单细胞测序拷贝数改变的检测

单细胞测序是一个日益流行的和可访问在高分辨率解决的基因组变化的工具。我们提供了一个使用单细胞测序，以确定在单个细胞拷贝数变化的协议。

该程序的总体目标是鉴定单个细胞中兆碱基规模的 DNA 拷贝数改变。为了对细胞群中的基因组异质性进行分类，有必要在单细胞分辨率下识别基因组变化。传统上，这是使用细胞学方法实现的，但是，这些方法的敏感性和特异性有限。

单细胞测序可以检测各种基因组变化，与以前的方法相比，其灵敏度和特异性更高，但前提是要仔细执行。在这里，我们描述了如何使用单细胞测序来可靠地检测单细胞中的兆碱基级拷贝数改变。要组装微型吸气器，首先从吸气器管组件上取下透明塑料端，然后将窄端插入内径为 3/16 英寸的一英尺长 PVC 管的一端。

将 0.2 微米针式过滤器的出口插入一英尺长、内径为 3/16 英寸的 PVC 管的另一端。然后将 0.2 微米针式过滤器的入口插入 6 英寸长、内径为 5/16 英寸的 PVC 管的一端。在 1 mL 刻度处折断 5 mL 塑料血清移液管，并将破损的一端插入内径为 5/16 英寸的 PVC 管的开口端。

接下来，将 5 毫升塑料血清移液管的出口插入抽吸管组件的柔性端，然后使用无菌塑料管盖住管组件的红色咬嘴进行储存。将玻璃毛细管的中间靠近火焰的位置，并在管的两端施加张力，将玻璃毛细管拉出内径为 10-30 微米。将拉出的管子分成两半，以产生两个潜在的抽吸针。

用几根试管重复此步骤，以确保准备足够的针头，具有适当的内径来挑选单个细胞。为了制备贴壁细胞，例如人成纤维细胞系，通过胰蛋白酶消化收获细胞，并将细胞转移到含有适当培养基的锥形管中。通过使用 10% 漂白剂喷洒到通风罩、移液器吸头盒和移液器吸头的表面，设置一个用于全基因组扩增的通风橱。

然后用纸巾将它们全部擦拭干净，然后用 70% 乙醇重复洗涤。将全基因组扩增 （WGA） 试剂盒中的 8 微升水添加到 96 孔 PCR 板的各个孔中。然后用 96 孔组织培养板的盖子盖住 96 孔 PCR 板，并将板放在冰上。

接下来，在 15 厘米培养皿中将 1， 000 个细胞加入 10 毫升培养基或 PBS 中，并将培养皿置于冰上以防止细胞粘附在培养皿上。然后，在冰上时，将培养皿和 96 孔 PCR 板中的细胞转移到具有 10 倍物镜的光学显微镜中。通过在坚硬的表面上轻轻敲击针头的伸出端，使吸头折断，从而增加抽吸针的开口。

然后将针头的宽端插入微型吸引器的透明端。接下来，将含有细胞的培养皿放在显微镜载物台上。将吸气器的红色咬嘴插入口中。

然后，当使用一只手移动抽吸针，另一只手移动培养皿时，识别要测序的单个细胞。使用口腔抽吸，将单个细胞与大约 1 到 2 微升的培养基或 PBS 一起吸入抽吸器针头中。将细胞转移到 96 孔 PCR 板的单孔中的 8 微升水中。

单细胞测序数据的质量和效用取决于每个细胞及其基因组的状态，因此在细胞制备和显微抽吸过程中要小心分离活细胞和非凋亡细胞。吸出每个细胞并将其转移到 PCR 板的孔中后，标记已接收细胞的孔。对所需的单元格数重复此作。

同时，从 Whole Genome Amplification 试剂盒中解冻 10X Single Cell Lysis Fragmentation Buffer。为防止全基因组扩增过程中的污染，请在组织培养罩内添加所有试剂。使用带过滤器的移液器吸头，并在孔之间更换移液器吸头。

对于每组最多 32 个细胞，将 32 μL 10X 单细胞裂解和片段化缓冲液和 2 μL 蛋白酶 K 溶液混合在微量离心管中，然后涡旋试管以混合内容物。向每个孔中加入 1 微升溶液，并上下移液以混合。盖上板并使用塑料薄膜密封所有孔。

然后在迷你板旋转器中短暂离心板。接下来，使用以下程序通过热循环仪运行板。然后将板放在冰上冷却，并短暂离心。

要从全基因组扩增试剂盒制备工作文库制备缓冲液，对于每个细胞，混合 2 μL 1X Single Cell Library Preparation Buffer 和 1 μL 文库稳定溶液。充分的细胞裂解和完整的基因组片段化对于最大限度地减少全基因组扩增过程中的偏差并确保制备高质量的测序文库至关重要。因此，请注意完全按照写入的方式执行这些步骤。

从培养皿中取出塑料薄膜，向每个孔中加入 3 微升溶液。上下移液管孔中的内容物以混合，然后更换塑料薄膜。短暂旋转板后，将细胞在 95 摄氏度下孵育 2 分钟，然后在冰上冷却板，然后再次短暂离心板。

现在，去除塑料膜，向每个孔中加入 1 微升文库制备酶，并上下移液管孔中的内容物以混合，然后更换塑料膜。短暂旋转板后，将其放入热循环仪中并运行以下程序。冷却板并短暂离心后，通过为每个细胞混合 48.5 μL 水、7.5 μL 10X 扩增预混液和 5 μL WGA DNA 聚合酶，从全基因组扩增试剂盒中制备有效的扩增混合物。

将工作混合物放在冰上。从板上取下塑料薄膜。向每个孔中加入 61 微升工作扩增混合物，并上下移液每个孔的内容物以混合，然后更换塑料薄膜。

按如下方式短暂离心板和热循环。根据文本协议对样品进行测序并进行数据分析。如图所示，如果全基因组扩增成功，样品将在琼脂糖凝胶上显示为弥散条带。

微弱或不存在弥散条带表明扩增反应失败，不应对样品进行测序。如图所示，在片段分析仪上使用毛细管电泳对片段大小进行分析。成功制备的文库将具有相当均匀的片段大小分布，从 150 到 900 个碱基对。

文库制备失败将导致片段大小分布偏斜，因此不应对此类文库进行排序。使用隐马尔可夫模型和循环二元分割，将每个细胞的基因组解析为估计拷贝数的片段。该表显示了单个细胞的重叠结果，并揭示了 10 号染色体上从 67 兆碱基增加到 130 兆碱基，19 号染色体上从 0 兆碱基增加到 20 兆碱基。

单细胞的分离和全基因组扩增可以而且应该在一天内进行。然后可以按灵活的时间表进行测序文库的制备、全基因组测序和数据分析。当正确进行细胞分离和全基因组扩增，并按照所述严格进行数据分析时，可以高灵敏度和特异性地检测到超过 5 兆碱基的拷贝数改变。

虽然我们的方案特别描述了使用单细胞测序来检测拷贝数改变，但该方案的各个方面，如单细胞分离和文库制备，可以应用于检测其他基因组变化。