用于慢性病大型哺乳动物心脏模型对比增强显影显微计算机断层扫描的组织制备技术

在这里，我们提出了一种方案，以获得健康和病理性的大型哺乳动物全心的高分辨率微计算机断层扫描图像，并具有胶原选择性对比度增强。

该协议使用微机断层扫描在整个器官尺度上提供对结构病理疾病的微观结构见解。在该协议中，实施了一种专门的组织制备方法，以优化人类翻译大型哺乳动物模型中全心脏样品的高分辨率成像，并选择性增强结构疾病。心脏微观结构，如纤维化的分布和兴奋性心肌的组织，是广泛的心脏疾病的基础，并为危及生命的心律失常奠定了基础。

演示该程序的将是Nestor Pallares-Lupon，他是我实验室的博士后和博士毕业生。首先，准备含有肝素钠的心脏不理溶液，并将溶液储存在四摄氏度。接下来，通过首先将EDTA加入一升蒸馏水中以达到10毫摩尔终浓度来制备PBS / EDTA。

然后使用氢氧化钠增加并保持溶液的pH值在12以溶解EDTA。一旦EDTA完全溶解，使用盐酸将pH值降低至7.4。然后加入一个PBS箔袋，得到pH 7.4的0.01摩尔溶液。

将制备的溶液在室温下储存。最后，通过在一升无水乙醇中加入10克PMA来制备1%乙醇PMA造影剂溶液。将制备的溶液在室温下储存。

准备一个支撑在解剖盘上方80厘米的一升储液槽，并将热塑性管耦合到储液槽的排水口。将三通水龙头固定在排水管上，并将进一步的热塑性塑料管连接到三通水龙头上的每个自由端口。将双向水龙头固定在管道的自由端。

接下来，用补充肝素的心脏停滞溶液填充储液。打开水龙头，让心力衰竭溶液排出，去除所有气泡。然后关闭双向点击。

从安乐死动物中提取心脏后，将其置于储存在冰上的冷心律溶液中，直到准备解剖。然后，通过切割五厘米的PTFE管，并通过将尖端放在明火旁边加热一端来为左右冠状动脉骨准备套管。一旦一毫米的尖端开始熔化并变得半透明，将尖端压在坚硬的耐热表面上，在套管尖端处形成脊状，以防止套管滑出容器，然后将每个套管的非加热端的一厘米插入排水管的两端。

接下来，取出主动脉套管，在冷心律溶液下定位冠状动脉的左右骨。使用尖剪刀，小心地将主动脉根部与冠状动脉骨上方和下方的周围组织分开，以便在冠状动脉血管下穿线零轨丝缝线。然后打开双向水龙头并将套管尖端插入冠状动脉骨中。

当套管尖端延伸到骨中一到两厘米并超出缝合线位置时，系上套管。接下来，冲洗心脏，同时轻轻按摩心室15分钟，直到心脏清除血液。冲洗后，关闭双向水龙头，将其与三向水龙头断开连接，然后将心脏转移到装有500毫升PBS / EDTA溶液的一升塑料耐化学容器中。

使用具有两个通道的蠕动泵在通风橱下的热塑性管中再循环PBS / EDTA溶液。给泵管加注，直到管子没有气泡。然后以每分钟80毫升的速度在室温下再循环，通过再循环每个冠状动脉套管。

确保通风柜正常运行后，停止泵，从容器中排出溶液，并用10%福尔马林替换，以每分钟80毫升的速度固定一小时。使用一系列递增的乙醇浓度仔细阅读心脏，从20%乙醇开始至少三个小时。然后将20%乙醇替换为30%乙醇，浸泡两小时。

通过在每次迭代时增加乙醇浓度来继续灌注，每次浓度的最小灌注时间为一小时。为了在空气干燥之前加强心脏组织，再循环乙醇和HMDS的等量混合物10分钟，然后再循环100%HMDS两小时。停止灌注泵，然后将套管与导管断开，并将心脏悬挂在通风室内的主动脉缝合线上。

小心地将拉链锁袋滑过心脏，并在缝合线上关闭袋子密封，以减少心脏暴露于循环空气中。让心脏通过蒸发干燥一周。对于扩散加载造影剂，请取下袋子。

用100%乙醇搅拌将心脏浸泡15分钟，然后将其浸入100%乙醇中，并在真空下补充1%PMA 48小时，然后如前所述用拉链锁袋覆盖心脏并使其干燥。将风干的心形安装到适当的样品架上。为了防止在X射线显微CT测量期间的任何移动，请使用固定在样品架上的夹子，并通过干燥和刚性主动脉固定心脏。

将样品架安装到微型 CT 扫描仪中。接下来，打开软件并启动X射线显微CT系统。然后将X射线滤光片铝设置为一毫米。

X射线源电压为60千伏，电流为120微安。此外，将图像尺寸设置为 2， 016 x 1， 344 像素，将像素大小设置为 20 微米。侦察兵X射线沿支撑长度传输图像，以确定心脏纵向通道的整体成像场。

对于扫描，通过取消选择 360 度采集选项，使用 0.18 度的旋转步长、5 的帧平均和 180 度的样本旋转。选择偏移扫描模式以成像样品支撑的整个宽度。扫描完成后，使用该软件对各向同性三维图像体积进行层析成像重建。

在最终侦察软件中，使用与采集相关的伪像校正，包括光束硬化效果10%和环形伪影减少8个。接下来，使用数据查看器软件，可视化重建的数据堆栈。在图像边界内对样品进行数字定向，以使用图像体积的三个原理a轴重新对齐样品长轴和短轴。

最后，在所有三个轴上裁剪图像体积以删除图像的外部背景层，并最大限度地减小图像总大小。风干猪心脏的X射线透射成像显示主要的解剖学特征，包括心室腔和肌肉壁。三维图像体积的断层重建在心外膜和心内膜边界处显示组织和背景之间存在明显的分离。

梅森的三色染色显示上皮层和内皮层在心外膜组织血管旁的胶原阳性染色。PMA染色后，明场照明在胶原结构中呈现较深的颜色，支持PMA的优先积累。心室组织切片的PMA染色荧光图像具有PMA诱导的胶原位点的荧光损失。

在空气干燥之前用造影剂染色的心脏样本在空气干燥之前通过灌注染色，图像重建显示心肌室内高度斑片状染色。此外，低对比度组织与背景强度的分离效果较差。患有慢性心肌梗死的绵羊部分的显微 CT 成像显示，中心性致密纤维化病变被松散和异质的边界区域包围。

这里显示了在组织边界和瘢痕区域重建的图像体积的最大信号强度。造影剂对健康的心肌染色不良，但保留了微结构造影剂。在边界区，疤痕组织散布着幸存的心肌。

致密纤维化表现为透壁，但质地表明成分存在差异。PMA染色组织制剂的经壁左心室区域显示胶原选择性染色，存活心肌区域无染色。建议使用乙醇延长灌注时间，以确保心脏的含水量与乙醇完全交换。

HMDS与水之间的相互作用会产生热量，这可能会损坏样品。该手术的一个强大优势是能够使用组织学验证显微CT成像。风干样品可以直接嵌入石蜡中，用于切片染色和显微镜成像。