注射重组狐尾花叶病毒和甘蔗花叶病毒传染性克隆直接农种玉米幼苗

提出了一种基于 农杆菌的注射（农用注射）方案，用于将狐尾花叶病毒和甘蔗花叶病毒克隆接种到玉米幼苗中。以这种方式接种会导致病毒感染、病毒诱导的标记基因沉默以及 GFP 的病毒过表达。

该协议允许将病毒载体直接接种到玉米植物中，这些植物可以很容易地应用于大多数实验室环境，而无需任何昂贵的专用设备。直接接种消除了使用替代宿主作为接种源，从而节省了时间和资源。该方法可应用于其他病毒载体、玉米品系和潜在的其他单子叶植物物种。

首先在基于泥炭的生长介质中种植1至2个玉米种子，放置在托盘内的小插入物中。将托盘放在生长室中，白天16小时，温度为25摄氏度，晚上8小时，温度为22至25摄氏度，或温室温度为22至25摄氏度，白天16小时，晚上8小时。定期给植物浇水，每周施肥一次，用15-5-15液体肥料，浓度为百万分之330。

通过将含有所需病毒构建体的农杆菌菌株接种在LB培养基中，用抗生素接种用于注射的农杆菌。然后，将烧瓶或管子在28摄氏度下孵育，同时以225 RPM振荡24小时。第二天，通过在室温下以4， 000倍G离心10分钟沉淀细菌并丢弃上清液。

然后，用一毫升去离子水洗涤沉淀。将沉淀重新悬浮在一毫升10毫摩尔硫酸镁溶液中，并在600纳米处测量光密度。然后将其调整为 1.0。

使用4至7天龄的玉米幼苗注射农杆菌。组装注射器和针头。轻轻地将细菌悬浮液注射到鞘翅节点上方2-3毫米处，直到它填满鞘翅目，或在涡旋中可见，等待在植物的生长阶段。

注射所有幼苗，并更换注射器和针头以注射每个结构。通过观察沉默对照基因的病变，叶片上的病变模拟22或八氢番茄红素去饱和酶来确认表型感染。使用荧光成像设备快速筛选植物和荧光显微镜来检测GFP表达的存在。

执行基因表达分析以检测感染的分子。感染后14至21天从受感染植物的叶子中提取总RNA，并合成文本手稿中描述的第一链cDNA。使用针对不同病毒构建体的特定引物进行逆转录酶PCR以确认感染并确定基因的完整性或目标基因片段。

在含有核酸染色剂的1%琼脂糖凝胶上可视化PCR产物，以确定是否存在病毒和基因或基因片段。该协议用于将基因工程的重组病毒插入玉米幼苗中。注射后约12天，在叶子上观察到沉默表型为坏死和光漂白。

通过使用不同的GFP滤光片在荧光下观察绿色荧光蛋白表达来检测感染后叶片中构建体的存在。在受感染的鱼尾花叶中，绿色荧光蛋白表达被可视化为分布在叶子上的小点状荧光区域和甘蔗花叶病毒感染叶子中的大块斑块。利用基因表达分析，确认了系统性狐尾花叶病毒感染，并观察到八氢番茄红素去饱和酶和病变模拟22的基因沉默或抑制。

使用的结构还影响了感染效率。在狐尾花叶病毒感染的情况下，狐尾花叶病毒空载体和狐尾花叶病毒病变模拟22通常具有最高的感染效率，分别为53%和54%。狐尾花叶病毒八氢番茄红素去饱和酶在效率略低时为39%，而狐尾花叶病毒绿色荧光蛋白在最低效率为16%，同时，甘蔗花叶病毒绿色荧光蛋白的感染效率为8%，症状将基于所使用的病毒载体和玉米品系。

缺乏视觉表型可能并不意味着缺乏沉默或表达。该方法还可以通过改进向导RNA的递送方法应用于基因编辑技术。