高级别瞬态表达重组蛋白的植物高效的农杆菌
July 23rd, 2013
植物提供了一种新的系统，以商业规模生产药物蛋白，更具可扩展性，成本效益和安全比目前的表达范式。在这项研究中，我们报告一个简单方便，且可扩展的方法，引入目标基因农杆菌
该实验系统使用农业渗透有效地将基因构建体递送到叶子上，以产生高水平的重组蛋白。首先，在渗透前三天，在受控环境中种植末端 hamana 植物 6 周。准备农杆菌培养物，其中包含在渗透当天在植物中表达的靶基因。
通过注射器或真空渗透将农杆菌培养物引入植物组织中。结果如紫外光下烟叶中 GFP 的绿色荧光强度表明，重组蛋白在植物中的强烈表达可与当前基于哺乳动物的细菌和昆虫表达系统相媲美。农业浸润是将反基因引入植物细胞的有效方法，可导致重组蛋白的高水平表达。
它可用于广泛的植物物种。最重要的是，它可以扩大规模用于药用蛋白的商业生产。因此，这种方法可以深入了解 GFP 的动力学和表达，并可以应用于其他蛋白质，如亚单位疫苗、重组单克隆抗体，并可用于癌症和传染病的治疗。
成功的实验需要细菌培养物和植物材料的最佳条件。这种渗透过程在视觉演示后更容易复制。首先将最多 60 个泥炭颗粒放入繁殖盘中。
加入 4 升自来水，让豌豆颗粒吸收水分 2 小时。现在，在每个泥炭颗粒中加入两颗金沙籽，并用透明塑料圆顶盖住托盘发芽。将种子放在 25 摄氏度、84% 湿度的环境中。
播种两周后，取下圆顶并将植物转移到新托盘中。然后加入两升每升 1.48 克。杰克的肥料 继续在 25 摄氏度的温度下种植植物。
每两天 50% 湿度环境。每盘供应两升千斤顶肥料。在第四周，将带有泥炭颗粒的植物转移到装有六株植物的新托盘中，以进一步生长至六周龄。
选择四株、六周龄和滨叶植物，每株有 5 到 6 片叶子，每片叶子有 3 片叶子，以完全渗透含有感兴趣基因的农业细菌菌株。一片叶子用于阴性对照，一片叶子用于斑点浸润。在叶子背面的表皮上用针头划一个小口，确保不要从叶子的两侧刺穿。
牢牢抓住第一片叶子的正面，同时对颈部施加轻微的反压力。用一只手的拇指。用注射器、针头将渗透缓冲液中的农杆菌混合物注射到颈部。
继续将农杆菌混合物注射到缺口中，直到深绿色的圆圈停止扩大。然后创建另一个缺口并重复注射，直到整片叶子被渗透并且整片叶子变成深绿色。每株植物的前三片叶子和第四片叶子的最后一片叶子用所有四种 Gemini 病毒载体或三种 magcon 载体的载体组合进行渗透。
此外，为农杆菌菌株的每种组合制作一个缺口，并用一种组合渗透每个缺口。渗透后，将植物移回生长室，并在 2 到 15 天之间监测蛋白质表达。渗透后，将一桶放入真空干燥中，并转移至三升含有农杆菌菌株的渗透缓冲液中。
然后将干燥液连接到真空品牌隔膜真空泵。现在将植物倒置在干燥板上，并与植物一起降低板，直到整个叶子和茎系统浸没到渗透缓冲液中，板放在浴缸顶部。接下来，将干燥的 O 形环沿边缘放置。
将干燥剂盖在腔室上后，打开真空泵并在真空达到 100 毫巴时开始计时。关闭真空泵后，在 100 毫巴下以 1 分钟缓慢打开干燥物上的释放阀，让农业细菌进入淹没植物组织的间隙。重复此渗透。
第一步确保良好的渗透。然后从干燥物中取出植物并将其放回直立位置。将植物移回生长室，并在浸润后 2 到 15 天之间监测蛋白质表达。
为了证明注射器将农杆菌浸润到植物组织中的有效性，我们测试了两种不同的解构植物病毒载体 Gemini、病毒和 magcon 对两种荧光蛋白 GFP 和 Ds red 的表达。Hamana 叶子完全被含有 Gemini 病毒载体的农业细菌浸润。在紫外光下观察到 GFP 在整个叶片区域表达，早在 2D PI 开始，并在 4 DPI 处达到积累峰值。
相比之下，用含有农杆菌组合的 magcon 载体浸润的叶片仅在 5 DPI 后才显示 GFP 荧光，并在 7 DPI 时达到最大积累。用 EP one 10 加 P 19 的阴性对照农用细菌混合物浸润的叶片中没有观察到绿色荧光，表明荧光对 GFP 基因具有特异性，而不是来自叶片的背景荧光的结果。在积累高峰期，表达 GFP 的 magcon 载体的荧光比 Gemini 病毒载体的荧光更强。
当两种荧光蛋白通过 Gemini 病毒载体在同一片叶子上表达时，没有观察到重大坏死，注射器斑点浸润，在它们被浸润的斑点检测到它们的预期荧光颜色。有趣的是，GFP 和 DS RED 的共浸润导致淡黄色荧光。还研究了真空渗透以开发一种可扩展的农业渗透方法，该方法可用于植物瞬时表达系统大规模生产重组蛋白。
正如预期的那样，与注射器浸润相比，观察到浸润植物的所有叶子的 GFP 荧光。它更健壮，可以在更短的时间内实现对每株植物的渗透。一旦掌握，这项技术可以在 48 小时内完成。
大多数时候，它用于农业细菌培养，因为实际渗透时间只有几分钟，以实现最佳的农业渗透效率和靶向蛋白质表达。遵循协议。请记住控制关键参数，包括植物生长条件、农业细菌浓度、真空压力和持续时间 在植物生物技术领域。
这种实验方法可用于探索新型药物蛋白在广泛植物物种中的开发和生物生产。观看本视频后，您应该对如何使用农业浸润将靶基因构建体递送到植物中，并允许植物瞬时表达系统产生与哺乳动物细菌和昆虫细胞培养物相媲美的重组蛋白。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概述
本研究提出了一种使用农杆菌在植物中生产药用蛋白的可扩展方法。该方法利用农杆菌渗透将基因构建体输送到植物组织中，从而实现高水平的重组蛋白表达。
关键研究组成部分
科学领域
- 植物生物技术
- 蛋白表达系统
- 药用生产
背景
- 当前的蛋白表达系统在可扩展性和成本方面存在局限性。
- 植物为生产药用蛋白提供了一种安全的替代方案。
- 农杆菌是植物基因转移的成熟工具。
- 瞬时表达系统可以快速产生高水平的蛋白质。
研究目的
- 开发一种在植物中简单且可扩展的蛋白表达方法。
- 证明农杆菌渗透在输送基因构建体方面的有效性。
- 比较基于植物的表达与传统系统。
使用的方法
- 用于基因传递的农杆菌渗透技术。
- 在受控环境中生长的末端汉玛纳植物的使用。
- 准备含有目标基因的农杆菌培养物。
- 通过荧光成像评估蛋白质表达。
主要结果
- 在植物组织中成功表达了高水平的重组蛋白。
- 荧光成像显示烟草叶片中绿色荧光蛋白表达强劲。
- 该方法相比哺乳动物和细菌系统具有优势。
- 农杆菌渗透证明是一种有效的基因引入方法。
结论
- 研究证实了使用植物进行大规模蛋白生产的可行性。
- 农杆菌渗透是瞬时基因表达的有前景的技术。
- 该方法可以提高药用蛋白生产的效率。
常见问题
Executive Industry Relevance
Plant-based transient expression systems address scalability and cost limitations of mammalian cell culture for recombinant protein production. Agroinfiltration enables rapid, high-level expression of therapeutic proteins such as subunit vaccines and monoclonal antibodies. This approach supports early-stage target validation and lead identification by providing a scalable, low-cost platform for protein expression and functional screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional validation of therapeutic targets through high-level recombinant protein expression in planta.
- Operational Value: Provides a rapid, scalable system for protein production to support hypothesis testing and pathway analysis.
- Predictive Value: Facilitates comparative assessment of protein variants, vectors, or expression kinetics for lead selection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence readouts (e.g., GFP, DsRed) for assay standardization and reproducibility.
- Operational Value: Supports multi-target screening on single leaves via syringe infiltration for vector or construct comparison.
- Scalability: Vacuum infiltration enables scale-up for larger leaf areas and species not amenable to syringe methods.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Produces recombinant proteins in disease-relevant plant systems for preclinical evaluation.
- Mechanistic De-risking: Allows co-expression of multiple proteins (e.g., GFP and DsRed) to study interactions or fusion constructs.
- Continuity: Bridges discovery to preclinical work by providing scalable protein supply for functional assays.
Pipeline & Workflow Integration
The agroinfiltration method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical protein supply, enabling rapid iteration and comparative analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via transient expression of gene constructs to assess protein function and localization.
- Screening: Enables reproducible, quantitative protein production for screening campaigns using fluorescence-based readouts.
- Analytics: Fluorescence intensity measurements under UV light provide quantitative data for comparing expression levels across conditions.
- Translational Research: Generates sufficient protein yields for downstream preclinical testing in vaccine or therapeutic development.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for protein expression across multiple projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: High-level transient expression reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Syringe infiltration offers simplicity and flexibility; vacuum infiltration enables robustness and scalability.
- Strategic Value: Low-cost, scalable production supports better go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on protein yield, expression kinetics, and functional output.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant growth, Agrobacterium handling, and infiltration techniques.
- Needs controlled growth environments, infiltration buffers, and vacuum or syringe equipment.
- Standardization across teams requires consistent plant age, bacterial concentration, and infiltration parameters.
- Adaptation across species (e.g., tobacco, lettuce, Arabidopsis) may require optimization of vacuum pressure and incubation time.
- Practical limitations include species-specific infiltration efficiency and the need for fluorescence detection equipment.
