Name: 斑马鱼幼虫研究出血性脑卒中的病理后果 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: 了解利用斑马鱼幼虫研究出血性脑卒中病理后果的方法。通过荧光显微镜实时观察脑损伤、神经炎症和运动缺陷，为药物筛选提供临床前模型。

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我们感谢David Spiller博士以及曼彻斯特大学系统显微成像核心设施提供的仪器使用支持，感谢Richard Baines教授提供DanioVision设备，感谢Jack Rivers-Auty博士在统计分析方面的咨询。bbh品系由卡尔加里大学Sarah Child博士实验室的Nicole Munsie慷慨提供。我们还感谢Stephen Renshaw教授、Adam Hurlstone博士、Andrew Badrock博士和Helen Young博士提供的斑马鱼品系和实验设备。
本研究由NC3Rs（NC/N002598/1）、卒中协会（TSA LECT 2017/02）、ERA-NET NEURON（MR/M501803/1）和英国心脏基金会（FS/15/67/32038）提供资助。我们还特别感谢Natalie Kate Moss信托基金以及曼彻斯特大学生物、医学与健康学部持续提供的经济支持。

斑马鱼在曼彻斯特大学生物服务单元按照此前所述的标准条件进行饲养和维护21成年斑马鱼的饲养管理已获得曼彻斯特大学动物福利与伦理审查委员会批准。所有实验均依照英国政府内政部法规进行（许可证号：P132EB6D7）。
注意：本研究中使用的转基因品系包括巨噬细胞特异性谱系 mpeg1mCherry（由本实验室按先前所述方法构建）22），中性粒细胞特异性的 mpo:GFP23,红系特异性gata1dsRed24 和 泛素secAnnexinV-mVenus，一种细胞死亡报告分子（实验室重新衍生）25)野生型、nacre（mitfa）w2/w2) 和突变型（bbhm292）背景。 图1 显示实验时间线。
<img alt="发育时间线示意图；ATV 与 bbh 在斑马鱼中的阶段及神经炎症反应。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig1.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 1"> 
图 1：实验时间线示意图，用于表征脑损伤、运动功能及神经炎症反应的结果。ICH，脑内出血；bbh，bubblehead。该图已经许可，改编自 Crilly 等人20，遵循知识共享许可协议。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig1large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
1. 第0天：卵的产生与收集
<ol>
	<li>从由1条雄性与1-2条雌性成年斑马鱼在繁殖盒中自然交配产生的受精胚胎中收集胚胎。 
	注意：在阿托伐他汀实验方案中，可使用任何野生型或转基因品系的斑马鱼，但不同品系间的出血率略有差异。</li>
	<li>每培养皿中将100个胚胎置于标准E3胚胎培养液中，在28 °C条件下孵育，并根据标准指南进行胚胎发育分期26。</li>
	<li>受精后约6小时（hpf），使用巴斯德移液管从培养皿中移除死亡及未受精的胚胎。</li>
</ol>
2. 第1天：24 hpf时阿托伐他汀处理
<ol>
	<li>使用锋利的超薄解剖镊对胚胎进行去壳处理，以进行阿托伐他汀（atorvastatin）处理27。实验所需数量可根据实际情况调整。</li>
	<li>向两个洁净的培养皿中各加入 30 mL E3 胚胎培养基。每个培养皿用于盛放 100 个胚胎。 
	注意：若使用设计用于细胞培养的培养皿，此早期阶段的去壳斑马鱼胚胎常会粘附于皿底。为避免此现象，使用前需用洁净水彻底冲洗培养皿。</li>
	<li>从处理组培养皿中移除 60 µL 胚胎培养液，并加入 60 µL 0.5 mM 阿托伐他汀（ATV）。当原液浓度为 0.5 mM 时，上述稀释操作将获得 1 µM 的终浓度，可导致约 20% 的幼鱼无出血（ICH-），约 80% 的幼鱼出现出血（ICH+）。另一培养皿作为未处理对照组。 
	注意：阿托伐他汀用蒸馏水溶解（3 mg 溶于 10 mL）配制成 0.5 mM 储存液。需在室温避光条件下震荡孵育过夜，因溶解过程较慢，完全溶解可能需要长达 1 周时间。切勿使用 DMSO。溶液分装后于 -20°C 保存，避免反复冻融。</li>
	<li>使用巴斯德移液管，将 100 个胚胎连同尽可能少的液体转移至处理组培养皿中。</li>
	<li>将培养皿在 28 °C 条件下孵育。 
	注意：脑内出血（ICH）将在受精后 33 至 48 小时（hpf）之间发生。阿托伐他汀无需移除，因孵育时间超过 24 小时不会引起额外的发育问题。</li>
</ol>
3. 第2天：在50 hpf时分离ICH-和ICH+群体
<ol>
	<li>将 ICH+ 鱼与 ICH- 种群分离，并转移至新的培养皿中以便操作。
	<ol>
		<li>若使用浓度为 1 µM 的 ATV 模型，此时点将有 75–100% 的幼鱼出现出血（ICH+）。 
		注意：不同品系幼鱼的反应存在差异；若幼鱼出血频率未达预期，可尝试使用新批次的阿托伐他汀或提高药物浓度。若幼鱼在 48 hpf 时仍未出现出血，则视为 ICH-。</li>
		<li>若使用 bbh 模型，所有纯合突变体将在 48 hpf 前出现出血。若使用杂合子互交，则可将未出血的杂合子及野生型同胞作为实验对照动物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>如有必要，可通过向 E3 培养基中添加 0.02% MS222 对幼鱼进行麻醉。使用巴斯德吸管将头部有血液的幼鱼筛选至新鲜的 E3 培养基中。参见 图2。 
	注意：头部出血可能出现在前脑、中脑或后脑，或为多部位同时出血，且不同个体间的出血量可能存在差异。在 bbh 突变体中，颅内出血常伴随严重水肿，表现为头部较大、眼间距增宽以及出血区域更弥散。但并非所有 ICH+ 的 bbh 幼鱼均表现出水肿。</li>
</ol>
<img alt="斑马鱼显微镜图像；ICH- 与 ICH+；荧光显示内出血；研究分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig2.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2： ICH+ 脑出血表型。 在转基因 gata1:DsRed 报告基因的 nacre 背景下，通过明场体视显微镜（上图）和荧光成像（下图）在受精后约 48 小时观察到的幼鱼 ICH 表型示例。在 ICH- 幼鱼中未观察到出血现象（左图）。在 ICH+ 幼鱼中，前脑和后脑可见明显的红细胞积聚（箭头所示）（右图）。比例尺为 250 µm。本图经许可转载自 Crilly 等人20，采用 Creative Commons 许可协议。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig2large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
4. 第3天：72小时后细胞死亡与白细胞分析
<ol>
	<li>使用荧光显微镜筛选幼虫，以确认荧光蛋白的表达。 
	注意：在本研究中，转基因 泛素:secAnnexinV-mVenus 幼虫用于报告脑细胞死亡，双转基因 mpoGFPmpeg1:mCherry 或 泛素：secAnnexinV-mVenusmpeg1:mCherry 用于白细胞分析。</li>
	<li>用含有0.02% MS222的E3培养基填充光片显微镜成像室。</li>
	<li>使用0.02% MS222麻醉幼虫。将用于固定的幼虫（n = 1–6）转移至干燥的培养皿表面，置于单滴液滴中，并尽可能去除多余液体。 
	注意：1.5% 低熔点琼脂糖的制备方法为将 0.15 g 低熔点琼脂糖溶于 10 mL 不含亚甲蓝的 E3 培养基中，微波加热溶解后保持在 45 °C 直至使用。</li>
	<li>加入一滴1.5%低熔点琼脂糖（保持液态于 45 °C 热块）处理幼虫并使用 800 µm 上样毛细管，并将幼虫头部朝前吸入。若位置不准确，幼虫可从琼脂糖中推出后重新装样。待毛细管冷却后再插入光片成像室。 
	注意：也可使用共聚焦显微镜进行此操作。此时，应将幼虫侧向固定在玻璃底培养皿的琼脂糖中。</li>
	<li>在眼球晶状体之间（约300 µm）并处理为最大强度投影图像。
	<ol>
		<li>分析图像中脑区的荧光细胞总数及总荧光强度20.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>创建一个持续18-24小时的多投影复合图像延时视频，以追踪白细胞的移动及其与 dying cells 的相互作用。 
	注意：若进行长期活体成像，仅将一条幼虫置于毛细管中。</li>
	<li>成像完成后，将幼虫从固定毛细管中排出，置于致死剂量的4% MS222中以实施安乐死。</li>
</ol>
5. 第3天：在72 hpf时选择用于运动性检测的幼虫
<ol>
	<li>用0.02% MS222在培养皿中麻醉幼鱼。</li>
	<li>随机选取 n = 24 条幼鱼进行运动能力检测，转移至新鲜E3培养基中，使动物从麻醉状态恢复。 
	注意：此时使用麻醉可消除对游动缓慢个体（易于捕获）的选择偏差。</li>
</ol>
6. 第3-5天：在72、96和120小时后检测运动能力
<ol>
	<li>在72 hpf时将筛选出的幼鱼转移至不含亚甲蓝的E3培养基中。 
	注意：若在3 dpf进行检测，需让幼鱼有充足时间从麻醉状态中恢复（>1小时）。</li>
	<li>使用移液器将一条幼鱼接种至24孔板的每孔中，每孔1 mL。 
	注意：剪去移液器吸头末端以避免损伤幼鱼。可根据实验设计调整培养板规格。</li>
	<li>将培养板放入摄像室，使用白光惊吓程序诱导自发游泳，检测运动行为10分钟。 
	注意：游泳行为通过摄像室及追踪软件进行记录（参见材料表）。</li>
	<li>在96 hpf和120 hpf时使用同一批幼鱼重复实验。在检测间隔期间，将幼鱼从检测板的单个孔中转移至培养皿，并在28 °C条件下孵育。</li>
	<li>检测结束后，使用致死剂量的4% MS222对幼鱼实施安乐死。</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

本研究表明，斑马鱼幼鱼中的脑出血（ICH）会引发脑损伤反应，该反应重现了人类疾病的若干关键特征，并可进行系统性检测与定量分析。斑马鱼为自发性脑出血提供了稳定且可重复的模型，有助于未来针对血液诱导的脑损伤（而非预防血管破裂）的药物干预研究17,28。事实上，鉴于其疾病进展迅速，类似于临床实际情况，这一方法为未来成功的转化研究带来了令人期待的前景。
使用斑马鱼幼鱼存在一些局限性，例如涉及发育中的系统和分类学等级，但必须考虑该模型在实践和科学上的优势，以期为脑出血（ICH）研究提供新的见解。诱导出血或在损伤后长时间监测细胞过程均无需手术操作。斑马鱼配对繁殖具有高繁殖力，可获得易于获取的大样本量，且由于幼鱼发育迅速，实验周期显著短于啮齿类动物研究29,30。
目前，这些模型适用于阐明活体完整动物脑内自发性脑出血（ICH）所引发的即时病理学和免疫学反应。该模型有望被改进用于中高通量药物筛选，以开发预防或促进恢复的ICH治疗手段。因此，本研究中所呈现的脑出血后病理变化为临床前ICH研究提供了一种替代性且互补的研究平台。

脑内出血（ICH）是最严重的一种卒中亚型，由自发性脑血管破裂并出血至脑实质引起，可导致脑损伤、身体残疾，甚至死亡1。尽管ICH的死亡率和致残率很高2，但目前对其根本病因及出血后病理机制的理解仍十分有限。因此，尚无特异性治疗方法可用于预防ICH或改善患者预后。目前对疾病生物学的大部分认识主要来源于ICH的临床前啮齿类动物模型3，然而迄今为止，这些模型的研究尚未成功转化出任何有效的临床治疗手段4,5。这一失败部分原因可能在于这些临床前模型存在一些局限性，包括难以有效模拟人类疾病自发发生的特点，以及在哺乳动物中建立模型需要进行侵入性手术6。此外，啮齿类动物在完整组织中观察ICH后细胞反应快速发生的过程方面也存在实际困难。鉴于啮齿类模型的转化效果不佳，若要克服这些实际问题并有助于发现新的药物靶点，开发可自发发生ICH的替代模型势在必行。
血管发育的分子机制在包括斑马鱼（Danio rerio）在内的脊椎动物中高度保守7。因此，采用这一模式生物正日益成为研究脑血管疾病的有力机制策略8。目前已建立多种斑马鱼模型，可重现与中风相关疾病表型9,10,11,12。利用斑马鱼幼体研究疾病发病机制，相较于哺乳动物模型具有多方面的实践与科学优势8。这些优势包括高繁殖率、快速发育以及幼体透明性，使得无需侵入性操作即可实现活体成像，避免了啮齿类动物实验中的诸多限制。 将这些优势与斑马鱼研究领域内丰富的转基因报告品系相结合，形成了一种强大的体内研究疾病生物学的手段，而该方法尚未被用于研究脑出血（ICH）的病理后果。
脑内血液引发的损伤反应具有双相性13；原发性损伤导致神经元死亡和细胞坏死，进而引发由先天免疫激活介导的继发性损伤波。脑损伤的第二阶段，特别是神经炎症成分，被认为是未来药物治疗的可行靶点13。此前已有研究报道斑马鱼幼鱼中存在自发性且局限于脑部的出血现象14,15,16,17,18,19。其中两种模型分别为：在受精后24小时（hpf）使用阿托伐他汀（ATV）抑制HMGCR通路及胆固醇生物合成14；另一种为bubblehead（bbh）突变体，其在arhgef7基因（即βpix）上携带功能低下型突变，从而抑制血管内紧密连接所需的肌动蛋白重塑过程18。这些模型在血液循环开始时（约33 hpf）即出现局限于脑部的自发性血管破裂。&#160;近期，我们对这些模型进行了进一步表征，揭示了人类与斑马鱼幼鱼在脑损伤反应关键特征上的保守性20。本研究展示了在斑马鱼幼鱼中获取并可视化自发性脑出血所需的方法，以及如何量化与人类疾病状态相关的脑损伤、运动行为和神经炎症表型。这些数据和技术支持将该模式物种作为临床前脑出血（ICH）研究的重要补充体系。

<table><tbody><tr><td>24孔板</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3527</td><td></td></tr><tr><td>28 &amp;deg;C 培养箱</td><td>LMS</td><td>210</td><td></td></tr><tr><td>阿托伐他汀</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PZ0001-5mg</td><td></td></tr><tr><td>繁殖盒</td><td>Thoren Aquatics systems</td><td>10011</td><td></td></tr><tr><td>Daniovision 观察室</td><td>Noldus</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>E3 培养基 1x</td><td></td><td></td><td>4% Instant Ocean，1 L dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 中含 500 &amp;micro;L 亚甲蓝</td></tr><tr><td>EthoVision XT 软件</td><td>Noldus</td><td>版本 11</td><td></td></tr><tr><td>加热块</td><td>Grant-Bio</td><td>PHMT-PSC18</td><td></td></tr><tr><td>Instant ocean</td><td>Instant Ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>光片显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Z.1</td><td></td></tr><tr><td>光片显微镜样品固定毛细管</td><td>Zeiss</td><td>402100-9320-000</td><td></td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>Promega</td><td>V2111</td><td></td></tr><tr><td>亚甲蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319112-100ML</td><td></td></tr><tr><td>显微镜&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td>MZ95</td><td>解剖显微镜</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Leica</td><td>M165FC</td><td>荧光显微镜</td></tr><tr><td>MS222</td><td></td><td></td><td>4 g 三卡因粉末，500 mL dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，10 mL 1 M Tris（pH 9）。调节 pH 至约 7</td></tr><tr><td>P1000 移液器</td><td>Gilson</td><td>F144059M</td><td></td></tr><tr><td>P1000 移液器吸头</td><td>Starlab</td><td>S1122-1830</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德移液管</td><td>Starlab</td><td>E1414-0300</td><td></td></tr><tr><td>培养皿&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>101VR20</td><td></td></tr><tr><td>Pipetboy</td><td>Integra Biosciences</td><td>PIPETBOY</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 移液管</td><td>Corning</td><td>CLS3527</td><td></td></tr><tr><td>三卡因粉末</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>超细解剖镊</td><td>Agar scientific</td><td>AGT502</td><td></td></tr><tr><td>Zen 软件</td><td>Zeiss</td><td>版本 2.3</td><td></td></tr></tbody></table>

利用斑马鱼幼鱼研究出血性中风的病理后果

Using Zebrafish Larvae to Study the Pathological Consequences of Hemorrhagic Stroke

脑内出血（ICH）是卒中最严重的亚型，全球死亡率高，但目前尚无针对该病患者的特异性治疗方法。在临床前建立ICH模型已被证明十分困难，现有的啮齿类动物模型难以充分模拟人类ICH的自发性特征。因此，迫切需要开发替代性的临床前研究方法，以深入研究ICH的疾病机制，并推动潜在药物的发现。
斑马鱼的使用已成为转化研究中日益流行的方法，主要因其相较于哺乳动物疾病模型具有一系列优势，包括繁殖能力强以及幼体透明，便于进行活体成像。其他研究团队已证实，斑马鱼幼体在脑血管发育受到遗传或化学干扰后，可自发出现脑内出血（ICH）。本方法旨在利用此类模型研究脑出血的病理后果，服务于临床前脑内出血研究。通过活体成像和运动能力检测，可对脑出血后的脑损伤、神经炎症及运动功能进行评估与定量分析。
本研究表明，人类脑出血的关键病理后果在斑马鱼幼鱼中得以保留，凸显了该模式生物作为脑出血（ICH）临床前研究有价值的活体&#160;系统。本方法学的目的是使临床前卒中研究领域能够将斑马鱼幼鱼模型作为一种替代性且互补的模式系统，用于替代啮齿类动物模型。

利用转基因ubiq:secAnnexinV-mVenus评估脑细胞死亡，在ATV和bbh模型的ICH+幼鱼中均观察到清晰明确的死亡细胞簇，而所有ICH-幼鱼中均未见此类细胞簇（图3）。这些细胞簇在96 hpf之前逐渐减少。通过图像分析发现，出血与脑部荧光信号总强度显著增加两倍相关，表明存在明显的细胞死亡。
在ICH+幼鱼中，通过脑内mpeg1阳性巨噬细胞数量显著增加可识别出神经炎症反应。总的mpo阳性中性粒细胞数量也有所增加，但未达到统计学显著性（图4）。在ICH+幼鱼中，mpeg1阳性巨噬细胞的形态也发生改变，细胞呈现为活跃的、圆形的阿米巴样形态。这些活化的圆形细胞还可随时间进行监测，以显示ICH+幼鱼中表达ubiq:secAnnexinV-mVenus的凋亡细胞的吞噬反应增强（图5）。具有分支突起的mpeg1阳性巨噬细胞被归类为非活跃状态。
在bbh和ATV模型中，与ICH-同胞对照组相比，脑出血在72和96 hpf时均表现出运动能力显著下降（图6）。在120 hpf时，运动能力恢复至接近基线水平。不同卵块和品系之间的基线运动能力常存在差异，因此每次均应与ICH-对照组进行比较。
<img alt="斑马鱼脑中荧光显微镜图像及条形图显示脑内出血对YFP强度的影响。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：斑马鱼幼鱼中的脑内出血（ICH）导致可量化的脑损伤。（A）在72 hpf时，ICH+幼鱼（右侧面板）与ICH-同胞（左侧面板）脑损伤表型的代表性图像。明场图像（下方面板，比例尺 = 250 µm）显示ICH+幼鱼中存在脑出血（箭头）。通过荧光显微镜观察ubiq:secAnnexinV-mVenus报告基因系中的细胞死亡情况（上方面板，比例尺 = 100 µm）。在血肿周围区域观察到成簇的濒死细胞。图像被裁剪为仅包含脑区，并使用补充文件1中的宏程序分析直径大于30像素的圆形颗粒中的总绿色荧光强度（白色线条）。（B）通过ATV模型获得的未经处理、ICH-和ICH+幼鱼在72 hpf时脑部荧光信号的定量分析（每组n = 12；3次独立重复实验）。ICH+组与未经处理组（**p = 0.004）以及ICH-同胞组（*p = 0.03）相比，差异具有统计学意义。（C）通过bubblehead（bbh）模型获得的ICH-和ICH+幼鱼在72 hpf时脑部annexinV结合水平的荧光信号定量分析（每组n = 12；2次独立重复实验）。图表显示均值±标准差（SD）。ICH+与同龄ICH-同胞之间mVenus荧光强度差异显著（**p = 0.002）。本图经许可转载自Crilly等20，遵循Creative Commons许可协议。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="中性粒细胞和巨噬细胞计数；柱状图比较；脑出血条件分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 4"> 
图4： 脑出血（ICH）在斑马鱼幼体大脑中引发先天性细胞免疫反应。 在72 hpf时，对先前描述的mpo:GFP;mpeg1:dsRed双转基因幼鱼（每组n = 8；2次独立重复实验）脑区内的白细胞数量进行定量，结果显示脑出血（ICH）后巨噬细胞数量显著增加（*p = 0.01），而中性粒细胞数量无显著变化（p = 0.5）。该图经许可转载自Crilly等20，采用Creative Commons许可协议。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜，细胞形态变化，ICH-，ICH+，柱状图分析，实验结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 5"> 
图 5： 活化的巨噬细胞对脑损伤表现出吞噬反应。（A）代表性延时图像20显示分支状巡逻巨噬细胞向annexinV阳性细胞迁移的过程（i - vi）。图像系列使用20倍物镜对整个大脑成像获得。比例尺为50 µm。巨噬细胞在吞噬annexinV阳性细胞前转变为阿米巴样形态（v），随后完成吞噬（vi, vii）。吞噬完成后，巨噬细胞恢复分支状形态并迁移离开，annexinV阳性细胞则不再可见（viii）。图中已标注分支状巨噬细胞（#）、annexinV阳性细胞（箭头）和阿米巴样巨噬细胞（*）。（B）在ICH-和ICH+幼体大脑中，mpeg1-阳性细胞呈现阿米巴样和分支状形态的代表性图像。比例尺为50 µm。（C）与ICH-同胞相比，ICH+大脑中阿米巴样（吞噬性）巨噬细胞的比例增加，而分支状（非活性）巨噬细胞的比例减少。本图经许可转载自Crilly等20，采用Creative Commons许可协议。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="行为学分析、运动轨迹图和统计图突出显示了斑马鱼的运动情况。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59716/59716fig6.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 6"> 
图6： 颅内出血诱导的脑损伤导致斑马鱼幼体出现可量化的运动功能障碍。（A）72、96 和 120 hpf 时 ICH- 和 ICH+ bbh 幼体游泳轨迹的代表性示例。（B）在 72 和 96 hpf 时，ICH+ 幼体在 10 分钟记录期间的累计活动时间显著减少。在 120 hpf 时间点，显著性消失，可能提示脑损伤后的恢复（每组 n = 24 条幼体；3 次独立重复实验；****p = 0.00006；**p = 0.003；ns：p = 0.08）。（C）在 120 hpf 时对未经处理和 ATV 处理的 ICH- 与 ICH+ 幼体的累计运动时间进行量化。ICH+ 幼体在 10 分钟记录期间的累计活动时间显著减少。通过三次技术重复（每组 n = 24 条幼体）计算均值的标准差（***p = 0.00004，**p = 0.0003）。该图已获许可转载自 Crilly 等20，采用知识共享许可协议。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/59716fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
补充文件 1。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59716/Supplementary_File_1-Macro.docx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本文介绍了一种在斑马鱼幼鱼中定量评估脑出血后脑损伤、运动功能障碍和神经炎症的实验方案，该模型模拟人类脑内出血（ICH）的情况。

尽管脑出血是卒中最严重的亚型，且全球死亡率很高，但目前尚无针对脑出血患者的特异性治疗方法……

该方法为研究出血性卒中后血液进入脑内所引发的即时细胞反应提供了一种互补的临床前研究手段。出血性卒中是一种极为严重的疾病，目前尚无针对患者的特异性药物。与啮齿类动物模型不同，斑马鱼幼鱼具有透明特性，使我们能够利用荧光显微镜实时观察活体完整动物脑内的细胞反应。实验开始时，使用茶筛从繁殖盒中收集由一只雄性成年斑马鱼与一至两只雌性成年斑马鱼自然交配所产生的全部受精胚胎。将100个胚胎转移至每个含有标准E3胚胎培养基的培养皿中。在28°C下孵育，并根据标准指南进行胚胎发育分期。受精后六小时，使用巴斯德吸管从培养皿中移除死亡和未受精的胚胎，并将培养皿放回孵育箱中。受精后24小时，在明场体视显微镜下，使用锋利的超细解剖镊去除胚胎的卵膜，用于阿托伐他汀处理。然后将30毫升E3胚胎培养基加入两个干净的培养皿中，一个用于处理组，另一个作为对照组。从处理组培养皿中移除60微升胚胎培养液，并加入60微升0.5毫摩尔的阿托伐他汀，以达到80%的幼鱼出血率。使用巴斯德移液管将100个胚胎尽可能少地带水转移至每个培养皿中。将两个培养皿在28°C条件下孵育。受精后50小时或之后的任意时间，在显微镜下使用巴斯德移液管小心地将出血的鱼与未出血的群体分离，并将幼鱼转移至含有新鲜E3培养基的新培养皿中。为了更方便地分离出血阳性的幼鱼，可以使用无色素的斑马鱼或在红细胞中表达荧光蛋白的斑马鱼。在第三天，利用荧光显微镜筛选幼鱼，以确认荧光蛋白的表达。随后，在光片显微镜样品腔中加入含有0.2% MS-222的E3培养基，用于麻醉幼鱼。使用巴斯德移液管，将含有1至6条幼虫的单个液滴转移至干燥的培养皿表面以进行固定。用移液管尽可能吸除多余液体。从45摄氏度的加热块中取一滴1.5%低熔点琼脂糖加入幼虫中，并使用800微米的固定毛细管将幼虫头部朝前吸入。 如果定位不准确，将幼虫从琼脂糖中推出并重新安装。让毛细管冷却，然后插入光片成像室。在 ZEN 成像软件中，按下连续采集以调整幼虫方向，然后按下采集以获取眼晶状体之间头部的 z 层扫描图像。在处理选项卡中，从每个z轴层叠图像生成最大强度投影图像。为了随机选择进行运动性检测，将24条麻醉后的幼鱼转移至新鲜的E3培养基中，并让动物从麻醉状态恢复。在幼鱼完全恢复麻醉后，使用末端切开的移液管将恢复的幼鱼转移至不含亚甲蓝的E3培养基中。在24孔板的每个孔中加入一毫升，接种一只幼虫。将该板放入摄像机腔室。在EthoVision XT追踪软件中，调整实验设置，建立白光惊吓程序，以增强幼虫的自发游泳，并检测其10分钟内的运动情况。在受精后96小时和120小时重复进行运动能力检测。利用转基因泛素分泌型Annexin V M静脉报告基因品系评估脑细胞死亡，结果显示，在出血的幼鱼中可观察到明确清晰的死亡细胞簇，而在所有未出血的幼鱼中均未发现此类现象，以上结果通过绿色荧光显示。在阿托伐他汀模型和bubble head模型的出血幼鱼中均观察到死亡细胞。在脑内出血阳性幼鱼中，MPEG1阳性巨噬细胞的形态发生变化，细胞呈现为不活跃的圆形阿米巴样形态。通过随时间监测这些活化的圆形细胞，发现其吞噬反应增强，表现为泛素分泌的Annexin V M静脉表达的凋亡细胞在脑内出血阳性幼鱼中被大量吞噬。与无脑内出血的同胞对照组相比，脑出血与受精后72小时和96小时的运动能力显著下降相关。受精后120小时，运动能力恢复至接近基线水平。该实验步骤中最关键的部分是在进行表型分析检测之前，必须彻底检查幼鱼是否存在脑出血。该模型还可用于药物筛选，以确定出血后是否能够改善表型严重程度，这一方法可能有助于我们未来发现新的候选药物。该技术使我们能够在脑出血后立即探究细胞反应，这一时间点此前一直极难研究。尽管本方案中描述的试剂或仪器均无特殊危险性，但在使用化学品、锐器或激光时，必须始终采取标准的防护措施和注意事项。

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