Name: 测定植物铁含量的比色法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: 学习使用普鲁士蓝比色法测定植物组织中的铁含量。该方法操作简便、结果精确，适用于烟草等植物样本的铁定量分析，有助于研究植物营养状况。

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本工作由以色列科学、技术与太空部以及以色列农业部首席科学家基金（项目编号：#16-16-0003）资助。

1. 植物材料与生长条件
<ol>
	<li>在装有标准盆栽培养基的 5 cm × 5 cm 花盆中，每盆播种一粒烟草（品种 Samsun）。将花盆置于托盘上，在长日照条件（16/8 小时光照/黑暗）、恒温 23 °C 的生长室中培养。用自来水浇灌，直至水从花盆底部排出。</li>
	<li>播种后约 50±5 天，根据实验所需浓度开始在浇灌水中添加铁处理。例如，我们使用了 0 至 6 mM 范围内的铁浓度，并添加可溶性铁螯合剂（Fe EDDHA）。每隔两天用相应的溶液浇灌一次（以避免脱水），持续 6–8 天。</li>
</ol>
2. 准备用于铁含量测定的叶片
注意事项：所有待使用的材料必须为无铁材料，以降低铁污染的风险. 使用4% HCl溶液将研钵和研杵各清洗两次，每次用滤纸擦干后再使用。若任何材料需重复使用，亦须用4% HCl溶液清洗两次，并每次用滤纸擦干。
<ol>
	<li>用手（戴手套操作，不得使用任何金属器械）将叶片从茎上剥离。每个样品使用约 10 g 叶片（鲜重）。使用喷雾瓶以重蒸水（DDW）清洗每片叶片。此步骤至关重要，可避免铁（Fe）污染。</li>
	<li>将叶片在纸巾上擦干后放入纸袋中。将纸袋转移至恒温 80 °C 的烘箱中干燥 2–3 天。</li>
	<li>干燥后，使用研钵和研杵将叶片研磨成粉末，并转移至无菌的 15 mL 塑料离心管中。</li>
</ol>
3. 将叶片燃烧成灰烬
注意事项：使用低pH（接近0）的HCl溶液旨在提高铁的溶解度。岩棉用于防止燃烧过程中气体从样品瓶中逸出。
<ol>
	<li>称取一个未开封的 20 mL 闪烁小瓶（不带瓶盖）的重量。记录该数值，或使用去皮键将数值归零。将粉碎后的干燥叶片（样品）加入小瓶中。</li>
	<li>称量样品和容器的总重量并记录数值。用岩棉塞紧小瓶口。</li>
	<li>另称取 3 个未加样品的小瓶并记录其重量。这些小瓶将作为对照，用于评估岩棉可能引起的样品增重。</li>
	<li>将样品瓶和对照瓶放入马弗炉中，并按以下温度程序开始灼烧：室温下快速升至 425 °C，最终在 425 °C 下持续灼烧 4 小时。此时，干燥的叶片应已完全转化为灰分。</li>
	<li>让样品冷却至约 100 °C，但不得低于此温度，以便进行后续两个步骤，避免因吸湿而影响样品的最终重量。戴上厚手套，用镊子夹住小瓶外壁，将样品从马弗炉中取出。</li>
	<li>将小瓶平放在水平表面上，移除岩棉，并用原瓶盖盖紧小瓶。</li>
	<li>称量 3 个对照小瓶（见步骤 3.3），计算其平均增重。若增重等于或超过灰分重量的 1%（见步骤 4.2），则将该值作为测量误差的估计值。</li>
</ol>
4. 准备灰化样品以测定铁含量
注意事项：初始样品中最终的铁浓度计算方法为，将灰烬的重量除以加入的盐酸体积。
<ol>
	<li>通过将 12.5 mL 的 37% 浓盐酸原液加入 87.5 mL 的去离子水（DDW）中，配制 1 M 盐酸溶液（4% 盐酸）（使用塑料或玻璃烧瓶）。</li>
	<li>称量一个 15 mL 塑料离心管并记录其重量，或使用去皮键将读数归零。将灰分转移至该离心管中，再次称重并记录数值。此数值即为灰分重量。</li>
	<li>向灰分中加入 5 mL 的 1 M 盐酸溶液。用 22 µm 滤膜过滤灰分溶液，并通过同一滤膜再加入额外的 5 mL 1 M 盐酸溶液。</li>
	<li>最终体积应为 10 mL。注意：部分溶液会在过滤过程中损失。 
	注意：样品现在可用于火焰原子吸收光谱法（FAAS）或普鲁士蓝法测定铁含量。</li>
	<li>针对每种植物物种，利用原子光谱法和普鲁士蓝法测得的铁浓度绘制标准曲线（见图 4）。此后，可单独使用普鲁士蓝法测定铁浓度。</li>
</ol>
5. 采用火焰原子吸收光谱法测定铁浓度
<ol>
	<li>从每个样品中取出 4 mL，用于火焰原子吸收光谱法（FAAS）测定。</li>
	<li>将 FAAS 测定得到的结果除以灰分的重量，再将所得数值除以 0.01（因为灰分溶于 10 mL 溶液中）。最终结果即为每克灰分中的铁浓度（ppm）。</li>
</ol>
6. 配制普鲁士蓝染色液
<ol>
	<li>通过将 4 g K4Fe(CN)6 加入 100 mL 去离子水中并涡旋混合，配制 4% 的普鲁士蓝溶液（可根据不同需求使用其他体积和/或浓度）。需要注意的是，本研究中使用的普鲁士蓝溶液浓度低于先前报道的 20%14。</li>
	<li>将溶液置于 4 °C 避光保存，直至使用。在此条件下储存，溶液可稳定保存 6 个月。</li>
</ol>
7. 使用 FAAS 结果为普鲁士蓝法生成校准曲线
注意：使用以下公式计算灰分中的铁浓度 
<img alt="使用原子吸收法测定铁浓度的公式；分析化学分析方程。" src="/files/ftp_upload/57408/57408eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程">             公式 1 
C：浓度，V：样品体积，W：灰分重量（g）。
<ol>
	<li>取0.50 mL普鲁士蓝溶液与0.50 mL 1 M盐酸混合，作为空白溶液。</li>
	<li>用移液器将0.5 mL样品（按第3节所述溶于4%盐酸中的灰分）与0.5 mL普鲁士蓝溶液（步骤6.1）混合。静置至少1分钟，但不超过5分钟。超过5分钟后，样品将开始发生沉降。</li>
	<li>将混合液转移至比色皿中，使用分光光度计在715 nm波长下测定其光密度（OD），并记录数值。</li>
	<li>将测得的光密度值（步骤7.3）除以样品的灰分重量（步骤3.2），所得结果表示每克灰分的光密度值。</li>
	<li>以火焰原子吸收光谱法（FAAS）测得的铁浓度为Y轴，以光密度值（OD）为X轴，绘制线性回归曲线。使用步骤5.2和7.4中获得的结果，计算回归方程Y = a + bX，其中Y代表铁浓度，a代表吸光度截距，b代表吸光度斜率，X代表光密度（OD）。</li>
</ol>
8. 采用普鲁士蓝法测定同种植物其他样品中的铁含量
注意事项：由于此类植物的校准曲线已经建立，因此可直接使用线性回归公式计算同类型植物新样品中的铁浓度。
<ol>
	<li>执行第3和第4节的步骤，然后执行步骤7.1至7.4。</li>
	<li>使用线性回归所得公式（步骤7.5）计算溶液中铁的浓度。</li>
</ol>

<ol><li>Kobayashi, T., Nishizawa, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+uptake%2C+translocation%2C+and+regulation+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Iron uptake, translocation, and regulation in higher plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 63 (1), 131-152 (2012).</li>
<li>Bradley, J. M., Le Brun, N. E., Moore, G. R. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00775-016-1336-0">Ferritins: Furnishing proteins with iron.</a> Journal of Biological Inorganic Chemistry. 21 (1), 13-28 (2012).</li>
<li>Zielińska-Dawidziak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+ferritin+-+a+source+of+iron+to+prevent+its+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Plant ferritin - a source of iron to prevent its deficiency.</a> Nutrients. 7 (2), 1184-1201 (2015).</li>
<li>Johnson, D. C., Dean, D. R., Smith, A. D., Johnson, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+function%2C+and+formation+of+biological+iron-sulfur+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure, function, and formation of biological iron-sulfur clusters.</a> Annual Review of Biochemistry. 74 (1), 247-281 (2015).</li>
<li>Guo, H., Barnard, A. S. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2013/ta/c2ta00523a">Naturally occurring iron oxide nanoparticles: morphology, surface chemistry and environmental stability.</a> Journal of Materials Chemistry A. 1 (1), 27-42 (2013).</li>
<li>Hem, J. D., Cropper, W. H. <a target="_blank" href="https://pubs.usgs.gov/wsp/1459a/report.pdf">Chemistry of iron in natural water.</a> Report US Geological Survey. , 1-31 (1962).</li>
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<li>Speretto, R. A., Ricachenevsky, F. K., Stein, R. J., de Abreu Waldow, V., Fett, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+stress+in+plants+Dealing+with+deprivation+and+overload%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Stress%22%5BJournal%5D)">Iron stress in plants Dealing with deprivation and overload.</a> Plant Stress. 4, 57-69 (2010).</li>
<li>Tautkus, S., Steponeniene, L., Kazlauskas, R. <a target="_blank" href="https://www.shd.org.rs/JSCS/Vol69/No5/V69-No5-10.pdf">Determination of iron in natural and mineral waters by flame atomic absorption spectrometry.</a> Journal of the Serbian Chemical Society. 69 (5), 393-402 (2006).</li>
<li>Braunschweig, J., Bosch, J., Heister, K., Kuebeck, C., Meckenstock, R. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reevaluation+of+colorimetric+iron+determination+methods+commonly+used+in+geomicrobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Reevaluation of colorimetric iron determination methods commonly used in geomicrobiology.</a> Journal of Microbiological Methods. 89 (1), 41-48 (2012).</li>
<li>PerkinElmer. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Atomic+Spectroscopy+-+Guide+to+Selecting+the+Appropriate+Technique+and+System%22">Atomic Spectroscopy - Guide to Selecting the Appropriate Technique and System</a>. 16, (2011).</li>
<li>Wachasunder, S. D., Nafade, A. <a target="_blank" href="https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/00207230108711348">Precision and accuracy control in the determination of heavy metals by atomic absorption spectrometry.</a> Science. 58, 517-528 (2001).</li>
<li>Woods, J. T., Mellon, M. G. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/i560096a013">Thiocyanate method for iron. A spectrophotometric study.</a> Industrial & Engineering Chemistry Analytical Edition. 13 (8), 551-554 (1941).</li>
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<li>de la Fuente, V., Rufo, L., Rodríguez, N., Franco, A., Amils, R. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11104-017-3251-8">Comparison of iron localization in wild plants and hydroponic cultures of Imperata cylindrica (L.) P. Beauv.</a> Plant Soil. 418 (1-2), 25-35 (2017).</li>
<li>Hsiao, P. Y., Cheng, C. P., Koh, K. W., Chan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+defensin+gene%2C+AtPDF1.1%2C+mediates+defence+against+Pectobacterium+carotovorum+subsp.+carotovorum+via+an+iron-withholding+defence+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis defensin gene, AtPDF1.1, mediates defence against Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum via an iron-withholding defence system.</a> Science Reports. 7 (1), 1-14 (2017).</li>
<li>Johnson, D. B., Kanao, T., Hedrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+transformations+of+iron+at+extremely+low+pH%3A+Fundamental+and+applied+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Redox transformations of iron at extremely low pH: Fundamental and applied aspects.</a> Frontiers in Microbiology. 3, 1-13 (2012).</li>
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<li>Hawkesworth, C. J., Kemp, A. I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+continental+crust%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evolution of the continental crust.</a> Nature. 443 (7113), (2006).</li>
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<li>Bewick, V., Cheek, L., Ball, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistics+review+7%3A+Correlation+and+regression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Statistics review 7: Correlation and regression.</a> Journal of Critical Care. 7 (6), 451-459 (2003).</li>
<li>Asuero, A. G., Sayago, A., González, A. G. <a target="_blank" href="https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/10408340500526766">The correlation coefficient: An overview.</a> Critical Reviews in Analytical Chemistry. 36 (1), 41-59 (2006).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Analytical Chemistry. Calibration Curves. , Journal of Visualized Experiments. Cambridge, MA. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/10188/calibration-curves">https://www.jove.com/science-education/10188/calibration-curves</a> (2018).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

测定植物组织中的铁含量对于评估灌溉或其他环境条件的影响非常重要。本文介绍了一种简便且准确的比色法，用于检测烟草叶片中的铁（Fe）含量，该方法可轻松适用于其他植物种类和组织。
在优化比色法的实验条件时，我们采用低pH环境（pH &#60; 1.0）以确保铁的溶解性。燃烧过程的目的是释放样品中所有形态的铁，并确保样品中可能存在的任何污染物不会影响实验结果。关于铁污染问题，应注意到地壳中有6.7%由氧化铁类物质（FeOn）组成21，其在植物干重中的含量可达0.009%22。因此，必须考虑污染风险，因为灰尘中的铁含量可能高达3-7%（依地区而异）23，会对结果产生显著影响。此外，必须仔细核查实验中使用的所有设备的铁含量，并采取一切必要预防措施以避免污染。建议使用4% HCl溶液清洗所有曾暴露于空气或需重复使用的实验器材。应完全避免使用任何金属工具（如剪刀或勺子），而改用玻璃或塑料制品。例如，在步骤3.1和4.1中已特别强调了防...

铁（Fe）是所有生物体中一种重要的微量元素。在植物中，由于铁参与呼吸作用、光合作用和叶绿素生物合成等基本生理过程，因此是一种必需的微量元素1。游离铁离子的过度积累会对植物细胞造成伤害，因其可引发产生自由基的反应，导致氧化应激。为维持植物细胞内的铁稳态，铁离子被储存于液泡中，并被隔离在铁蛋白（ferritin）内；铁蛋白是一种直接参与铁稳态调控的蛋白质笼状结构，也是所有生物体中铁的主要储存形式2。与此同时，缺铁性贫血影响着大量人群，导致人们对植物铁生物强化的需求日益增加。由于植物铁蛋白具有独特的性质，利用铁蛋白结合铁进行食品强化，为解决这一营养不良问题提供了有前景的策略3。
铁离子主要以两种氧化态存在，即亚铁（二价 Fe2+ 或铁(II)）和高铁（三价 Fe3+ 或铁(III)）形式。细胞中还存在其他多种铁的形式，例如铁簇4。在生理条件下，铁以氧化铁的形式在细胞内储存，并自然形成赤铁矿（Fe2O3）和针铁矿（(Fe3+)2O3•0.5H2O）5。这些反应生成的氢氧化物，尤其是三价铁形式，溶解度极低。因此，铁的保留受溶液 pH 值的影响，在 pH 值高于 5 时主要呈固态6。
鉴于铁（Fe）的溶解性差且反应活性高，其在植物组织和器官间的转运必须依赖合适的螯合分子。此外，还需调控其亚铁（Fe²⁺）与高铁（Fe³⁺）形态之间的氧化还原状态1。在叶片中，约80%的铁存在于光合作用细胞中，因其在电子传递系统、细胞色素、叶绿素及其他血红素分子的生物合成，以及铁硫簇（Fe-S clusters）的形成过程中具有关键作用7。当细胞内铁含量过高时，多余的铁会被转运至液泡，并在其中以铁蛋白（ferritin）分子的形式储存8。
植物组织中的铁含量可通过多种方法测定，包括火焰原子吸收光谱法9（FAAS）或比色测定法10，其中前者的精确度远高于后者。FAAS 是一种高度准确的技术，能够基于各元素的电磁辐射来确定样品的元素组成。FAAS 通过火焰加热将样品中的金属离子转化为原子态，使离子激发并在特定离子返回基态时发射特定波长的光。不同离子发出的光由单色器分离，并由吸收传感器检测11。因此，FAAS 可用于直接定量铁浓度。然而，也存在其他用于在生物组织中可视化铁的技术。电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）12 是一种测定铁及其他微量元素的非常精确的方法，但 FAAS 和 ICP-MS 所需设备的缺乏是一个常见问题。另一方面，硫氰酸盐比色法测定铁13 精确度较低，难以检测样品间微小的差异。普鲁士蓝染色法14,15,16,17 是一种间接方法，基于亚铁氰化钾（K4Fe(CN)6）与 Fe 阳离子的反应，产生强烈的蓝色，用于动物和植物组织切片中铁的定性检测。
金属态（零价）铁在岩石圈中较为罕见。环境中游离态铁离子的主要存在形式通常由周围环境中的氧气含量决定：在缺氧环境中，亚铁离子相对更丰富；而在有氧环境中，则以三价铁离子为主。尽管在强酸性环境中三价铁同样占主导地位，但导致亚铁氧化的诱因在缺氧与酸性环境之间往往有所不同18。当铁在有氧条件下溶于4% HCl（pH 0）时，稀释后的铁主要以三价铁（Fe3+）形式存在19,20。
Fe离子与K4Fe(CN)6之间的反应如下：
Fe3+：FeCl3 + K4Fe(CN)6 = KFe(III)Fe(II)(CN)6¯ + 3KCl
Fe2+：4 FeCl2 + 2 K4Fe(CN)6 = Fe4(Fe(CN)6)2 + 8 KCl
在本研究中，我们探讨了普鲁士蓝染色法是否可用于测定溶液中的铁含量。
首先，我们验证了水溶液中 Fe 浓度与普鲁士蓝染色之间的相关性。通过原子光谱法以及加入普鲁士蓝后测定吸光度（OD），分别测量了水溶液中 Fe（以 FeCl2、FeCl3 或两者 1:1 混合物形式）的浓度。图 1展示了每种方法所获得测量值的线性回归曲线。我们得出结论：普鲁士蓝法可用于溶液中铁浓度的定量分析。
<img alt="Fe离子的吸光度与浓度关系图；光学密度（OD）线性校准曲线。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57408/57408fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：通过火焰原子吸收光谱法（FAAS）测定的铁浓度与普鲁士蓝法测得的光吸收值（OD，715 nm）之间的线性回归关系。 蓝色方块及对应直线代表 Fe2+ 溶液，红色方块及直线代表 Fe3+ 溶液，黑色方块及直线代表 Fe2+ 与 Fe3+ 的1:1混合溶液。获得的回归方程如下：[Fe2+] = 3 + 123 × OD，r = 0.996，R2 = 0.989；[Fe3+] = 1 + 292 × OD，r = 0.999，R2 = 0.997；以及 [Fe2+/3+] = 11 + 146 × OD，r = 0.983，R2 = 0.956。Fe2+ 来源于 FeCl2，Fe3+ 来源于 FeCl3。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57408/57408fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
为了将比色普鲁士蓝法应用于植物组织中铁含量的定量分析，通过火焰吸收原子光谱法和普鲁士蓝染色法测定了烟草叶片灰分中的铁含量。两种技术所得结果之间具有良好的相关性。

<table><tbody><tr><td>六氰合铁(II)酸钾</td><td>Fisher Chemical</td><td>14459-95-1</td><td>普鲁士蓝反应试剂</td></tr><tr><td>密理博注射器滤器单元，瓶口通气式，0.22 &amp;mu;m</td><td>Millec</td><td>SLGP033RS</td><td>用于过滤灰分与4% HCl溶液的混合物</td></tr><tr><td>闪烁计数瓶</td><td>Fisherbrand</td><td>03-337-4</td><td>在燃烧过程中用于盛装干燥的植物粉末材料</td></tr><tr><td>一次性注射器 10 ml</td><td>Medi-Plus</td><td>1931</td><td>过滤过程中使用的注射器</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>231-595-7</td><td>用于配制4% HCl溶液，以稀释灰分并清洗材料</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Tobacco, Nicotiana tabacum&lt;/em&gt; cv. Samsun NN</td><td>由Simon Barak教授提供，在Zaccai实验室中常规使用</td><td>Barak S, Nejidat A, Heimer Y, Volokita M. 烟草幼苗中乙醇酸氧化酶基因的转录及转录后调控. 植物分子生物学. 2001年3月1日;45(4):399-407.</td><td>本实验方案中使用的烟草品种</td></tr><tr><td>玻璃棉（矿棉）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>659997-17-3</td><td>用于样品在炉中燃烧的步骤</td></tr></tbody></table>

一种测定植物中铁含量的比色法

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

铁是生物体中最重要的微量元素之一，参与呼吸作用和光合作用等基本生理过程。所有生物体内的铁含量均较低，在植物中约占干重的0.009%。迄今为止，测定植物组织中铁浓度最准确的方法之一是火焰吸收原子光谱法。然而，该方法耗时较长、成本较高，且需要特定设备，而这些设备在大多数植物学实验室中并不常见。因此，亟需一种更简便且准确的方法，可用于常规检测。普鲁士蓝比色法通常用于动物和植物组织切片中铁的定性染色。在本研究中，我们对普鲁士蓝法进行了改进，使其适用于烟草叶片中铁含量的定量测定。我们通过原子光谱法和普鲁士蓝染色法对同一样品中的铁含量进行测定，以验证该方法的准确性，结果表明两种方法之间具有良好的线性回归关系（R2 = 0.988）。我们得出结论：普鲁士蓝法用于植物组织中铁的定量测定具有精确、简便和低成本的优点。然而，由于样品与试剂之间可能存在物种特异性的相互作用，本文建立的线性回归关系可能不适用于其他植物种类。因此，针对不同植物物种需分别建立相应的回归曲线。

若正确执行本方案，亚铁氰化钾法与原子光谱法所得结果之间应具有良好的相关性。因此，亚铁氰化钾法可简便地用于准确测定植物样品中的铁浓度，如下述实验所示。
烟草植株按所述方案培养，并用含有不同铁浓度（0、1、2、3、4、5 或 6 mM）的水灌溉，持续 7 天。随后收获植株，清洗后于 3 天内干燥 80 °C. 接下来的步骤（即， 按照方案第2.3步所述进行操作。由于对照管的灰重差异小于1%，该数值未纳入后续计算。
采用火焰原子吸收光谱法（FAAS）测定铁浓度。表1展示了这些测量的代表性结果。根据21个样品（7个浓度，每个浓度3个重复）获得的数据绘制了标准曲线。
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我们介绍一种利用比色普鲁士蓝法测定植物组织中铁含量的简单且可靠的实验方案。

铁是生物体中最重要的微量元素之一，参与呼吸作用和光合作用等基本生理过程。铁含量……

从医学角度来看，该技术有助于回答生物学领域的一个关键问题，例如，如何简便地定量生物核心样本中的铁含量。该方法的主要优势在于其制备简便，且是一种非常精确的比色技术。尽管推荐使用该技术，但应避免铁污染。本方法的可视化演示将有助于理解其各个步骤。开始该操作时，使用标准育苗基质填充5厘米×5厘米的花盆。每个花盆中播种一粒烟草种子。将植株转移至温度恒定的生长室中，在23摄氏度的长日照条件下培养。用自来水浇灌，直至水从花盆底部流出，持续培养植株约50天。此后，开始在灌溉液中加入铁剂，浓度应根据实验要求确定。每隔两天用该溶液灌溉植株一次，持续六至八天。然后用手将叶片从茎上剥离，注意不要使用任何金属器械。使用装有双蒸水的喷雾瓶清洁每一片叶片。将叶片放在纸巾上晾干，然后转移至纸袋中。将装有叶片的纸袋放入烘箱，在80摄氏度的恒温条件下干燥两到三天。用4%盐酸溶液将研钵和研杵清洗两次，并用滤纸擦干。使用研钵和研杵将干燥的叶片研磨成粉末。然后，将粉末转移至无菌的15毫升塑料管中。首先，称量一个未开封的20毫升闪烁瓶（不带盖子）的重量。记录该重量，或对天平进行去皮归零。然后加入研碎的叶片。将样品放入小瓶中称重，并记录重量。使用石棉绒封住小瓶。称量三个未添加样品的额外小瓶，用作对照，并记录每个小瓶的重量。随后，将样品小瓶和对照小瓶转移至炉中，按照文本方案中所述步骤灼烧叶片。此后，让样品冷却至约 100 摄氏度。使用厚手套和镊子将样品从炉中取出，注意仅握住小瓶的外壁。将小瓶放置在平坦的表面上。移除岩棉，并用原始瓶盖盖紧小瓶。然后称量三个对照小瓶，计算其平均增重。如果增重等于或超过灰重的1%，则将此值用作测量误差的估计值。称量一个15毫升的塑料管。记录其重量或对天平去皮归零。然后将灰分转移至该管中。记录该数值，即为灰分重量。接着，向灰分中加入5毫升1摩尔/升的盐酸溶液。用22微米滤膜过滤灰分。然后通过同一滤器再加入五毫升 1 摩尔盐酸溶液，使最终样品体积达到 10 毫升。此后，从每个样品中取出四毫升，用于原子光谱法测定。并按照文本方案中所述方法，确定每克灰分中的铁浓度。首先，将四克亚铁氰化钾加入100毫升双蒸水中，配制普鲁士蓝溶液。涡旋混匀后，于4摄氏度保存备用。使用前，取50毫升普鲁士蓝溶液与50毫升1摩尔盐酸混合，作为空白溶液。然后，用移液器将0.5毫升先前获得的样品与0.5毫升普鲁士蓝溶液混合。让该混合物静置至少1分钟，但不超过5分钟。将此混合物转移至比色皿中，并使用分光光度计在715纳米处测量其光密度。然后，测定每克灰分的光密度，并根据文本方案中所述，绘制铁浓度之间的线性回归曲线。21个烟草叶片样品的代表性结果表明，灌溉水中铁浓度显著影响叶片中的铁含量。随后，采用普鲁士蓝法检测所有21个代表性样品的光谱。如图所示，在测量含有不同浓度二价铁和三价铁的溶液时，715 纳米处的吸光度为最佳波长。通过将原子光谱法测得的铁浓度值与普鲁士蓝法测得的吸光度值进行作图，可获得一条线性回归曲线，从而用于分析同种植物类型的新的样品。请务必注意，使用 HCl 具有极高的危险性。进行此操作时，应始终采取预防措施，例如佩戴护目镜。在线性回归分析中，重要的是要确认结果处于合理范围内。该技术开发完成后，可帮助生物研究人员探索更多可用于食物生产或生物修复的植物。

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生物化学

测定植物铁含量的比色法

在本视频中，我们介绍一种基于比色法测定小鼠肝组织中非血红素铁含量的方法。在还原剂存在下，以邻菲啰啉磺酸钠作为显色底物，可将三价铁还原为可螯合的二价铁。...

基于浴酚蒽啉磺酸盐的比色法检测：一种简单快速测定小鼠肝组织中非血红素铁含量的方法

本视频展示了一种用于评估复杂食物来源中铁生物利用度的体外技术。该技术结合了人体消化过程的模拟与分化后的Caco-2细胞对铁的吸收。细胞内铁蛋白的形成作为细胞摄取铁的标志物。...

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植物组织中非结构性碳水化合物的比色定量测定

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模拟富铁(II)前寒武纪海洋上升流系统以探究光合细菌的生长

该铁氧化还原形态分析方法基于毛细管电泳-电感耦合等离子体质谱，结合样品堆积技术和单次运行中的快速分析。该方法可快速分析多种组织和生物流体样品中的铁氧化还原形态，并提供较低的定量限。...

毛细管电泳-电感耦合等离子体质谱联用（CE-ICP-MS）系统构建用于铁氧化还原形态（Fe(II)、Fe(III)）的定量分析

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定量测定小鼠胎盘中的铁转运 在体 内 使用非放射性铁同位素

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基于浴铜灵的比色法测定组织非血红素铁含量

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测定食物铁生物利用度的Caco-2细胞生物测定法

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一种可量化且低成本的无细胞荧光方法，用于验证新型化合物的铁螯合能力

本方案介绍了评估组织（尤其是脑组织）中铁沉积分布和含量的方法。方案详细说明了样本制备、普鲁士蓝/DAB染色、图像采集和数据分析的操作步骤。...

通过普鲁士蓝/DAB染色法评估5xFAD小鼠脑内铁沉积

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基于TD-DFT引导的先进E-Eye传感技术用于环境、生物及食品样品中Fe、Cr、F和As的现场定量检测

学习使用普鲁士蓝比色法测定植物组织中的铁含量。该方法操作简便、结果精确，适用于烟草等植物样本的铁定量分析，有助于研究植物营养状况。

一种测定植物中铁含量的比色法

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