随机使用时移视频显微镜细胞迁移的定量分析

以下实验的总体目标是使用视频延时显微镜实时定量测量细胞的迁移。这是通过首先用胶原蛋白包被六孔培养板，然后将目标细胞稀疏接种到包被板上来实现的。第二步，使用移液器吸头在板中形成伤口，确保有足够的迁移空间。

接下来，设置显微镜并使用温度控制系统定期捕获图像，以便实时连续监测迁移的细胞。最终，粒子跟踪协议用于评估测试单元和对照单元的平均速度和总位移的差异。与回避室迁移测定等现有方法相比，该技术的主要优点是它不基于终点定量迁移测量。

相反，它允许连续监控和计算不同的参数。这种方法可以帮助回答癌症生物学领域的关键问题，例如特定基因或药物如何影响肿瘤细胞迁移？手术前两天，将 1.5 毫升在 opti 培养基中稀释的胶原蛋白加入 6 孔培养板的每个孔中，然后在手术前一天在 4 摄氏度下孵育板过夜。

目标细胞重悬于每孔 2 毫升 DMEM 加 FBS 中，并将细胞转移到胶原蛋白 ENC 包被板的每个孔中，在 37 摄氏度下孵育细胞过夜。手术当天。使用移液器吸头在过夜培养的细胞上形成伤口，并用 PBS 洗涤每个孔以去除因伤口而形成的任何碎屑。

将 DMEM 加 FBS 添加到冲洗的孔中，然后在显微镜下检查以确认已创建干净的伤口空间。打开显微镜相机和活细胞成像仪后，将板放在显微镜载物台上。用新的活细胞环境控制室盖住板，并将恒温器设置为 37 摄氏度，将二氧化碳设置为 5%现在打开菜单栏中的幻灯片软件。

通过单击圆圈内的 F 按钮选择焦点控件。在物镜框中，使用下拉窗口定义物镜 在滤光片设置框中，选择设置以将光路定向到 I 件。为 Bright Field Illumination 选择合适的过滤器，然后单击打开 Bright。

打开明场快门。现在选择转盘上的明场滤光片，通过目镜查看样品，以找到合适的视场并使样品聚焦。然后移动滤镜转台，改变光路到相机 在幻灯片软件中进行图像捕捉，点击对焦控制选择XY，通过I块选择不同的位置，然后点击设定点，锁定在每个位置。

对于图像捕获，请手动微调在屏幕上查看的摄像机图像的焦点，然后使用焦点控件窗口中的工具调整舞台的 Z 位置。为获得最佳效果，请聚焦在与板接触附近的扁平蜂窝突起上，以帮助聚焦。使用滑块调整曝光时间，使其处于适合对焦的范围内。

如果已选择多个 XY 位置，则通过选择焦点控制来调整每个位置的焦点。然后是 xy，然后是 visit point。在幻灯片簿中，从菜单栏中选择相机图形，选择捕获类型，然后选择延时摄影以选择实验的时间长度。

从下拉菜单中，键入一个时间点的开始和下一个时间点的开始之间的所需延迟。在间隔字段中，第三个字段将根据手动输入的值自动计算。在多个 XY 捕获下，为具有多个 XY 位置的实验选择多点列表。

最后，为文件命名以保存文件，转到 Capture Control 并选择 高级，然后选择 假脱机。然后捕获到内存并保存到 spool 文件每个时间点之后。首先点击图片。

在幻灯片簿菜单栏中，从下拉菜单中选择 导入，然后单击 幻灯片簿假脱机。选择从迁移实验中为各个字段和时间点生成的所需幻灯片簿文件。打开第一个文件，然后在菜单栏上选择 mask 并从下拉菜单中选择 particle tracking protocol。

在粒子跟踪菜单下，选择 manual particle tracking protocol（手动粒子跟踪协议）。将出现一个窗口，其中包含开始和结束时间点要分析随机迁移，请选择 mask，然后选择 particle tracking protocol。同样，要确定对象中心的坐标，请选择 center of area （区域中心）。

然后点击 跟踪并继续.现在，为每条路径选择所需的统计数据，例如位移和平均速度。如此处所示，单击 calculate 查看统计信息。

此框中显示了以速度量化的随机迁移分析示例。在 Whiskers 图中，在本实验中，具有敲低肿瘤抑制基因的 M-D-A-M-B 2 31 细胞的平均速度增加。与这里的对照 M-D-A-M-B 2 31 个细胞相比，根据细胞位移分析了来自第一个图的细胞的随机迁移。

同样，与对照 M-D-A-M-B 2 相比，总肿瘤抑制基因敲低组的细胞位移增加 31。在这个延时视频显微镜电影对照 MDA MB 2 31 细胞中，细胞在胶原蛋白上放置过夜。然后在随机迁移期间以 1 小时的间隔拍摄图像，总共 18 小时。

请注意单元格如何随时间推移从其原始位置移开。在本影片中，记录并分析了测试 M-D-A-M-B 2 31 细胞在胶原蛋白上接种过夜后的迁移。请注意，与上一部电影中的对照细胞相比，测试细胞的迁移性更强。

按照这个程序，可以执行其他方法，如细胞侵袭和 dynas 来回答其他问题，例如，细胞在癌症转移中的作用是什么发展后？这项技术为细胞生物学领域的研究人员使用分离的癌细胞系探索细胞迁移铺平了道路。