高效农杆菌浸润法实现植物中重组蛋白的高水平瞬时表达

该实验系统利用农杆菌浸润法，将基因构建体有效递送至叶片，以实现高水平重组蛋白的生产。首先，在浸润前六周，于受控环境中培养心叶烟植株；在浸润当天，制备含有目标基因的农杆菌菌液，该基因将在植物中表达。

通过注射器或真空渗透法将农杆菌菌液导入植物组织。例如，在紫外光下观察烟草叶片中绿色荧光蛋白（GFP）的荧光强度，结果表明植物中重组蛋白的表达水平可与现有的哺乳动物、细菌及昆虫表达系统相媲美。农杆菌渗透是一种将外源基因导入植物细胞的有效方法，可实现重组蛋白的高水平表达。

该方法可应用于多种植物物种。最重要的是，它可扩展用于药用蛋白的商业化生产。因此，该方法可为绿色荧光蛋白（GFP）的表达动力学提供研究依据，并可推广应用于其他蛋白，如亚单位疫苗、重组单克隆抗体，以及癌症和传染病的治疗。

成功的实验需要为细菌培养物和植物材料提供最佳条件。该侵染过程在经过直观演示后更容易重复。首先，将最多60个泥炭颗粒放入育苗盘中。

加入四升自来水，让豌豆颗粒浸泡吸水两小时。然后，将两粒哈马纳种子放入每个泥炭颗粒中，并用透明塑料罩盖住育苗盘以促进发芽。将种子置于25°C、84%湿度的环境中。

播种两周后，取下培养罩并将植株转移至新托盘中。然后加入两升每升含1.48克的Jack's肥料。继续在25°C条件下培养植株。

每两天将植物置于50%湿度环境中，每个托盘供给两升杰克牌肥料。第四周时，将带有泥炭颗粒的植物转移至新的托盘中，每托盘放置六株，继续培养至六周龄。

选取四株六周龄、每株具有五到六片叶子的哈马马植株，每株取三片叶子用于浸润携带目的基因的农杆菌菌株，一片叶子作为阴性对照，一片叶子用于点状浸润。用针在叶片背面的表皮上制造一个微小切口，注意不要穿透叶片的两侧。

用一只手牢牢抓住第一片叶片的正面，同时对叶鞘施加轻柔的反向压力。用另一只手的拇指将含有农杆菌的浸润缓冲液混合物通过注射器和针头注入叶鞘中。

继续将农杆菌混合液注入切口，直至深绿色圆圈不再扩展。然后创建另一个切口并重复注射，直到整片叶片完全浸润且整体变为深绿色。对每株植物的前三片叶子以及第四片叶子的整片叶片进行完全浸润，分别使用四种双生病毒载体或三种magcon载体的组合。

同时，针对每种农杆菌菌株组合制作一个切口，并用对应的菌液组合对每个切口进行浸润。浸润后，将植物移回生长室，并在2至15天内监测蛋白表达情况。浸润完成后，将容器放入真空干燥器中，并加入含有农杆菌菌株的三升浸润缓冲液。

然后将干燥器连接至隔膜真空泵的真空端口。现在将一株植物倒置放在干燥器的托盘上，并缓慢降低托盘连同植物，直至整个叶片和茎系统完全浸入渗透缓冲液中，同时托盘平放在容器顶部。接下来，将干燥器的O形密封圈放置在边缘处。

将干燥皿盖盖上后，启动真空泵，并在真空度达到100毫巴时开始计时。当在100毫巴下维持一分钟后，关闭真空泵，缓慢打开干燥皿上的放气阀，使农杆菌进入浸没的植物组织的间隙空间。重复此渗透步骤。

第一步是确保良好的侵染效果。然后将植物从干燥器中取出，并恢复至直立位置。将植物移回培养室，并在侵染后第2至15天内监测蛋白表达情况。

为了证明注射器在农杆菌渗入植物组织中的有效性，我们利用两种不同的去构建植物病毒载体——Gemini病毒载体和magcon载体，检测了两种荧光蛋白GFP和DsRed的表达。将含有Gemini病毒载体的农杆菌完全渗入哈马纳（Hamana）叶片后，在紫外光下观察到整个叶片区域均有GFP表达，最早可在接种后2天（2 DPI）检测到，并在接种后4天（4 DPI）达到最高积累水平。

相比之下，用含有农杆菌组合的 magcon 载体侵染的叶片在接种后第五天（5 DPI）才开始出现 GFP 荧光，并在第七天（7 DPI）达到最大积累量。而用阴性对照农杆菌混合物 EP1 10 加 P19 侵染的叶片未观察到绿色荧光，表明荧光特异性来自 GFP 基因，而非叶片本身的背景荧光。在荧光积累峰值时，magcon 载体表达的 GFP 荧光强度高于 Gemini 病毒载体。

在通过注射点渗透法利用双生病毒载体在同一叶片上共表达两种荧光蛋白时，未观察到表达GFP构建体的叶片出现明显坏死，且在渗透区域均检测到预期的荧光颜色。有趣的是，GFP与DS RED共渗透后产生了黄绿色荧光。此外，还尝试了真空渗透法，以建立一种可放大的农杆菌渗透方法，用于植物瞬时表达系统大规模生产重组蛋白。

与注射器浸润法相比，预期的GFP荧光在浸润植株的所有叶片中均被观察到。该方法更为高效，且可在更短的时间内完成每株植物的浸润。一旦掌握，该技术可在48小时内完成。

大多数情况下，该方法用于农杆菌培养，因为实际浸润时间仅有数分钟。为了获得最佳的农杆菌浸润效率和靶向蛋白表达，请遵循实验方案。务必控制关键参数，包括植物生长条件、农杆菌浓度、真空压力和处理时间。该技术应用于植物生物技术领域。

该实验方法可用于探索在多种植物物种中开发和生物生产新型药用蛋白。观看本视频后，您应能充分了解如何利用农杆菌浸润法将目标基因构建体导入植物体内，并利用植物瞬时表达系统生产重组蛋白，其产量可与哺乳动物、细菌及昆虫细胞培养系统相媲美。