用于慢性疾病大型哺乳动物心脏模型的对比增强微型计算机断层扫描成像的组织制备技术

本方案利用微型计算机断层扫描技术，在全器官尺度上提供结构性病理疾病的微观结构信息。本方案采用一种特殊的组织制备方法，以优化对人类可转化大型哺乳动物模型全心样本的高分辨率成像，并实现对结构性疾病的特异性对比增强。心脏微结构，例如纤维化分布以及可兴奋心肌组织的排列，是多种心脏疾病的基础，并可导致危及生命的心律失常。

进行该操作演示的是我实验室的博士后研究员兼博士毕业生 Nestor Pallares-Lupon。首先，配制含有肝素钠的心肌停搏液，并将溶液置于 4 摄氏度保存。接下来，配制 PBS/EDTA 溶液：先将 EDTA 加入 1 升蒸馏水中，使其终浓度为 10 毫摩尔。

然后使用氢氧化钠将溶液的 pH 值升高并维持在 12，以溶解 EDTA。待 EDTA 完全溶解后，使用盐酸将 pH 值降至 7.4。随后加入一袋 PBS 粉末，得到 pH 为 7.4 的 0.01 摩尔浓度溶液。

将配制好的溶液在室温下保存。最后，通过将10克PMA加入一升无水乙醇中，制备1%乙醇PMA对比剂溶液。将配制好的溶液在室温下保存。

准备一个一升容量的储液罐，将其置于解剖皿上方80厘米处，并将一段热塑性管连接至储液罐的排水口。在排水管路上安装一个三通旋塞，并将热塑性管分别连接至三通旋塞的两个自由端口。在管路的两个自由末端分别安装二通旋塞。

接下来，将含有肝素的停跳液注入储液器中。打开旋塞，使停跳液流出以排出所有气泡，然后关闭双向旋塞。

从安乐死的动物体内取出心脏后，将其置于冰上预冷的心脏停搏液中，直至准备进行解剖。随后准备左、右冠状动脉开口的插管：截取五厘米长的聚四氟乙烯（PTFE）导管，将一端靠近明火加热。当管尖约一毫米开始熔化并变为半透明时，立即将其压在坚硬耐热的表面上，使插管尖端形成一条凸缘，以防止插管从血管中滑脱。然后将每根插管未加热的一端插入排水储液器引流管的两端各一厘米。

接下来，移除主动脉插管，在冷心脏停搏液下定位左、右冠状动脉的开口。使用尖头剪刀，仔细分离冠状动脉开口上方和下方的主动脉根部周围组织，以便将0号丝线缝线穿入冠状血管下方。然后打开双向活塞，将插管尖端插入冠状动脉开口中。

将套管尖端插入骨组织内一至两厘米，并超过缝合位置后，结扎固定套管。接着，在轻轻按摩心室的同时用缓冲液冲洗心脏15分钟，直至心脏内的血液完全清除。冲洗完成后，关闭双向活塞，将其从三通活塞上断开，并将心脏转移至一个一升容量的耐化学塑料容器中，容器内含500毫升PBS/EDTA溶液。

使用双通道蠕动泵在通风橱内使 PBS/EDTA 溶液在热塑性管路中循环。启动泵管，直至管路中无气泡。然后在室温下以每分钟 80 毫升的流速循环灌注每根冠状动脉插管，持续两小时。

确保通风橱正常运行后，停止泵送，将容器中的溶液排出，并以每分钟80毫升的速度更换为10%福尔马林固定液，固定1小时。使用一系列浓度递增的乙醇对心脏进行灌注，首先用20%乙醇灌注至少3小时，然后将20%乙醇更换为30%乙醇，继续灌注2小时。

每次迭代时逐步增加乙醇浓度，并在每个浓度下至少灌注一小时。为在空气干燥前加固心肌组织，先循环灌注等量的乙醇与六甲基二硅胺烷（HMDS）混合液10分钟，随后再灌注100% HMDS溶液两小时。停止灌注泵后，将套管从管路中断开，并将心脏悬挂在通风橱内的主动脉缝线上。

小心地将一个自封袋套在心脏上，并将封口处压紧在缝线上，以减少心脏暴露于流通空气中的程度。让心脏通过蒸发干燥一周时间。若需进行扩散加载造影剂处理，则移除自封袋。

将心脏在100%乙醇中振荡洗涤15分钟，随后将其浸入含有1% PMA的100%乙醇中，在真空条件下处理48小时。然后按先前所示方法将心脏放入自封袋中，使其干燥。将干燥后的心脏安装到合适的样品台上。为防止在X射线显微CT扫描过程中发生移动，使用固定在样品台上的夹具，并通过已干燥且变硬的主动脉固定心脏。

将样品台安装到微型CT扫描仪中。接着，打开软件并启动X射线微型CT系统。然后将X射线滤光片的铝厚度设置为1毫米。

将X射线源电压设置为60千伏，电流设置为120微安。同时将图像尺寸设置为2,016 × 1,344像素，像素大小设置为20微米。沿支撑物长度方向采集X射线透射的定位图像，以确定心脏纵向轴上的整体成像范围。

扫描时，选择 0.18 度的旋转步长、5 次帧平均，并取消勾选 360 度采集选项，使样品旋转 180 度。选择偏移扫描模式，以成像样品支撑的整个宽度。扫描完成后，使用软件对各向同性的三维图像体进行断层重建。

在最终的重建软件中，使用与采集相关的伪影校正，包括10%的射束硬化效应校正和八级环状伪影减弱。接下来，使用Data Viewer软件对重建的数据堆栈进行可视化。在图像边界内对样本进行数字定向，使样本的长轴和短轴与图像体积的三个主轴重新对齐。

最后，在三个轴向上裁剪图像体积，以去除图像的外部背景层，并最大程度地减小总图像尺寸。对空气干燥的猪心脏进行X射线透射成像，可显示主要解剖标志，包括心室腔和肌壁。三维图像体积的断层重建显示，在心外膜和心内膜边界处，组织与背景之间具有明显的区分。

Masson 三色染色显示，在心外膜下组织的上皮层和内皮层周围血管区域，胶原呈阳性染色。明场照明显示，PMA 染色后胶原结构呈现较深的着色，支持 PMA 的优先积聚。心室组织切片的 PMA 染色荧光图像显示，在胶原部位出现 PMA 诱导的荧光减弱。

若心肌样本在空气干燥前经灌注法使用对比剂染色，图像重建结果显示心肌腔室内染色分布极不均匀。此外，低对比度组织与背景强度之间的区分度较差。对患有慢性心肌梗死的绵羊心脏样本进行显微CT成像，显示出中央致密的纤维化病灶，周围环绕着结构疏松且异质性明显的边界区域。

此处展示了重建图像体积在组织边界和瘢痕区域的最大信号强度。对比剂对健康心肌染色较差，但保留了微结构对比度。在边缘区域，瘢痕组织与存活的心肌交错分布。

致密的纤维化呈透壁性分布，但具有纹理，提示其成分存在差异。经PMA染色的组织切片显示左心室透壁区域中胶原纤维被选择性染色，而存活心肌区域无染色。建议延长乙醇灌注时间，以确保心脏内的水分完全被乙醇置换。

HMDS 与水之间的相互作用会产生热量，可能对样品造成损伤。该方法的一个显著优势在于能够利用组织学技术对显微 CT 成像结果进行验证。空气干燥的样品可直接包埋于石蜡中，用于切片、染色以及显微成像。