利用斑马鱼幼鱼研究出血性中风的病理后果

该方法为研究出血性卒中后血液进入脑内所引发的即时细胞反应提供了一种互补的临床前研究手段。出血性卒中是一种极为严重的疾病，目前尚无针对患者的特异性药物。与啮齿类动物模型不同，斑马鱼幼鱼具有透明特性，使我们能够利用荧光显微镜实时观察活体完整动物脑内的细胞反应。实验开始时，使用茶筛从繁殖盒中收集由一只雄性成年斑马鱼与一至两只雌性成年斑马鱼自然交配所产生的全部受精胚胎。

将100个胚胎转移至每个含有标准E3胚胎培养基的培养皿中。在28°C下孵育，并根据标准指南进行胚胎发育分期。受精后六小时，使用巴斯德吸管从培养皿中移除死亡和未受精的胚胎，并将培养皿放回孵育箱中。

受精后24小时，在明场体视显微镜下，使用锋利的超细解剖镊去除胚胎的卵膜，用于阿托伐他汀处理。然后将30毫升E3胚胎培养基加入两个干净的培养皿中，一个用于处理组，另一个作为对照组。从处理组培养皿中移除60微升胚胎培养液，并加入60微升0.5毫摩尔的阿托伐他汀，以达到80%的幼鱼出血率。

使用巴斯德移液管将100个胚胎尽可能少地带水转移至每个培养皿中。将两个培养皿在28°C条件下孵育。受精后50小时或之后的任意时间，在显微镜下使用巴斯德移液管小心地将出血的鱼与未出血的群体分离，并将幼鱼转移至含有新鲜E3培养基的新培养皿中。

为了更方便地分离出血阳性的幼鱼，可以使用无色素的斑马鱼或在红细胞中表达荧光蛋白的斑马鱼。在第三天，利用荧光显微镜筛选幼鱼，以确认荧光蛋白的表达。随后，在光片显微镜样品腔中加入含有0.2% MS-222的E3培养基，用于麻醉幼鱼。

使用巴斯德移液管，将含有1至6条幼虫的单个液滴转移至干燥的培养皿表面以进行固定。用移液管尽可能吸除多余液体。从45摄氏度的加热块中取一滴1.5%低熔点琼脂糖加入幼虫中，并使用800微米的固定毛细管将幼虫头部朝前吸入。

如果定位不准确，将幼虫从琼脂糖中推出并重新安装。让毛细管冷却，然后插入光片成像室。在 ZEN 成像软件中，按下连续采集以调整幼虫方向，然后按下采集以获取眼晶状体之间头部的 z 层扫描图像。

在处理选项卡中，从每个z轴层叠图像生成最大强度投影图像。为了随机选择进行运动性检测，将24条麻醉后的幼鱼转移至新鲜的E3培养基中，并让动物从麻醉状态恢复。在幼鱼完全恢复麻醉后，使用末端切开的移液管将恢复的幼鱼转移至不含亚甲蓝的E3培养基中。

在24孔板的每个孔中加入一毫升，接种一只幼虫。将该板放入摄像机腔室。在EthoVision XT追踪软件中，调整实验设置，建立白光惊吓程序，以增强幼虫的自发游泳，并检测其10分钟内的运动情况。

在受精后96小时和120小时重复进行运动能力检测。利用转基因泛素分泌型Annexin V M静脉报告基因品系评估脑细胞死亡，结果显示，在出血的幼鱼中可观察到明确清晰的死亡细胞簇，而在所有未出血的幼鱼中均未发现此类现象，以上结果通过绿色荧光显示。在阿托伐他汀模型和bubble head模型的出血幼鱼中均观察到死亡细胞。

在脑内出血阳性幼鱼中，MPEG1阳性巨噬细胞的形态发生变化，细胞呈现为不活跃的圆形阿米巴样形态。通过随时间监测这些活化的圆形细胞，发现其吞噬反应增强，表现为泛素分泌的Annexin V M静脉表达的凋亡细胞在脑内出血阳性幼鱼中被大量吞噬。与无脑内出血的同胞对照组相比，脑出血与受精后72小时和96小时的运动能力显著下降相关。

受精后120小时，运动能力恢复至接近基线水平。该实验步骤中最关键的部分是在进行表型分析检测之前，必须彻底检查幼鱼是否存在脑出血。该模型还可用于药物筛选，以确定出血后是否能够改善表型严重程度，这一方法可能有助于我们未来发现新的候选药物。

该技术使我们能够在脑出血后立即探究细胞反应，这一时间点此前一直极难研究。尽管本方案中描述的试剂或仪器均无特殊危险性，但在使用化学品、锐器或激光时，必须始终采取标准的防护措施和注意事项。