培养室</td><td>我们的设备配备了一个定制的矩形玻璃板顶盖，可实现通过腔室顶部的适当光学观测。矩形形状可兼容我们在许多实验中使用的多孔板。 </td></tr><tr><td>自动XY载物台</td><td>Prior Scientific</td><td>先前的 Proscan</td><td>这使得在延时显微镜观察期间能够精确返回多个选定的XY位置。</td></tr><tr><td>相机</td><td></td><td>滨松EM相机C9100</td><td></td></tr><tr><td>软件</td><td>通常通过显微镜供应商（如 Olympus）购买</td><td>幻灯片手册 5</td><td></td></tr></tbody></table>

使用延时视频显微镜对细胞随机迁移进行定量分析

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

细胞迁移是一个动态过程，在胚胎发育、组织修复、免疫系统功能以及肿瘤侵袭中具有重要作用1, 2。在定向迁移过程中，细胞会快速移动，以响应细胞外的趋化信号，或响应由基本运动机制提供的内在信号3。当细胞的内在方向性较弱时，会发生随机迁移，使细胞能够探索其局部环境。
细胞迁移是一个复杂的过程，在初始反应中，细胞会发生极化，并向迁移方向伸出突起2。传统的迁移检测方法，如Boyden小室迁移实验，是一种在体外（in vitro）测量趋化性的简便方法，可用来测定迁移的终点结果。然而，该方法既无法测量单个迁移参数，也无法观察细胞在迁移过程中发生的形态学变化。
在此，我们介绍一种利用视频-时间推移显微镜实时监测细胞迁移的方法。由于细胞迁移与侵袭是癌症的标志性特征，该方法可广泛应用于癌症细胞迁移与侵袭的研究。 体外血小板的随机迁移被认为是血小板功能的参数之一 4，因此该方法也可用于研究血小板功能。该检测方法具有快速、可靠、可重复的优点，且无需优化细胞数量。为维持细胞的生理适宜条件，显微镜配备有CO₂2 供液与温度恒温系统。通过显微镜连接的相机定期拍摄图像以监测细胞运动。利用Slidebook软件计算平均速度和平均位移，从而分析细胞迁移。

该方法可实现对细胞的实时监测，并对细胞迁移的不同参数（如速度、位移和速率）进行定量测量。与传统方法不同，这种实时方法并非基于终点定量迁移测量，而是能够连续监测并计算各种参数。

细胞迁移是一个动态过程，在胚胎发育、组织修复、免疫系统功能和肿瘤侵袭中具有重要作用1, 2。在……过程中

以下实验的总体目标是利用延时视频显微镜实时定量测量细胞迁移。首先，用胶原蛋白包被六孔培养板，然后将目标细胞稀疏地接种到包被好的培养板上。第二步，使用移液器枪头在培养板上制造一个划痕，确保留出足够的空间供细胞迁移。接下来，使用温度控制系统设置显微镜，并以固定时间间隔采集图像，以实现实时连续监测迁移中的细胞。最终，采用颗粒追踪方案来评估实验组与对照组细胞在平均速度和总位移上的差异。该技术相较于现有方法（如避让室迁移实验）的主要优势在于，它不依赖于终点定量迁移测量。相反，该方法能够连续监测和计算不同的参数。此方法有助于回答肿瘤生物学领域的关键问题，例如特定基因或药物如何影响肿瘤细胞的迁移？在实验前两天，向六孔培养板的每孔中加入1.5毫升用Opti培养基稀释的胶原蛋白，然后在实验前一天于4°C条件下过夜孵育。将目标细胞用每孔2毫升含FBS的DMEM重悬，转移至包被有胶原蛋白ENC的培养板各孔中，在37摄氏度孵育过夜。在实验当天，使用移液器枪头在过夜培养的细胞上制造划痕，并用PBS洗涤每孔，以去除因划痕产生的碎片。向洗涤后的孔中加入含FBS的DMEM培养基，然后在显微镜下观察，确认已形成清晰的划痕区域。打开显微镜相机和活细胞成像装置后，将培养板置于显微镜载物台上。用新的活细胞环境控制腔室覆盖培养板，并将温度设定为37摄氏度，二氧化碳浓度设定为5%。现在，在菜单栏中打开SlideBook软件。单击圆形内的 F 按钮以选择对焦控制。在物镜设置框中，使用下拉窗口定义物镜。在滤光片组设置框中，选择将光路导向 I 片的设置。选择适用于明场照明的滤光片，然后单击打开明场照明。打开明场快门。然后在物镜转换器上选择明场滤光片，通过目镜观察样品，找到合适的视野并将样品调至清晰。接着转动滤光片转盘，将光路切换至相机。在幻灯片成像软件中进行图像采集时，单击焦点控制，选择XY以通过目镜选取不同位置，然后单击设置点以锁定每个位置。进行图像采集时，手动微调屏幕上显示的相机图像焦距，然后使用焦距控制窗口中的工具调节载物台的 Z 轴位置。为获得最佳效果，应以细胞贴近培养板处的平坦突起结构作为对焦参考，以辅助对焦。使用滑块调节曝光时间，使其处于适合对焦的合理范围内。如果已选择多个XY位置，请通过选择焦点控制，然后选择xy，再选择访问点，来为每个单独位置调整焦点。在幻灯片库中，从菜单栏选择相机图标，选择拍摄类型，然后选择延时拍摄以设定实验的持续时间。从下拉菜单中输入一个时间点开始与下一个时间点开始之间所需的延迟时间。在间隔字段中，第三个字段将根据手动输入的数值自动计算。在多点 XY 采集下，若实验包含多个 XY 位置，请选择多点列表。最后，为文件命名以保存文件，进入捕获控制并选择高级，然后进行卷绕。每次时间点结束后，先捕获到内存，再保存为卷绕文件。开始时点击图像。在幻灯书菜单栏中，从下拉菜单中选择“导入”，然后单击幻灯书卷轴。选择从迁移实验中生成的针对不同视野和时间点的所需幻灯书文件。打开第一个文件后，在菜单栏中选择“掩膜”，然后从下拉菜单中选择粒子追踪协议。在粒子追踪菜单下，选择手动粒子追踪方案。将出现一个包含起始和结束时间点的窗口。为分析随机迁移，选择掩膜，然后选择粒子追踪方案。同样，为确定物体中心的坐标，选择面积中心。然后点击“跟踪”并继续。现在为每条路径选择所需的统计参数，例如位移和平均速度。如图所示，点击“计算”以查看统计结果。本框图展示了以速度为量化指标的随机迁移分析示例。在本实验的须状图中，敲低了肿瘤抑制基因的 M-D-A-M-B 2 31 细胞平均速度有所增加。与此处的对照组 M-D-A-M-B 2 31 细胞相比，来自第一幅图的细胞随机迁移通过细胞位移进行了分析。同样，与对照组 MDA-MB-231 细胞相比，总肿瘤抑制基因敲低组的细胞位移增加。该延时视频显微镜录像中的对照组 MDA-MB-231 细胞在胶原上贴壁培养过夜，随后在随机迁移过程中每小时采集一次图像，共持续 18 小时。注意观察细胞随时间推移逐渐离开其原始位置的情况。本视频记录并分析了测试用 M-D-A-M-B 231 细胞在胶原蛋白上过夜接种后的迁移情况。请注意，与前一个视频中的对照细胞相比，这些测试细胞具有更强的迁移能力。采用此方法后，还可进行细胞侵袭和dynas等其他实验，以回答更多问题，例如：细胞在癌症转移的发生发展过程中发挥哪些作用？该技术为细胞生物学领域的研究人员利用分离的癌细胞系探索细胞迁移提供了重要基础。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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