使用单细胞测序检测拷贝数变异

本实验的总体目标是鉴定单个细胞中兆碱基规模的DNA拷贝数变异。为了对细胞群体中的基因组异质性进行分类，必须在单细胞分辨率下识别基因组变化。传统上，这一目标通过细胞学方法实现，但这些方法在灵敏度和特异性方面存在局限性。

单细胞测序能够检测多种基因组变异，其灵敏度和特异性较以往方法显著提高，但前提是必须经过严谨的操作。本文介绍了如何利用单细胞测序技术可靠地检测单个细胞中兆碱基规模的拷贝数变异。组装微型吸管装置时，首先从吸管组件上取下透明塑料端，然后将细端插入一段长度为一英尺、内径为3/16英寸的PVC管的一端。

将内径为3/16英寸、长一英尺的PVC管的一端连接至0.2微米注射式滤器的出口端。然后将该0.2微米注射式滤器的入口端插入一段内径为5/16英寸、长六英寸的PVC管的一端。取一支5毫升塑料刻度移液管，在1毫升刻度处折断，将折断的一端插入内径为5/16英寸的PVC管的开口端。

接下来，将5毫升塑料刻度移液管的出口端插入吸管装置的柔性末端，然后使用无菌塑料管覆盖该装置红色吸嘴部分以供储存。将玻璃毛细管的中部置于火焰附近，并在管的两端施加张力，将其拉制成内径为10–30微米的细管。将拉细的毛细管折断为两段，以制成两根潜在的吸管针头。

重复此步骤，使用多个试管，以确保制备出足够数量且具有合适内径的毛细管，用于挑选单个细胞。对于贴壁细胞（如人成纤维细胞系）的准备，通过胰酶消化法收集细胞，并将细胞转移至含有适当培养基的锥形管中。为进行全基因组扩增，使用10%次氯酸钠溶液喷洒超净台表面、移液器吸头盒及移液器吸头，对操作环境进行消毒处理。

然后用纸巾将它们全部擦拭干净，再用70%乙醇重复洗涤。从全基因组扩增（WGA）试剂盒中取八微升水，分别加入96孔PCR板的各个孔中。然后用96孔细胞培养板的盖子盖住96孔PCR板，并将该板置于冰上。

接着，将1,000个细胞加入含有10毫升培养基或PBS的15厘米培养皿中，并将培养皿置于冰上，以防止细胞贴壁。然后，仍在冰上操作，将培养皿中的细胞和96孔PCR板转移至配备10倍物镜的倒置显微镜下。通过轻轻敲击拉细的针头末端于硬物表面，使针尖断裂，从而增大吸管针头的开口。

然后将针头的宽端插入微量移液器的透明端。接着，将含有细胞的培养皿放置在显微镜载物台上。将移液器的红色吹嘴放入口中。

然后，用一只手移动移液针，另一只手移动培养皿，识别出需要进行测序的单个细胞。通过嘴部吸力，将单个细胞连同约一到两微升的培养基或PBS吸入移液针中。将该细胞转移至96孔PCR板中某一孔内的八微升水中。

单细胞测序数据的质量和实用性取决于每个细胞及其基因组的状态，因此在细胞制备和显微吸样过程中需格外小心，以分离出具有活性且未发生凋亡的细胞。在吸取每个细胞并将其转移至PCR板的孔中后，标记已接收细胞的孔。对所需数量的细胞重复此操作。

同时，从全基因组扩增试剂盒中解冻10X单细胞裂解与片段化缓冲液。为防止全基因组扩增过程中发生污染，所有试剂均应在组织培养罩内添加。使用带滤芯的移液器吸头，并在不同孔之间更换移液器吸头。

对于每组最多32个细胞，在微量离心管中加入32微升10X单细胞裂解与片段化缓冲液和2微升蛋白酶K溶液，然后涡旋振荡管子以混匀内容物。向每个孔中加入1微升该溶液，并用移液器吹打混匀。盖上板子，并用塑料封膜密封所有孔。

然后将酶标板在小型板式离心机中短暂离心。接着，将酶标板放入热循环仪中，运行以下程序。之后将酶标板置于冰上冷却，并短暂离心。

从全基因组扩增试剂盒中配制工作用文库制备缓冲液溶液时，针对每个细胞，将两微升（2 µL）1X 单细胞文库制备缓冲液与一微升（1 µL）文库稳定化溶液混合。充分的细胞裂解和完整的基因组片段化对于在全基因组扩增过程中最大限度减少偏差并确保制备高质量测序文库至关重要。因此，请务必严格按照所述步骤操作。

从培养皿上取下塑料膜，向每个孔中加入三微升溶液。用移液器将孔内液体上下吹打混匀，然后重新盖上塑料膜。将培养板短暂离心后，在95摄氏度下孵育细胞2分钟，随后将培养板置于冰上冷却，并再次短暂离心。

现在，移去塑料封膜，向每个孔中加入1微升文库制备酶，用移液器吹打孔内液体上下混合，然后重新盖上塑料封膜。将板短暂离心后，放入热循环仪中，运行以下程序。程序结束后将板冷却并短暂离心，随后为每个细胞配制全基因组扩增试剂盒的工作液：将48.5微升水、7.5微升10X扩增主混合液和5微升WGA DNA聚合酶混合均匀。

将工作混合液置于冰上。移除培养板上的塑料封膜。向每孔中加入61 µL工作扩增混合液，用移液器将每孔中的液体上下吹打混匀，然后重新盖上塑料封膜。

短暂离心反应板，并按照如下条件进行热循环。根据文本方案对样品进行测序并开展数据分析。如本图所示，若全基因组扩增成功，样品在琼脂糖凝胶上将呈现为弥散条带。

微弱或无条带表明扩增反应失败，该样本不应进行测序。如图所示，使用片段分析仪上的毛细管电泳对片段大小进行分析。成功构建的文库在150至900个碱基对范围内应具有相对均匀的片段大小分布。

文库制备失败将导致片段大小分布偏移，此类文库不应进行测序。通过隐马尔可夫模型和循环二元分割法，将每个细胞的基因组解析为具有估计拷贝数的片段。该表格显示了单个细胞的重叠结果，揭示了10号染色体从67至130兆碱基区域的拷贝数增加，以及19号染色体从0至20兆碱基区域的拷贝数增加。

单细胞的分离与全基因组扩增可在同一天内完成，且应当在同一天内完成。测序文库的构建、全基因组测序及数据分析则可根据需要灵活安排时间。若单细胞分离与全基因组扩增操作得当，并严格按照所述方法进行数据分析，即可以高灵敏度和高特异性检测出长度超过五兆碱基的拷贝数变异。

尽管本实验方案专门描述了单细胞测序在检测拷贝数变异中的应用，但该方案中的某些步骤，例如单细胞分离和文库构建，也可用于检测其他基因组改变。