使用三天发育中的雏鸡胚胎生成钩缺血再灌注模型

嗨，我是Syed Shadab Raza博士，干细胞和恢复性神经病学实验室的首席研究员，位于印度勒克瑙时代大学校园生物技术系。在我的实验室中，我们努力了解缺血再灌注障碍背后的病理生理机制以及可以逆转这些过程的干预措施。在这种情况下，我们经常采用缺血性中风的体外和体内模型。

最近，我们在三天发育中的雏鸡胚胎中创建了缺血再灌注损伤模型。现在我的学生将向你们展示 如何在三天发育中的雏鸡胚胎中复制缺血再灌注损伤。现在，我们将向您展示如何在三天的雏鸡胚胎中产生缺血再灌注。

我们的模型具有成本效益，时间有效且高度可重复。让我们开始吧。第一天。

第一天的要求。程序。用薄纸巾用70%乙醇清洁零日鸡蛋。接下来，用OHP标记在鸡蛋上写下当天的日期，然后将鸡蛋放入温度为36至37摄氏度，湿度为60%至65%的鸡蛋孵化器中。

在接下来的24小时内孵育卵。第二天。第二天的要求。程序。

用70%乙醇擦拭手术剪刀或随后用高压灭菌器擦拭。孵化24小时后，将卵子从孵化器中取出以进行分层。接下来，将一小块长和宽约一英寸的Sellotape连接到卵的边缘，然后使用尖尖的边缘剪刀在蛋壳的边缘打一个小孔，然后以大约75度角插入五毫升注射器。

将针头插入蛋黄袋后，慢慢取出五到六毫升白蛋白。取出白蛋白后，用Sellotape重新密封孔，然后将卵放回37摄氏度的鸡蛋培养箱中，持续48小时。第四天。

第四天的要求。程序。按照本手稿中提供的表格准备林格氏溶液，0.9%生理盐水和一个X磷酸盐缓冲盐水。然后高压灭菌三种溶液。

高压灭菌后，可以将相应的溶液置于室温下。接下来，从37度的鸡蛋孵化器中取出鸡蛋。现在，在切割外壳之前，用Sellotape覆盖窗户区域。

现在在蛋壳上打一个小洞，开始切一个圆形的开口。此过程称为窗口化。确保圆形切口足够大，以便胚胎可以从任何方向轻松接近，因为可能需要根据胚胎的位置调整卵子的位置。

现在，使用立体变焦手术显微镜，找到正确的生命线动脉或RVA。在这里，箭头表示胚胎的三天发育阶段。一旦RVA被定位，使用26 G针在RVA的左侧和右侧形成两个小孔。

接下来，将多普勒血流成像探头调整到RVA上。多普勒血流成像探头应放置在距缺血部位5加减1毫米处，放置在RVA远端的三分之二处。根据需要，将通量读数进行30秒至2分钟。

这将使正态氧相读数。现在，在鼻钳的帮助下，手动模塑脊柱针的边缘，使边缘呈钩状，然后是齿镊子。现在，使用微型机械手，将脊髓针插入右生命线动脉下方。

您已准备好抬起脊柱针。现在在微机械手的帮助下，缓慢抬起动脉，直到多普勒血流通量显示动脉流量至少减少80%。一旦多普勒通量达到80%或更高的下降，将脊髓针向上抬起，拉动动脉五分钟。

这将是缺血期。在此缺血时间五分钟后，在微机械手的帮助下缓慢释放动脉，以恢复正常的血流水平。现在，多普勒血流量计应显示与正常氧合期间观察到的读数相似的读数。

这将是RVA中再灌注的时期。在I / R过程之后，将两到三滴1X PBS滴到胚胎上。最后，用Sellotape重新密封窗口，然后将鸡蛋放回鸡蛋孵化器中5小时55分钟。

5小时55分钟后，从鸡蛋孵化器中取出鸡蛋，放到蛋盘上，然后重新打开窗口。治疗要求。程序。为了用药物，激活剂或抑制剂治疗动脉，应在I / R过程一小时后切除RVA。

通过将胚胎从壳中取出到无菌的100毫米培养皿中，将其从壳中取出。一旦胚胎在培养皿中释放，在立体变焦手术显微镜的指导下使用眼部虹膜切除RVA。RVA的切除尺寸应为距躯干远端15加减1毫米，朝向躯干2加减1毫米。

切除RVA后，用1X PBS在新的无菌培养皿中洗涤。对于所需的治疗，将动脉放入充满500微升Ringer溶液的灭菌1.5毫升离心管中。并将动脉放入离心管中后，放入37°C实验室培养箱中五小时。

孵育五小时后，从37摄氏度的实验室培养箱中取出RVA并进行所需的处理。现在，展示结果。为了验证我们的模型在缺血性动脉缺血再灌注研究中的效用，我们首先研究了氧调节蛋白150或ORP150，细胞质超氧化物歧化酶1或SOD1和过氧化氢酶的活性。

与对照组相比，I / R处理的RVA显示出ORP150，细胞质SOD1和过氧化氢酶的活性增加，然而，补充N-乙酰基-L-半胱氨酸或NAC（ROS淬灭剂）降低了I / R组中的氧化应激，如当前图所示。为了确定该模型在炎症研究中的效用，我们研究了I / R-1β和TNF-α在I / R处理的RVA与对照RVA中的表达。与对照组相比，发现两种白细胞介素在Hook-I / R组中均过度表达。

补充柚皮素，一种抗炎药，显着降低了IL1-β和TNF-α的水平。接下来，我们通过蛋白质印迹检查了NLRP3和NF-kappa beta的表达。该分析发现了NLRP3 inflamasome激活的证据，以及NF-kappa beta响应RVA中产生的I / R的证据。

与之前的结果类似，柚皮素降低了NLRP3和NF-kappa beta的表达。这些结果表明，我们的模型可用于研究炎症改变。接下来，我们研究了I / R对细胞凋亡和自噬途径的影响。

首先，在图A中，我们访问了裂解的半胱天冬酶-3的表达。与对照组相比，我们观察到I / R组中切割的半胱天冬酶-3的表达增强，而接受ZVADFMK的I / R组显示半胱天冬酶-3的表达降低。与对照组相比，I / R组表现出高蛋白水平的LC3，自噬体标志物Beclin-1（哺乳动物细胞自噬的关键调节因子）和ATG-7（基础自噬所需的蛋白质），而接受自噬抑制剂3-ma的组显示上述三种自噬蛋白的表达降低， 从图B到D可以看出，图E证明了Hook介导的I / R对ambra-1和ATG-7 mRNA水平的影响。

这些结果与先前的结果一致，即与各自的对照相比，在I / R处理的RVA中观察到ambra-1和ATG-7的mRNA表达增强。然而，当将3-ma添加到I / R组时，结果相反。目前的数字代表了我们的模型研究DNA变化的有效性。

与对照组相比，我们在I / R治疗组中观察到强烈的DNA涂片。然而，对I / R RVA组补充NAC逆转了结果。为了研究我们的模型与其他模型相比的有效性，我们比较了本实验中 Hook-I/R 模型和 MCAO 模型生成的数据。

简而言之，凋亡蛋白，裂解的半胱天冬酶-3，自噬蛋白Beclin-1和ATG-7以及炎症白细胞介素TNF和IFN的表达在I / R处理的RVA中必然高于对照RVA。有趣的是，Hook-I / R模型给出的结果与MCAO模型获得的结果非常相似，无论是炎症应激还是细胞死亡途径的分析。我们的模型可用于常规缺血再灌注实验，无论是单独使用还是与现有模型并行。

然而，在模仿缺血再灌注期间，在RVA的右侧和左侧打孔时，以及在阻塞或释放RVA时，应采取最高的预防措施，使其不会损坏任何动脉或静脉。在常规分子生物学中，如蛋白质印迹，QRT-PCR分析仪，化学酸和成像技术可以即兴发挥，以将与三天发育中的雏鸡胚胎中的缺血再灌注相关的病理生理学联系起来。该模型可以有效地用于研究DNA，RNA和蛋白质水平的分子力学。

正如我们向您展示的那样，I/ R建模在三天发育中的雏鸡胚胎中，我们相信我们的模型将在I / R研究领域开辟新的途径。通过这项工作，我祝愿你们的实验一切顺利。谢谢。