Name: 使用结构DNA改变分析和患者衍生异种移植测试癌症的靶向疗法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: 了解基于结构DNA改变分析和患者衍生异种移植的癌症靶向疗法测试方法。该方法通过全基因组测序识别可成药靶点，并在免疫缺陷小鼠模型中验证药物疗效，为临床治疗方案选择提供依据。

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感谢梅奥诊所个体化医学中心（CIM）的林阳博士和 Faye R. Harris 硕士在实验实施过程中提供的帮助。本工作由 Neil E. Eckles 先生及其夫人向梅奥诊所个体化医学中心（CIM）的捐赠资助。

根据梅奥诊所机构审查委员会（IRB）批准的方案，在减瘤手术期间收集了签署知情同意书的卵巢癌患者的鲜活组织。本方案中使用的所有动物实验操作和处理均经梅奥诊所机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并遵循动物护理指南。
1. 配对末端测序及分析
注意：Mate pair（MPseq）测序必须使用新鲜或速冻组织。石蜡包埋材料不适用，因其含有断裂的DNA。
<ol>
	<li>从冷冻的肿瘤组织中分离DNA。使用从手术材料或活检获得的原始人类样本36。</li>
	<li>使用1000 ng DNA构建MPseq文库，并在下一代测序仪上以每泳道两个样本进行测序（参见材料表）36。</li>
	<li>利用一组算法分析数据，以检测大片段染色体异常（缺失、插入、扩增、倒位和易位），方法如前所述36,37。</li>
</ol>
2. 治疗靶点的选择
<ol>
	<li>使用开放获取的 Panda 工具（通路与注释）或类似工具来识别可靶向的改变（http://bioinformaticstools.mayo.edu/Panda）。
	<ol>
		<li>根据 MSeq 鉴定出的变异基因，使用公认的标准基因符号，创建一个简单的制表符分隔文件。 
		注意：所附示例包含对扩增和获得事件的分析。</li>
		<li>在列表的标题行前添加“#”符号，以确保表格标题能传递至软件的通路层级视图。</li>
		<li>点击 上传注释集 导航标签来上传文件。</li>
		<li>通过点击所选图标，然后点击 完成 标签，从菜单中指定一个单一图标以表示底层数据。</li>
		<li>注释文件上传后，识别显示每条通路中注释基因数量的列。该列为最右侧的最后一列。</li>
		<li>使用主窗口左上方的 通路筛选 功能，显示包含目标基因的通路。</li>
		<li>识别注释基因数量显著高于随机预期的通路。使用 富集 标签下的功能进行分析。</li>
		<li>通过在主窗口左侧选择适当的图标（例如 DGIdb、PharmGKB），从 预设注释 中选择数据库，以显示潜在可药物靶点的基因。</li>
		<li>在 通路浏览器 页面中点击通路名称，选择要可视化的通路。 
		注意：每个注释集的图标显示在相应基因旁边。点击感兴趣的基因可打开对应的 GeneCards 网页。</li>
		<li>选择显示目标注释基因（即在特定肿瘤中发生改变）且具有潜在药物“命中”结果的通路，用于进一步分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用包含已批准用于临床应用药物的数据库（https://clinicaltrials.gov/）对鉴定出的靶点进行交叉验证。</li>
	<li>通过文献检索（例如 PubMed）确认这些可靶向改变与特定类型肿瘤生物学的相关性，从而优先选择可在 PDX 模型中进一步测试的靶点。</li>
</ol>
3. 通过PCR和Sanger测序验证基因组重排
<ol>
	<li>利用MPseq数据获得的测序读段设计引物。
	<ol>
		<li>根据MPseq分析结果，选择感兴趣的连接区域（即潜在的治疗靶点）进行验证。</li>
		<li>定向设计引物，使扩增子包含该连接区域。在连接区域的每侧各设计2条引物，共4条，以提高扩增出该连接区域的可能性。 
		注意：引物命名应依据病例及染色体位置。</li>
		<li>使用标准PCR参数和任意选择的软件进行引物设计。选择合适的熔解温度（60–62 ˚C）和GC含量（40–60%）。确保引物序列不会形成引物二聚体、回文结构或发夹环。</li>
		<li>通过BLAT（http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start）比对，确认引物序列在人类基因组其他区域无同源性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行PCR扩增以获得目标连接区域。
	<ol>
		<li>用水将引物稀释至10 mM，并将每种引物各取10 mL混合，使每条正向引物与对应的反向引物组成引物混合液。 
		注意：所选示例引物的序列见表1。</li>
		<li>标记0.2 mL条状管：C1、T1、C2、T2、C3、T3、C4和T4，其中C代表对照人基因组DNA（商业来源），T代表从患者或PDX肿瘤中分离的肿瘤DNA，数字表示对应的引物混合液编号。</li>
		<li>向已标记的各管中分别加入1 mL相应的引物混合液。</li>
		<li>按照表2列出的试剂配制Taq预混液，酶在使用前保持冷冻状态，最后再加入混合液中。</li>
		<li>为每种模板DNA（对照人基因组DNA和肿瘤DNA）分别配制2份主混合液。将24 mL的每种Taq主混合液加入对应的条状管中。总反应体积为25 mL。轻轻涡旋混匀后离心。</li>
		<li>在PCR仪中运行PCR程序。使用表3所示的参数。退火温度应至少比引物的熔解温度低1 °C。</li>
		<li>PCR完成后，将产物储存于-20 °C（长期）或4 °C冰箱（短期），待后续使用。</li>
		<li>使用1.5%琼脂糖凝胶，在1–5 V/cm电压下进行电泳以观察PCR产物。保留2 mL产物用于Sanger测序。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行Sanger测序以确认连接区域并确定精确的断裂位点38。
	<ol>
		<li>若PCR扩增产生单一产物（条带），可直接使用该PCR产物。否则，将目标条带从凝胶中切下，纯化后连同用于扩增的引物一并送测Sanger测序。 
		注意：用于基因组分析的肿瘤样本随后将用于小鼠体内移植实验。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 肿瘤移植与维持
<ol>
	<li>建立将肿瘤移植到PDX小鼠模型中的准备工作。选择那些已进行或计划进行基因组分析的肿瘤用于移植。
	<ol>
		<li>确保在启动任何PDX模型开发时，已具备必要的支持性基础设施，包括专用的实验室和动物设施、技术熟练的工作人员以及详细的标准操作程序。</li>
		<li>确保样本能够快速运输和处理，因为速度对于细胞存活率和成功移植至关重要。</li>
		<li>在无菌环境中处理和移植样本，以减少细菌和真菌污染。</li>
		<li>根据机构关于潜在生物危害材料的政策谨慎处理人类样本，因其可能携带经血液传播的病原体。</li>
		<li>将手术样本放入预冷的50 mL离心管中，加入20 mL组织培养基，准备用于移植的组织（大小为0.5–0.7 cm3）。 
		注：肿瘤组织可以是新鲜的，也可以来自先前冷冻保存的材料5。</li>
		<li>通过咨询病理学家确认样本中的肿瘤含量。</li>
		<li>将肿瘤组织置于含有10–15 mL冷PBS或含抗生素（1%青霉素和链霉素）的组织培养基（如RPMI 1640或DMEM）的培养皿中。</li>
		<li>在病理学家协助下，识别并分离出有活力的肿瘤组织，去除邻近的正常组织和坏死组织，使用无菌镊子和手术刀切除病理学家指出的坏死部分。 
		注：肿瘤可选择腹腔内或皮下接种至小鼠体内。如需进行腹腔内接种，请执行步骤4.2；如需进行皮下移植，请跳至步骤4.3。本研究中，基于基因组分析选择的靶向治疗药物在一系列高级别浆液性卵巢癌PDX模型中通过腹腔内接种方式进行测试。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将组织置于冰上，使用无菌镊子和手术刀将其切碎成约1–1.5 mm3大小的组织块，并与冷培养基混合，准备用于腹腔内（IP）接种。使用16–17号针头注射0.3–0.5 mL肿瘤悬液。 
	注：所有外科手术均采用无菌技术操作。使用无菌手套、无菌器械、耗材及植入材料，以降低感染风险。
	<ol>
		<li>将组织块与冰上预冷的培养基按1:1比例混合，每只小鼠腹腔注射100 mL，至少接种三只雌性SCID小鼠。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用无菌镊子、手术刀或手术剪将肿瘤组织切成约2 × 2 × 2 mm大小的小片段，用于皮下移植，并将切碎的组织转移至冰上预冷的培养皿中。
	<ol>
		<li>向含有组织碎片的培养皿中加入冷的基底膜基质（每10块组织约200 mL），充分混匀，使组织碎片在冷的基底膜基质中浸泡10分钟。</li>
		<li>对5只雌性NOD/SCID小鼠进行麻醉，以准备移植。</li>
		<li>通过腹腔注射给予每只小鼠氯胺酮（150 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）混合物。</li>
		<li>使用无创镊子轻捏小鼠尾尖，确认其已充分麻醉。</li>
		<li>轻柔地将完全麻醉的小鼠从麻醉舱中取出，并为其佩戴鼻罩，鼻罩连接麻醉蒸发器供气端和废气清除系统出气端。</li>
		<li>在小鼠眼睛上涂抹兽用眼膏，防止麻醉期间角膜干燥。准备手术区域，手术过程中采用无菌技术操作。</li>
		<li>确保手术操作表面为无孔、密封材质，并在术前进行消毒处理。</li>
		<li>使用经高压灭菌、气体或化学方法灭菌的器械开始手术。</li>
		<li>佩戴手套操作器械，并在各手术步骤之间将器械尖端浸入乙醇中，以在整个过程中保持器械尖端的无菌状态。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过交替使用碘伏和酒精进行三次擦拭，对手术部位进行消毒。使用无菌手术剪和镊子在小鼠双侧 flank 处做5–10 mm的垂直皮肤切口。
	<ol>
		<li>轻柔地将直镊插入皮下间隙，创建一个足够大的囊腔，以便将肿瘤碎片置于脂肪垫下方。</li>
		<li>使用无菌直镊将肿瘤碎片植入此前准备好的5只小鼠皮下囊腔中。 
		注：每个囊腔中放置3–4块肿瘤组织。</li>
		<li>使用组织胶封闭皮肤切口。</li>
		<li>移植后，每只小鼠腹腔注射100 mL利妥昔单抗，以抑制淋巴细胞增殖。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将小鼠放入笼中，并置于加热灯下约20分钟，直至其从麻醉中恢复。监测小鼠生命体征，并确保其充分补水。</li>
	<li>待小鼠从麻醉中恢复并开始进食饮水后，将其与其他小鼠合笼饲养。根据机构指南提供术后护理和监测。术后连续3天每日检查疼痛和痛苦迹象。 
	注：疼痛或痛苦的判断标准包括坏死或溃疡、体重减轻/体况评分、行为表现如活动水平、运动功能和姿势等。</li>
	<li>每两周定期检查小鼠肿瘤形成情况，直至肿瘤直径达到0.5 cm（使用游标卡尺测量）。</li>
	<li>根据每只小鼠的外观、行为和体况评估其健康评分39。将评分≤6分的小鼠视为濒死状态，应通过二氧化碳吸入法实施安乐死。</li>
</ol>
5. 在PDX模型中测试对基因组鉴定靶点的响应
<ol>
	<li>当肿瘤可触及且通过超声扫描测量体积达到 0.5 cm3 时，开始选定的靶向治疗。
	<ol>
		<li>进行腹部超声扫描前，去除小鼠腹部的毛发，并涂抹无菌凝胶润滑剂。</li>
		<li>使用配备换能器的超声设备，将肿瘤置于横截面位置进行成像。每次扫描对每只动物测量 3 次，取平均值以更准确地评估肿瘤大小。</li>
		<li>使用现有软件分析图像40。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每周一次腹腔注射（IP）给予卡铂（51 mg/kg）和紫杉醇（15 mg/kg）联合化疗，总治疗持续时间为 4–6 周。确保注射总体积不超过 0.2 mL。</li>
	<li>将 MK-220641 溶于 30% 环糊精（例如 Captisol）中配制成储备液，每日经口灌胃给药，剂量为 120 mg/kg，连续给药 4 周。</li>
	<li>通过捏住小鼠背部皮肤并将其固定，使小鼠头部和四肢无法活动，以准备进行口服灌胃。
	<ol>
		<li>将灌胃针沿小鼠咽喉后壁缓缓插入，直至进入食管。注意不要插入过深，以免刺穿小鼠肺部导致死亡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 MK-866942 溶于乙醇中配制成 25 mg/mL 的储备液，然后用含 5.2% Tween 80 和 5.2% PEG400 的无菌水稀释，用于腹腔注射，剂量为 10 mg/kg，每两周间隔给药 5 天，总治疗持续时间为 4 周。 
	注：根据动物体重，注射体积应为 50–120 mL。</li>
	<li>每组治疗至少使用 7–8 只小鼠，以确保有足够的统计效能检测差异43,44。</li>
	<li>每天评估接受治疗小鼠的体重及总体健康状况。若动物体重较初始体重下降 20% 或以上，应暂停给药。</li>
	<li>每周通过超声扫描评估肿瘤大小。确保执行肿瘤生长监测的人员对治疗分组情况设盲，以保证疗效评分的无偏性。 
	注：规模较小的实验室可安排两名不同人员分别负责治疗给药和超声监测。</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

我们描述了在PDX模型中开展“临床试验”所采用的方法和方案，该方法利用基因组测序获得的肿瘤分子特征，以确定最适合测试的药物。目前有多种测序平台可用于原发性肿瘤的基因组表征，包括全基因组测序、RNA测序（RNAseq）以及定制基因 panel。对于高级别浆液性卵巢癌，MPseq在识别结构变异、DNA重排和拷贝数改变方面尤为有用，因为此类肿瘤表现出高度的基因组不稳定性。MPseq平台的第二个优势在于其覆盖整个基因组，但成本显著低于其他综合性测序技术。然而，MPseq不适合检测点突变，因其碱基覆盖深度不足，仅能达到8–10x。单独使用MPseq进行肿瘤基因组表征的一个局限性在于，肿瘤中可能存在复杂的聚集性染色体重排，而对此类重排的分析无法预测受影响目标基因的表达情况。MPseq检测到的某个连接位点可能通过PCR在DNA水平上验证为潜在的融合基因，但由于移码突变或启动子区域的小片段缺失和插入，该融合基因可能并不表达。类似地，对于潜在治疗靶点的染色体获得和扩增，应通过RNA或蛋白质水平进行仔细评估和验证，以确保目标基因的实际表达。
尽管肿瘤在小鼠体内传代数代后其分子组成在很大程度上得以保留，...

患者来源的异种移植模型（PDX）是通过将患者的肿瘤组织植入免疫缺陷小鼠体内而建立的，现已成为一种强大的临床前模型，有助于实现个体化抗癌治疗。PDX模型已成功应用于多种人类恶性肿瘤，包括乳腺癌和卵巢癌、恶性黑色素瘤、结直肠癌、胰腺导管腺癌以及非小细胞肺癌1,2,3,4,5。肿瘤组织可进行原位或异位移植。原位移植被认为更准确但技术难度较高，其将肿瘤组织直接移植至肿瘤来源器官。由于肿瘤处于“天然”的微环境，这类模型被认为能更精确地模拟原始肿瘤的组织学特征6,7。例如，将肿瘤组织原位移植至小鼠卵巢囊中，可导致肿瘤向腹腔扩散并产生腹水，这与卵巢癌的典型表现一致8。类似地，将乳腺肿瘤移植至胸部而非腹部乳腺组织，会影响PDX模型的建立成功率及肿瘤行为9。然而，原位模型通常需要复杂的影像系统来监测肿瘤生长。实体瘤的异位移植通常通过将组织植入小鼠皮下侧腹部位实现，该方法便于监测肿瘤生长，且成本较低、耗时较短7。但与原位移植不同，皮下生长的肿瘤极少发生转移10。
移植成功率已被证明因肿瘤类型而异，并在很大程度上取决于肿瘤类型。更具侵袭性的肿瘤以及含有较高比例肿瘤细胞的组织标本被报道具有更高的成功率12,13。与此一致，来源于转移灶的肿瘤移植成功率可达50–80%，而来源于原发灶的肿瘤移植成功率低至14%12。相比之下，含有坏死细胞和较少存活肿瘤细胞的组织移植效果较差。在将组织混合物注射到小鼠体内时，加入基底膜基质蛋白可促进肿瘤生长14，且不会损害原始肿瘤的特性。拟用于移植的组织块的大小和数量也被发现会影响移植成功率。与皮下移植相比，肾包膜下移植具有更高的肿瘤成活率，这是因为肾包膜下环境能够维持原始肿瘤间质，并同时提供宿主的间质细胞15。
大多数研究使用NOD/SCID免疫缺陷小鼠，这类小鼠缺乏自然杀伤细胞16，与其他品系相比，已被证明可提高肿瘤的移植、生长和转移能力14。然而，需要额外监测，因为它们可能在3-4月龄时即出现胸腺淋巴瘤13。在SCID小鼠中生长的卵巢肿瘤移植模型中，利妥昔单抗成功抑制了B细胞的增殖，从而防止淋巴瘤的发生，但不影响卵巢肿瘤的移植成功率17。
近年来，携带白细胞介素2受体γ链编码基因无效突变的NSG（NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ）小鼠已成为建立PDX模型的常用品系18。已有报道指出，已建立的PDX模型在传代至后续几代小鼠时，可保留其组织学和分子特征达3至6代19,20。大量研究表明，PDX模型中的治疗反应与其相应患者的临床反应相似2,3,4,21,22,23。非小细胞肺癌和结直肠癌的PDX模型对化疗药物的应答率与相同药物在临床试验中的应答率相似24,25。针对参加临床试验的患者所建立的PDX模型开展的研究显示，其对测试药物的反应与相应患者在临床上观察到的反应相似2,3,4。
将患者肿瘤的高通量基因组分析与PDX模型相结合，为研究特定基因组改变与治疗反应之间的相关性提供了强有力的工具。这一方法已在少数出版物中有所描述26,27。例如，在一组携带EGFR扩增的结直肠PDX模型中，对EGFR抑制剂西妥昔单抗的治疗反应与患者对西妥昔单抗的临床反应一致28。
建立和应用PDX模型存在一些挑战。其中，肿瘤异质性29,30可能会影响治疗反应解读的准确性，因为PDX中增殖能力较强的单一细胞克隆可能逐渐占据优势，取代其他克隆31，从而导致异质性的丧失。此外，若仅使用单个肿瘤活检样本建立PDX模型，部分细胞群体可能被遗漏，无法在最终的移植瘤中体现。为解决这一问题，建议从同一肿瘤中获取多个样本进行移植。尽管PDX肿瘤通常包含原始供体肿瘤中的所有细胞类型，但这些细胞会逐渐被来源于小鼠的细胞所替代3。目前对PDX模型中人源肿瘤细胞与小鼠间质细胞之间的相互作用尚不完全清楚。然而，已有研究表明，间质细胞能够重建肿瘤微环境33。
尽管存在这些局限性，PDX模型仍然是转化研究以及用于选择患者治疗方案的个体化医学中最有价值的工具之一。PDX的主要应用包括生物标志物的发现和药物筛选。此外，PDX模型还被成功用于研究药物耐药机制，并鉴定克服药物耐药性的策略34,35本文所述方法可使研究人员识别人类肿瘤中潜在的治疗靶点，并在体内评估相应药物的疗效。, 在最初进行基因组学表征的荷瘤小鼠中开展实验。该方案采用腹腔内移植的卵巢肿瘤，但同样适用于任何在小鼠体内具有足够侵袭性并能生长的肿瘤类型2,3,12.

<table><tbody><tr><td>3M Vetbond</td><td>3M, Co.</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>抗AKT抗体</td><td>Cell Signaling Technologies, Inc.</td><td>9272</td><td></td></tr><tr><td>抗GAPDH抗体(G-9)</td><td>Santa Cruz Biotech. Inc.</td><td>sc-365062</td><td></td></tr><tr><td>抗MAPK抗体</td><td>Cell Signaling Technologies, Inc.</td><td>9926</td><td></td></tr><tr><td>抗磷酸化AKT抗体</td><td>Cell Signaling Technologies, Inc.</td><td>9271</td><td></td></tr><tr><td>抗mTOR抗体</td><td>Cell Signaling Technologies, Inc.</td><td>2972</td><td></td></tr><tr><td>抗磷酸化mTOR抗体</td><td>Cell Signaling Technologies, Inc.</td><td>2971</td><td></td></tr><tr><td>抗磷酸化S6抗体</td><td>Cell Signaling Technologies, Inc.</td><td>4858</td><td></td></tr><tr><td>抗Rictor抗体</td><td>Cell Signaling Technologies, Inc.</td><td>2114</td><td></td></tr><tr><td>抗S6抗体</td><td>Cell Signaling Technologies, Inc.</td><td>2217</td><td></td></tr><tr><td>Captisol</td><td>ChemScene, Inc.</td><td>cs-0731</td><td></td></tr><tr><td>卡铂</td><td>NOVAPLUS, Inc.</td><td>61703-360-18</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Easy-A Hi-Fi PCR克隆酶</td><td>Agilent, Inc.</td><td>600404-51</td><td></td></tr><tr><td>润滑剂</td><td>Cardinal Healthcare</td><td>82-280</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning, Inc.</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>McCoy's培养基</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>10-050-CV</td><td></td></tr><tr><td>MK-2206</td><td>ApexBio, Inc.</td><td>A3010</td><td></td></tr><tr><td>MK-8669</td><td>ARIAD Pharmaceuticals, Inc.</td><td>AP23573</td><td></td></tr><tr><td>Nair敏感肌肤脱毛膏</td><td>Church &amp;amp; Dwight Co.</td><td>Nair Hair Remover Shower Power Sensitive</td><td></td></tr><tr><td>NOD/SCID小鼠</td><td>Charles River, Inc.</td><td>NOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl</td><td></td></tr><tr><td>紫杉醇</td><td>NOVAPLUS, Inc.</td><td>55390-304-05</td><td></td></tr><tr><td>PEG400</td><td>Millipore Sigma, Inc.</td><td>88440-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Perjeta</td><td>Genetech, Co.</td><td>Pertuzumab</td><td></td></tr><tr><td>利妥昔单抗</td><td>Genetech, Co.</td><td>Rituxan</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>SCID小鼠</td><td>Harlan Laboratories, Inc.</td><td>C.B.-17/IcrHsd-PrkdcscidLystbg</td><td></td></tr><tr><td>SLAx 13-6MHz线阵探头</td><td>FUJIFILM SonoSite, Inc</td><td>HFL38xp</td><td></td></tr><tr><td>SonoSite S系列超声设备</td><td>FUJIFILM SonoSite, Inc</td><td>SonoSite SII</td><td></td></tr><tr><td>吐温80</td><td>Millipore Sigma, Inc.</td><td>P4780-100ML</td><td></td></tr></tbody></table>

利用结构dna改变分析和患者来源异种移植模型测试癌症靶向治疗

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

本文介绍了一种整合性方法，用于评估靶向治疗的疗效，该方法结合了下一代测序技术、治疗靶点分析以及利用患者来源的异种移植模型（PDX）进行药物反应监测。该策略以卵巢肿瘤为例进行了验证。采用配对末端下一代测序（MPseq）方案识别结构变异，并进一步分析其中可能具有靶向治疗潜力的变异。将人类肿瘤移植至免疫缺陷小鼠体内，随后根据基因组分析结果选择相应药物进行治疗。结果显示，PDX模型中观察到的治疗反应与预测结果具有良好的相关性。该方法可用于评估联合治疗方案的疗效，并有助于为复发性癌症患者提供个体化治疗，特别是在标准治疗失败、需要超说明书使用药物的情况下。

根据机构审查委员会（IRB）的指导原则，收集减瘤手术期间切除的卵巢肿瘤组织，并用于：1）基因组学表征分析，以及 2）移植至免疫缺陷小鼠体内（图1）。采用配对末端测序方案36,37 鉴定DNA中的结构变异，包括缺失、扩增和拷贝数增加。一个代表性基因组图谱展示了某一肿瘤（编号为OC101）中基因组改变的整体情况，如 图2 所示。该肿瘤属于高级别浆液性亚型，典型特征为存在多个拷贝数增加（蓝色线条）和缺失（红色线条），表明基因组高度不稳定；同时还观察到染色体水平的丢失与获得，提示存在非整倍体现象。在高级别浆液性亚型肿瘤中，通常可检测到总计300–700个基因组变异45。进一步分析发现，其中少数DNA变异可能可通过临床上已有药物进行靶向干预。在OC101肿瘤中，优先级最高的可干预变异是位于17号染色体上涉及ERBB2的扩增（...

本文介绍了一种基于肿瘤基因组特征选择靶向治疗方案并评估其疗效的实验流程。该方案描述了结构型DNA重排的鉴定与验证、将患者肿瘤组织移植至小鼠体内，以及对相应药物治疗反应的检测方法。

利用结构DNA改变分析和患者来源异种移植模型测试癌症靶向治疗

我们在此介绍一种整合性方法，用于评估靶向治疗的疗效，该方法结合了下一代测序技术与治疗策略……

本文所述方案旨在演示利用体内癌症模型测试治疗有效性的算法。该方案结合了多种技术。通过对人类肿瘤标本进行全基因组生物测序，以鉴定基因组变异。这些改变包括基因重排和基因拷贝数变化。因此，需对已鉴定的改变进行分析，以筛选出可能具有药物靶向性的变化。随后，根据基因组分析结果选择的药物将用于治疗在免疫缺陷小鼠体内生长的相应肿瘤。所开发的算法为癌症患者治疗决策的制定提供了一种颇具前景的辅助方法。使用Panda工具或类似软件来识别可靶向的基因变异。我们可将通过微测序技术鉴定出的基因，以标准公认的基因符号列出，并生成一个简单的制表符分隔文件。在列表的标题行中添加井号符号（#），以确保表格标题被传输至软件的通路层级 U。通过点击相应的导航选项卡上传文件。通过点击所选图标，然后点击“完成”选项卡，为底层数据分配一个单独的图标以进行表示。患者文件上传后，预览页面以确定显示每条通路中注释基因数量的列，该列为最右侧的最后一列。在主窗口左上方使用通路筛选器，将显示的通路数量限制为包含目标基因的通路。为了鉴定出比随机预期含有更多注释基因的通路，请使用“富集”选项卡下的功能。随后，主表格中将添加一列，显示来自费舍尔精确检验的相应 p 值。通过在主窗口左侧勾选相应图标，选择数据库以显示预设注释中的潜在可药靶基因。要选择通路进行可视化，请点击通路查看器页面中显示的通路名称。每个注释集对应的图标会显示在相关基因的旁边。点击通路中的任意基因，将打开相应的基因卡片页面。选择含有目标基因注释及潜在药物作用靶点的信号通路，用于进一步分析。在层流罩中进行组织操作，以维持无菌条件。将肿瘤组织置于含有冷的PBS或含抗生素的组织培养基（如RPMI、DMEM）的培养皿中。在病理学家的协助下，识别并分离出有活性的肿瘤组织，去除邻近的正常组织和坏死组织。使用无菌镊子和手术刀，根据病理学家指出的区域，去除坏死组织。进行皮下移植时，用无菌镊子、手术刀或手术剪将肿瘤组织切成约 2 x 2 x 2 毫米大小的小片段。将破碎的组织转移至预冷的、置于冰上的培养皿中。向培养皿中加入冰冷的Matrigel，每10块组织约加入200 µL。充分混匀，使组织碎片在Matrigel中浸泡10分钟。使用无菌手术剪和镊子在小鼠双侧 flank 区域做一道 5-10 毫米的纵向皮肤切口。将直镊轻轻插入皮下间隙，创建一个足够大的囊腔，以便将肿瘤组织片段置于脂肪垫下方。使用无菌直镊将肿瘤组织片段插入先前在五只小鼠中分别制备好的囊腔内。使用组织胶水闭合皮肤切口。植入后，为抑制淋巴细胞增殖，每只小鼠注射 100 微升利妥昔单抗。通过捏住小鼠背部皮肤并向后弯曲，使其头部和嘴唇固定，以准备进行口服灌胃。将灌胃探针沿小鼠咽喉后壁插入，直至探针进入食管。注意探针插入深度不可过深，以免刺穿小鼠肺部导致死亡。代表性基因组浮点图展示了单个肿瘤中基因组改变的整体图景。对于高级别浆液性肿瘤而言，通常可检测到多处获得（蓝色线条）和缺失（红色线条），表明基因组高度不稳定。OC101肿瘤中最具治疗干预意义的首要变异趋势是17号染色体上的扩增，涉及ERBB2基因，该基因编码HER2受体。为了在DNA水平上验证这些结果，针对扩增区域边缘设计了多组特异性引物。随后进行PCR反应。当使用对照人DNA时，未检测到扩增产物。在OC101肿瘤DNA中鉴定出特异性条带。在另一种变异肿瘤T14中，观察到大量的DNA扩增，其中包括AKT2和RICTOR基因。在蛋白质水平上通过免疫印迹进行的验证显示，AKT和RICTOR的表达水平较高。在第六周末，化疗治疗组的肿瘤负荷显著降低。接受联合治疗的组别相较于单独化疗显示出额外的治疗益处。在治疗试验结束时，采集肿瘤组织以进行治疗反应的分子分析。使用免疫印迹法检测S6、AKT和mTOR的总蛋白水平及其磷酸化水平。比较未经处理、化疗药物处理以及AKT或mTOR抑制剂处理的样本中这些蛋白的水平，结果显示后两种处理组中蛋白水平显著降低。该方法对于在PDX模型中开展临床试验具有重要价值。它利用基因组分析所获得的肿瘤分子特征，来确定最适合用于测试的药物。

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使用结构DNA改变分析和患者衍生异种移植测试癌症的靶向疗法

本论文详细描述了一种利用循环肿瘤细胞（CTCs）建立前列腺癌患者来源的异种移植模型（PDXs）的方法。通过循环肿瘤细胞建立PDX模型，为研究前列腺癌提供了一种替代性实验模型；前列腺癌是男性中最常被诊断出的肿瘤，也是男性因癌症死亡的常见原因。...

从循环肿瘤细胞建立前列腺癌患者来源的异种移植模型

在体内生长阶段，人源肿瘤异种移植模型具有血管化特征，并被来源于小鼠的细胞浸润。in vivo...

耗竭人源肿瘤异种移植组织中的小鼠细胞显著改善靶细胞的下游分析

利用患者来源的肿瘤建立皮下临床前模型，是研究新型疗法疗效、预测性生物标志物发现以及耐药通路的极佳方法。在药物研发过程中，该模型对于确定多种新型抗癌疗法在进入临床研究前的命运至关重要。...

用于研究新型抗癌疗法的临床前患者来源肿瘤异种移植模型的建立与维护

与传统的基于塑料培养皿的组织培养检测方法相比，患者来源的异种移植（PDX）模型能更可靠地再现黑色素瘤的分子和生物学特征，并能更准确地预测治疗反应。本文介绍了我们建立新型 PDX 模型以及对已有 PDX...

一种黑色素瘤患者来源的异种移植模型

本文描述了一种利用患者来源的异种移植瘤（PDX）建立类器官的方法，用于体外筛选，从而获得匹配的体内/体外模型对。将PDX肿瘤通过机械或酶消化方法处理成小块，随后采用Clevers方法培养肿瘤类器官，并对这些类器官进行传代、冻存，以及与原始PDX进行比对表征。...

创建匹配的PDX与PDX来源类器官体内/体外患者来源模型对用于癌症药理学研究

本文介绍了一种用于生成、药物处理及分析患者来源的离体组织的方法，以在活体、与患者相关且具有临床前意义的模型系统中评估肿瘤对药物的反应。...

源自患者的肿瘤外植体作为预测患者药物耐药性的“活体”临床前平台

此处，我们介绍一种针对胚胎致死基因敲除的实验方案 体内 在基因工程小鼠模型来源的肿瘤中进行基因敲除，随后评估该敲除对肿瘤生长、增殖、存活、迁移、侵袭以及转录组的影响 体外 和 体内.

通过肿瘤发生中定义基因功能 离体 恶性周围神经鞘瘤细胞中 floxed 等位基因的敲除

本方案描述了在非小细胞肺癌患者来源类器官模型中，对靶向信号通路抑制剂的药物敏感性进行标准化评估的方法。...

表征EGFR突变型非小细胞肺癌患者来源类器官对靶向治疗的敏感性

本方案描述了一种高效、非手术的小鼠原位移植乳腺癌患者来源异种移植瘤的方法。该技术包括酶解法解离肿瘤组织，随后直接注射至乳腺脂肪垫中，可实现高通量移植。通过全面的验证确保模型的可靠性，有助于开展针对多种乳腺癌亚型的严谨研究。...

高通量解离与原位移植乳腺癌患者来源的异种移植瘤

本方案描述了一种用于检测非小细胞肺癌（NSCLC）福尔马林固定石蜡包埋组织中可靶向基因组改变的自动化、通过ISO15189认证的下一代测序工作流程。...

使用下一代测序技术检测非小细胞肺癌中的可靶向基因变异

了解基于结构DNA改变分析和患者衍生异种移植的癌症靶向疗法测试方法。该方法通过全基因组测序识别可成药靶点，并在免疫缺陷小鼠模型中验证药物疗效，为临床治疗方案选择提供依据。

利用结构DNA改变分析和患者来源异种移植模型测试癌症靶向治疗

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