通过注射重组狗尾草花叶病毒和甘蔗花叶病毒感染性克隆直接对玉米幼苗进行农杆菌接种 关键词：玉米幼苗，农杆菌接种，注射，重组狗尾草花叶病毒，重组甘蔗花叶病毒，感染性克隆

该方案允许将病毒载体直接接种到玉米植株中，可在大多数实验室条件下轻松实施，无需任何昂贵的专用设备。直接接种避免了使用替代宿主作为接种源，从而节省了时间和资源。该方法可应用于其他病毒载体、玉米品系，以及潜在的其他单子叶植物物种。

首先，在托盘内的小型育苗插盆中，将1至2粒玉米种子播种于泥炭基质中。将托盘置于培养室中，每日光照16小时，温度为25摄氏度，夜间8小时，温度为22至25摄氏度；或置于温室中，温度保持在22至25摄氏度，每日光照16小时，夜间8小时。定期浇水，并每周施用一次浓度为330 ppm的15-5-15液体肥料。

通过将含有目标病毒载体的农杆菌菌株接种于含抗生素的LB培养基中，来准备用于注射的农杆菌。随后，在28°C、225 RPM振荡条件下培养培养瓶或试管24小时。次日，在室温下以4,000 × g离心10分钟使细菌沉淀，并弃去上清液。

然后，用一毫升去离子水洗涤沉淀。将沉淀重悬于一毫升 10 毫摩尔/升硫酸镁溶液中，在 600 纳米处测定光密度，然后将其调整至 1.0。

使用4至7天大的玉米幼苗进行农杆菌注射。组装好注射器和针头。在胚芽鞘节上方2-3毫米处轻轻注入菌液，直至菌液充满胚芽鞘，或在叶心处可见，具体操作取决于植株的生长阶段。

对所有幼苗进行注射，并在注射每种载体时更换注射器和针头。通过观察叶片上因沉默对照基因、类病变22或八氢番茄红素脱氢酶而产生的病斑，确认表型感染。使用荧光成像设备对植株进行快速筛选，并利用荧光显微镜检测GFP表达情况。

进行基因表达分析以实现感染的分子检测。在接种后14至21天，从感病植株的叶片中提取总RNA，并按照文稿所述方法合成第一链cDNA。利用针对不同病毒载体设计的特异性引物，通过逆转录PCR确认感染状态，并检测目标基因的完整性或目的基因片段。

在含有核酸染料的1%琼脂糖凝胶上电泳观察PCR产物，以确定病毒以及目的基因或基因片段的存在与否。本方案用于将为基因改造的重组病毒导入玉米幼苗。注射后约12天，叶片上出现基因沉默表型，表现为坏死和光漂白现象。

通过使用不同的GFP滤光片在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，检测感染后叶片中载体的存在。在感染谷子花叶病毒的叶片中，绿色荧光蛋白的表达表现为分布在叶片上的微小点状荧光区域，而在感染甘蔗花叶病毒的叶片中则表现为较大的荧光斑块。通过基因表达分析，确认了谷子花叶病毒的系统性感染，并观察到八氢番茄红素脱氢酶和类病变模拟22基因的基因沉默或抑制现象。

所使用的载体也影响了侵染效率。在谷子花叶病毒侵染实验中，谷子花叶病毒空载体和谷子花叶病毒模拟病斑22的侵染效率通常最高，分别为53%和54%。谷子花叶病毒八氢番茄红素脱氢酶的效率略低，为39%，而谷子花叶病毒绿色荧光蛋白的侵染效率最低，为16%。与此同时，甘蔗花叶病毒绿色荧光蛋白的侵染效率为8%。侵染时间和症状表现将取决于所使用的病毒载体和玉米品系。

缺乏可视表型并不一定意味着基因沉默或表达的缺失。该方法还可通过改进向导RNA的递送方法，应用于基因编辑技术。