一种用于分离、测序微小RNA并利用开源工具进行分析的完整流程

我们开发了一种明确、可重复且经过长期验证的小RNA测序方案，并利用开源生物信息学工具对标准化的测序读段进行分析。本策略的主要优势在于，可通过凝胶纯化精确收集微小RNA（miRNA），且该生物信息学分析方法适用于任何微小RNA的收集方式。对微小RNA进行高通量测序有助于揭示疾病机制、微小RNA的加工过程，以及递送小RNA的基因治疗策略的精确定量评估。

务必在无 RNase 的环境中操作，并在整个实验过程中将所有 RNA 产物置于冰上。通过可视化凝胶切割步骤，有助于观察者确定下游应用所需的正确产物大小。进行 3' 末端接头连接时，将 11 微升 RNA 与 1.5 微升无 ATP 的 10X T4 RNA 连接酶反应缓冲液、1 微升聚乙二醇以及 0.5 微升 3' 接头混合。

将样品在热循环仪中于 95 摄氏度加热 30 至 40 秒，随后在冰上冷却 1 分钟。加入 1 微升 T4RNA 连接酶 2，在室温下孵育反应体系 2 小时。在样品孵育的同时，将 15% 聚丙烯酰胺凝胶倒入塑料模具中两块相距 0.8 毫米的玻璃板之间，并插入梳子。

待凝胶完全凝固后，向电泳槽中加入 0.5 5X TBE 缓冲液，并用移液器剧烈吹打以冲洗掉残留的尿素。将聚丙烯酰胺凝胶在 375 伏电压下预电泳 25 分钟后，上样时每个样品之间至少留出一个泳道的间隔。以不对称模式加载至少两组 20 微升的分子量标记物，以便追踪凝胶的方向，并在恒定 375 伏电压下进行电泳。

15分钟后，将电压升至恒定的425伏，并继续电泳约两小时。电泳结束后，使用玻璃板分离器将凝胶从玻璃板上取下，并将凝胶置于塑料文件保护袋上。将5微升溴化乙锭溶于500微升蒸馏水中，将染料加至标记条带的上样孔中，位置位于顶部浅蓝色标记物稍上方。

接下来，在紫外光下使用干净的剃须刀片将每条泳道中从上标记到下标记的凝胶切下，并将切下的凝胶转移至一块 4 厘米 × 4 厘米的实验室封口膜上。沿水平方向约切割三刀，垂直方向切割两刀，将凝胶切成 12 个小方块。在封口膜上加入 400 微升 0.3 摩尔的氯化钠溶液，并将凝胶小块转移至 1.5 毫升硅化管中。

将样品置于4°C条件下，在旋转摇床（nutator）上过夜孵育。次日早晨，将每份上清液中的400微升转移至新的离心管中。每管加入1毫升100%乙醇和1微升浓度为15毫克/毫升的糖原共沉淀剂。

然后将离心管置于 -80 °C 保存 1 小时。进行 5' 端接头连接时，首先将解冻的样品离心沉淀，再将沉淀重悬于水中。接着，向每个样品中加入 0.5 µL 的 100 µM 5' 端接头、1 µL T4RNA 连接酶缓冲液、1 µL 10 mM ATP 以及 1 µL 聚乙二醇。

将反应物在 90 摄氏度加热 30 秒，然后置于冰上。随后向每根试管中加入 1 µL T4RNA 连接酶 1，并在室温下孵育反应物 2 小时。进行逆转录时，通过离心收集样品，并将风干的沉淀重悬于 8.25 µL 无核酸酶水中。

加入0.5 µL的100 µM逆转录酶引物和5 µL cDNA合成试剂盒中的2X逆转录反应混合液。在42 °C孵育3分钟后，向每个样本中加入1.5 µL的10X逆转录酶，于PCR仪中在42 °C继续孵育30分钟。完成中和反应后，配制PCR反应体系：29.5 µL水、5 µL 10X Taq缓冲液、1 µL脱氧核苷三磷酸、2 µL 25 µM上游引物、2 µL 25 µM下游引物、0.5 µL Taq聚合酶以及10 µL逆转录获得的cDNA。

然后进行两轮PCR反应。对于琼脂糖凝胶纯化，使用低熔点琼脂糖制备4%琼脂糖凝胶，加入上样染料以及100 bp和25 bp的DNA大小标记物，将40微升或更多的PCR产物上样至凝胶中。电泳完成后，切下位于125 bp条带上方的条带，并根据制造商说明书使用凝胶回收试剂盒进行回收。

使用适当的设备对最终的测序文库进行定量前，先在室温下振荡以使凝胶条带在缓冲液中充分溶解。然后使用适当的开源生物信息学工具分析测序数据。在此具有代表性的低熔点琼脂糖凝胶PCR反应中，可观察到正确克隆产物与所获得的接头-接头产物，以及未饱和与饱和样品之间的差异。

在将序列比对至人类微小RNA（microRNA）发夹结构后，可观察到各重复样本间微小RNA读段数具有高度一致性。共检测到306种微小RNA，其中读段数最多的为微小RNA-122。需要注意的是，应准确切割凝胶至适当大小，以确保微小RNA的有效回收。

对microRNA进行测序后，用户可应用生物信息学分析来表征microRNA在其感兴趣组织中的分布情况。该技术已被用于研究microRNA的加工机制，以及鉴定在特定癌症中发生改变的microRNA组合。操作溴化乙锭时务必小心，并在紫外光下观察凝胶时注意防护。