Name: 使用三天发育中的雏鸡胚胎生成钩缺血再灌注模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 5 s
Description: 学习使用三天发育中的雏鸡胚胎建立钩缺血再灌注损伤模型。该方法经济高效且可重复，适用于研究缺血再灌注疾病的病理机制及潜在治疗干预策略。

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我们感谢 Hari Shankar 在摄像和编辑过程中提供的宝贵意见，感谢 Baqer Hussain 先生提供配音，Asghar Rizvi 先生参与视频编辑，Mohammad Haider 先生参与视频拍摄，以及 Mohammad Danish Siddiqui 先生在实验过程中的协助。

印度勒克瑙医学院和医院的机构动物伦理委员会出具了书面豁免声明，指出根据实验动物控制与监督委员会（CPCSEA）的规定，开展这些实验无需正式批准。然而，实验过程中仍遵循标准操作程序，以尽量减少胚胎可能遭受的应激。
1. 缓冲液配制（表1）
<ol>
	<li>配制林格氏液
	<ol>
		<li>配制林格氏液时，将 0.72 g NaCl（123 mM）、0.017 g CaCl2 （1.53 mM）、0.037 g KCl（4.96 mM）溶于 70 mL 无菌蒸馏水 H2O 中，定容至 100 mL。调节 pH 至 7.4。待其完全溶解后进行高压灭菌。然后经 0.22 µm 滤膜过滤，分装成单次使用量（约 10 mL），室温保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制生理盐水（0.9% 氯化钠，NaCl）。
	<ol>
		<li>在 70 mL 无菌蒸馏水 H2O 中溶解 0.9 g NaCl（154 mM），定容至 100 mL。在 121 °C 下高压灭菌 15 分钟。必要时用 0.1 N HCl 或 0.1 N NaOH 调节 pH 至 7.4。分装至 15 mL 无菌离心管中，每管 10 mL，室温保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制 70% 乙醇（v/v）。
	<ol>
		<li>将 70 mL 纯乙醇（分子量 46.07 g/L）与 30 mL 无菌 H2O 混合。按需配制或室温保存。无需灭菌。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制 1× 磷酸盐缓冲液（1× PBS）。
	<ol>
		<li>在 70 mL 蒸馏水中加入 0.144 g Na2HPO4·7H2O（5.37 mM）、0.8 g NaCl（136.8 mM）、0.2 g KCl（26.8 mM）、0.2 g KH2PO4 （14.6 mM），配制 100 mL 1× PBS。溶解后定容至 100 mL，在 121 °C 下高压灭菌 15 分钟。必要时滴加数滴 0.1 N HCl 或 0.1 N NaOH，调节 pH 至 7.4。分装至 15 mL 无菌离心管中，每管 10 mL，室温保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 第1天
<ol>
	<li>准备卵子消毒所需的所有工具（70% 乙醇、擦拭纸、卵架和 OHP 记号笔）。</li>
	<li>使用纸巾蘸取 70% 乙醇清洁 0 日龄卵。仅使用 0 日龄卵，因为较老的卵可能无法发育成胚胎。</li>
	<li>用 OHP 记号笔在卵上标注当前日期。</li>
	<li>将卵放入孵卵器中，温度设置为 36–37 °C，湿度设置为 60%–65%。继续孵育 24 小时。</li>
</ol>
3. 第2天
<ol>
	<li>准备抽取5-6 mL蛋清所需的必要器械（锋利的剪刀、5 mL注射器、18 G针头、注射器销毁器和胶带）。</li>
	<li>用70%乙醇擦拭手术剪，或在用70%乙醇擦拭后使用高压灭菌器进行灭菌。</li>
	<li>从37 °C的蛋孵箱中取出鸡蛋，准备进行分层操作。</li>
	<li>将鸡蛋放置在干净的蛋架上。</li>
	<li>在鸡蛋边缘贴上一小段胶带（尺寸约为1英寸长×宽）。</li>
	<li>使用尖头剪刀在蛋壳边缘开一个小孔。以大约75°的角度插入5 mL注射器。 
	注意：5 mL注射器通常配有24 G × 1针头（无菌），但建议将24 G × 1针头更换为18 G × 1.5针头（无菌）。18 G × 1.5针头的规格为1.25 × 38 mm，更有利于蛋清的抽取。</li>
	<li>将针头插入卵黄囊后，缓慢抽出5-6 mL蛋清。 
	注意：此举可为胚胎提供一个利于生长的空间。在开窗过程中，抽出蛋清可防止蛋清溢出，同时通过移除5-6 mL蛋清，降低开窗时损伤胚胎的风险。</li>
	<li>抽取蛋清后，用胶带重新封闭开口，并将鸡蛋置于37 °C孵育48小时。</li>
</ol>
4. 第4天
<ol>
	<li>按照方案第1节所述配制林格氏液、0.9%生理盐水和1×PBS。然后对这三种溶液进行高压灭菌。灭菌后，将各溶液置于室温下备用。</li>
	<li>从37 °C的孵蛋箱中取出鸡蛋，将蛋壳切割成圆形。在切割蛋壳前，先用胶带覆盖需要切割的区域。 
	注意：用胶带覆盖开窗区域可防止蛋壳在非预期位置破裂。如果发生非预期破裂，应立即用胶带封住该区域。在切割部位贴上胶带可防止蛋壳碎片落入卵黄囊上。</li>
	<li>使用尖头剪刀在希望开窗的位置于蛋壳上刺一个小孔，然后开始切割出一个圆形开口。此过程称为“开窗”。 
	注意：确保圆形切口足够大，以便从任意方向都能方便地接触胚胎。如有需要，可调整鸡蛋的位置以适应胚胎的方位。</li>
	<li>接下来，使用体视变倍手术显微镜定位右侧卵黄动脉（RVA）。 
	注意：鸡胚在发育过程中通常会发生胸段扭转（伴随颈段弯曲等），因此在72小时阶段，头部左侧会紧贴卵黄。而在更尾侧、卵黄动脉从体腔穿出的区域，胚胎扭转程度较小，该部分身体腹侧朝下贴近卵黄。因此，从正上方观察时，胚胎的右侧位于研究者的右侧。</li>
	<li>确定RVA位置后，使用26 G针头在RVA左右两侧各制造两个小孔（图2）。</li>
	<li>将多普勒血流成像探头置于RVA上方。确保多普勒血流成像探头距离缺血部位5 ± 1 mm，并朝向RVA的远端。持续采集血流信号2分30秒（或根据需要更长时间）。此为常氧相读数。</li>
	<li>同时，使用尖嘴钳和有齿镊子，将脊髓穿刺针的尖端手工塑造成钩状（图3）。通过将脊髓穿刺针尖端弯曲约1 mm完成此操作。若弯曲尺寸过大，在缺血/再灌注（I/R）操作过程中插入和取出穿刺针将更加困难。</li>
	<li>使用显微操作仪将脊髓穿刺针直接插入右侧卵黄动脉下方。 
	注意：插入脊髓穿刺针时需极为小心，避免损伤RVA或邻近血管。最佳操作方法是：在体视变倍手术显微镜引导下，借助显微操作仪，将定制设计的穿刺针钩端精确调整至RVA右侧孔的正上方，然后逐渐将穿刺针的定制边缘经右孔插入卵黄囊内。当穿刺针钩进入卵黄囊后，逐步调整钩的位置使其位于RVA下方，并确保其边缘精确置于左侧孔下方。此时即可进行抬升操作。</li>
	<li>现在，在显微操作仪辅助下，逐渐抬高动脉，直至多普勒血流信号显示动脉血流减少至少80%。</li>
	<li>当多普勒血流信号下降达到80%或以上时，保持脊髓穿刺针抬升状态（向上牵拉动脉）5分钟。此阶段即为RVA的缺血期。 
	注意：在缺血期间必须持续监测多普勒血流信号。若发现显著波动，应立即终止实验。</li>
	<li>5分钟缺血期结束后，逐渐释放动脉以恢复正常的血流水平。确保多普勒血流仪读数恢复至与常氧期相当的水平。此阶段即为RVA的再灌注期（图4）。</li>
	<li>完成I/R操作后，向胚胎滴加少量（2–3滴）1×PBS，并观察2–3分钟。 
	注意：使用1×PBS有助于防止胚胎干燥。</li>
	<li>最后，用胶带重新密封开窗部位，并将鸡蛋放回孵蛋箱中继续孵育5小时55分钟。</li>
	<li>5小时55分钟后，从孵蛋箱中取出鸡蛋，放置于蛋架上，重新打开窗口，并按照后续处理方案进行操作。</li>
</ol>
5. 处理方法
<ol>
	<li>在对动脉进行药物、激活剂或抑制剂处理时，于I/R过程1小时后切除RVA。</li>
	<li>对于后续研究，首先将胚胎从蛋壳中取出，并置于无菌的90 mm培养皿中。</li>
	<li>一旦胚胎被释放至培养皿中，在体视变倍手术显微镜引导下，使用眼科虹膜剪切除RVA。</li>
	<li>确保RVA的切除范围为距躯干远端15 ± 1 mm，动脉左右两侧各5 ± 1 mm，朝向躯干方向2 ± 1 mm。 
	注意：可使用刻度尺测量待切除区域（可选）。</li>
	<li>切除RVA后，将其置于含有1x PBS的无菌培养皿中，用1x PBS清洗。</li>
	<li>进行所需处理时，将动脉放入装有500 µL林格氏液的无菌1.5 mL离心管中。将RVA放入离心管，并置于37 °C培养箱中孵育5小时55分钟。 
	注意：根据具体处理要求，可使用未添加任何处理成分的林格氏液，或加入所需体积和浓度的药物、激活剂或抑制剂的林格氏液。</li>
	<li>孵育5小时55分钟后，从37 °C实验室培养箱中取出RVA，继续进行所需的处理步骤。</li>
</ol>

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<li>Ashafaq, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catechin+hydrate+ameliorates+redox+imbalance+and+limits+inflammatory+response+in+focal+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Catechin hydrate ameliorates redox imbalance and limits inflammatory response in focal cerebral ischemia.</a> Neurochemical Research. 37 (8), 1747-1760 (2012).</li>
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</ol>

作者声明无竞争利益。

缺血-再灌注研究的目标是开发出能够防止细胞死亡并促进恢复的治疗策略29,30为克服当前缺血/再灌注研究中的局限，我们设计了一种钩状装置&#160;I/R 鸡胚模型，用于建立可靠且可重复的缺血/再灌注模型。据我们所知，这是首次在发育第3天的鸡胚中创建可用于常规缺血/再灌注实验的模型，此外还可用于研究应激信号（如氧化应激和炎症应激）。鉴于第3天发育阶段鸡胚在体积和操作可及性方面的优势31，采用发育72小时的鸡胚，因为该模型具有产量高、操作简便以及适用于常规分析的优点32简而言之，在发育第3天， 在卵内 鸡胚是一种在蛋内高度可控、易于获取且具有适度透明性的模型，可用于观察正常生理过程、疾病病理学特征以及实验性治疗的效果。其较大的体积使其在研究正常生理状态及应激条件下胚胎的形成与行为方面尤为有用33尽管可以使用较晚发育阶段的鸡胚（孵化4天或更长时间的鸡胚），我们也曾尝试...

缺血-再灌注组织损伤与多种病理状态相关，包括心肌梗死、缺血性卒中、创伤以及外周血管疾病1,2,3,4,5。这主要是由于对疾病进展缺乏全面的理解，以及缺乏有效的研究模型。当组织特定区域的血液供应被切断时，就会发生缺血性损伤。结果，缺血组织最终会发生坏死，尽管坏死速率因组织类型而异。因此，恢复血液供应可能有助于减轻损伤。然而，已有观察发现，在某些情况下，再灌注造成的组织损伤比单纯缺血更为严重6,7,8。因此，为了开发有效的治疗干预措施，有必要深入了解缺血-再灌注的分子和细胞机制。目前尚无已知的有效治疗方法可用于I/R损伤。这一差距促使研究人员建立了从体外到体内的各种新型实验模型，以应对这一现有难题9,10,11,12,13。
鸡胚胎（Gallus gallus domesticus）因其易于获取、伦理可接受性高、相对体型较大（与其他胚胎相比）、成本低以及生长迅速等特点，被广泛应用于科研领域14。我们采用发育72小时的鸡胚胎，通过脊髓针阻断并再开放右侧卵黄动脉，建立体内缺血-再灌注（in ovo I/R）模型&#160;。该模型被命名为Hook-I/R缺血-再灌注模型（图1）。本研究所采用的模型能够准确模拟与缺血-再灌注损伤密切相关的各种下游过程，包括氧化应激和炎症通路15,16,17。

<table><tbody><tr><td>(-80&amp;deg;C) 冷冻箱</td><td>Haier，中国</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>TARSONS，印度</td><td>500010X</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 培养皿（无菌）</td><td>Tarsons，印度</td><td>460050</td><td></td></tr><tr><td>18G 针头（18G&amp;times;1.5（1.25&amp;times;38 mm）</td><td>Ramsons，印度</td><td>13990</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 注射器</td><td>DISPO VAN</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>26G 针头（26G&amp;times;1/2（10.45×13 mm）</td><td>DISPO VAN，印度</td><td>30722D</td><td></td></tr><tr><td>37&amp;deg;C 恒温孵育箱（湿度可调）</td><td>Gentek，印度</td><td>GL-100</td><td></td></tr><tr><td>37&amp;deg;C 实验室恒温箱</td><td>SCIENCE TECH，印度</td><td>CB 101-14</td><td></td></tr><tr><td>3-甲基腺嘌呤（3-MA）</td><td>Sigma Aldrich，美国</td><td>M9281</td><td></td></tr><tr><td>3 mL 巴氏吸管</td><td>TARSONS，印度</td><td>940050</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 烧杯</td><td>TARSONS，印度</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 注射器</td><td>DISPO VAN，印度</td><td>IP53</td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>Merck Millipore，美国</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>胶带/透明胶带</td><td>Sunrise，印度</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Ambra1 引物</td><td>Applied Biosystems，福斯特城，美国</td><td>Hs00387943_m1</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 IgG</td><td>Cell Signaling Technology，美国</td><td>7076S</td><td></td></tr><tr><td>抗兔 IgG</td><td>Jackson Immuno Research Laboratories，美国</td><td>711-035-152</td><td></td></tr><tr><td>Atg7</td><td>R&amp;D Systems，美国</td><td>MAB6608</td><td></td></tr><tr><td>Atg7 引物</td><td>Applied Biosystems，福斯特城，美国</td><td>Hs00893766_m1</td><td></td></tr><tr><td>高压灭菌袋</td><td>Tarsons，印度</td><td>550022</td><td></td></tr><tr><td>高压灭菌器</td><td>本地制造，勒克瑙，印度</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Beclin-1</td><td>Proteintech，美国</td><td>66665-1-Ig</td><td></td></tr><tr><td>β-肌动蛋白</td><td>ImmunoTag，美国</td><td>ITT07018</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Himedia，孟买，印度</td><td>TC194</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Himedia，孟买，印度</td><td>GRM534</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢酶</td><td>ImmunoTag，美国</td><td>ITT5155</td><td></td></tr><tr><td>清洁湿巾</td><td>Kimberly-Clark，印度</td><td>370080</td><td></td></tr><tr><td>活化型 Caspase3</td><td>ImmunoTag，美国</td><td>ITT07022</td><td></td></tr><tr><td>七水合磷酸氢二钠</td><td>Himedia，孟买，印度</td><td>GRM39611</td><td></td></tr><tr><td>多普勒血流仪</td><td>Moors instrument，英国</td><td>moorVMS-LDF1</td><td></td></tr><tr><td>蛋架</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>蛋架</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>ImmunoTag，美国</td><td>M1000110</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH 引物</td><td>Applied Biosystems，福斯特城，美国</td><td>Hs02758991_g1</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Himedia，孟买，印度</td><td>MB013</td><td></td></tr><tr><td>肾形盘</td><td>HOSPITO</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>LC3A/B</td><td>Cell Signaling Technology，美国</td><td>4108S</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Rankem laboratories，孟买，印度</td><td>M0252</td><td></td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>Narishige，日本</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）</td><td>Sigma Aldrich，美国</td><td>A7250</td><td></td></tr><tr><td>柚皮素</td><td>Sigma Aldrich，美国</td><td>67604-48-2</td><td></td></tr><tr><td>NF-κ&amp;beta;</td><td>Thermo Fisher Scientific，美国</td><td>51-0500</td><td></td></tr><tr><td>NLRP3</td><td>ImmunoTag，美国</td><td>ITT07438</td><td></td></tr><tr><td>尖嘴钳</td><td>本地制造，勒克瑙，印度</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>眼科镊</td><td>Stoelting，德国</td><td>52106-40</td><td></td></tr><tr><td>眼科虹膜剪</td><td>Tufft Surgical Instruments，斋浦尔，印度</td><td>Hard Age Vannas 微型弯头剪 8 cm / 3 1/8&quot;</td><td></td></tr><tr><td>透明胶片记号笔</td><td>Camlin，印度</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>ORP-150</td><td>ImmunoTag，美国</td><td>ITT08329</td><td></td></tr><tr><td>尖头锐边剪刀</td><td>Stoelting，德国</td><td>52132-11</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Himedia，孟买，印度</td><td>MB043</td><td></td></tr><tr><td>无水磷酸二氢钾</td><td>Himedia，孟买，印度</td><td>MB050</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂</td><td>Abcam，美国</td><td>Ab65621</td><td></td></tr><tr><td>SOD-1</td><td>ImmunoTag，美国</td><td>ITT4364</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Scientific，孟买，印度</td><td>27605</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Himedia，孟买，印度</td><td>GRM886</td><td></td></tr><tr><td>25G 脊髓穿刺针；3.50 英寸（90.51 × 90 mm）</td><td>Ramson，印度</td><td>GS-2029</td><td></td></tr><tr><td>立体变焦手术显微镜</td><td>Olympus，日本</td><td>SZ2-STU3</td><td></td></tr><tr><td>注射器销毁盒</td><td>BIOHAZARD</td><td>882210</td><td></td></tr><tr><td>齿镊</td><td>Stoelting，德国</td><td>52102-30</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>G Biosciences，美国</td><td>RC1217</td><td></td></tr><tr><td>Tris 盐酸</td><td>Himedia，孟买，印度</td><td>MB030</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>G Biosciences，美国</td><td>RC1227</td><td></td></tr><tr><td>白来航鸡 0 日龄鸡蛋</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Z-Val-Ala-Asp(OMe)-FMK</td><td>MP Biomedicals, LLC，美国</td><td>FK009</td><td></td></tr></tbody></table>

利用三天发育期鸡胚建立钩状缺血-再灌注模型

Generation of Hook Ischemia-Reperfusion Model using a Three-Day Developing Chick Embryo

缺血与再灌注（I/R）损伤，如心肌梗死、脑卒中和外周血管疾病，是导致疾病和死亡的主要原因之一。许多 体外 和 体内 目前已有多种模型可用于研究疾病或受损组织中的缺血/再灌注（I/R）机制。然而，迄今为止，尚无 在卵内 已有研究报道了缺血/再灌注（I/R）模型，该模型有助于更好地理解I/R的机制并加速药物筛选。本文描述了一种利用改良脊柱穿刺针制成的钩状工具，在3日龄鸡胚中建立I/R模型的方法，以研究I/R的发生发展及治疗机制。本模型可用于在DNA、RNA和蛋白质水平上探究相关异常变化。该方法操作简便、快速且成本低廉。本模型既可独立使用，也可与现有模型联合应用。 体外 和 在体 I/R 模型。

采用多普勒血流成像技术评估我们模型的有效性。简言之，我们比较了对照组与RVA组的数据，以确定模型构建的成功程度。图4A展示了对照组动物典型的血流信号，而图4B展示了来自RVA的实验结果。数字1-8代表与缺血/再灌注（I/R）各阶段相关的不同事件。其中，数字1-3对应于常氧阶段；在第3和第4点处血流信号急剧下降，代表RVA中血流减少的相关事件。当血流下降达到80%或以上时，保持RVA抬高状态持续5分钟，此阶段即为缺血期（数字4-5）。在持续抬高5分钟后，释放RVA，该过程由数字6和7表示。从第7点开始的血流信号代表再灌注阶段，即RVA恢复至正常血流水平后的阶段。本实验结果表明，在孵化3天的鸡胚中成功实现了缺血/再灌注（I/R）模型的构建。
为了验证本模型的有效性，我们通过ELISA、蛋白质印迹、qRT-PCR和凝胶电泳分析，研究了蛋白质、RNA和DNA的表达模式。简言之，我们将培养3天的卵分为三组实验组：对照组、I/R组以及治疗+I/R组。在各自的I/R组与对照组之...

本文介绍了一种利用定制的脊髓针钩在3天龄鸡胚中建立缺血-再灌注（I/R）模型的方法，以更深入地理解I/R的发生机制及治疗方法。该模型操作简便、快速且成本低廉。

缺血与再灌注（I/R）损伤，如心肌梗死、脑卒中和外周血管疾病，是导致...的主要原因之一

您好，我是赛义德·沙达布·拉扎博士，印度北方邦勒克瑙市Era大学校区生物技术系干细胞与修复神经病学实验室的首席研究员。在我的实验室中，我们致力于研究缺血-再灌注障碍背后的病理生理机制，以及能够逆转这些过程的干预手段。在此背景下，我们经常采用缺血性脑卒中的体外和体内模型。最近，我们在发育三天的鸡胚中建立了缺血-再灌注损伤模型。现在，我的学生将向您展示如何在发育三天的鸡胚中复制缺血-再灌注损伤。接下来，我们将向您演示如何在三天龄鸡胚中建立缺血-再灌注损伤模型。我们的模型具有成本效益高、节省时间且高度可重复的优点。现在就开始吧。第一天。第一天所需条件。操作步骤：使用擦拭纸巾蘸取70%乙醇清洁零日龄鸡蛋。随后，用OHP记号笔在鸡蛋上标注当天日期，然后将鸡蛋放入温度为36至37摄氏度、湿度为60%至65%的蛋类孵化箱中。将卵孵育接下来的24小时。第二天。第二天所需材料。实验步骤。用70%乙醇擦拭手术剪，或随后进行高压灭菌。培养24小时后，将鸡蛋从培养箱中取出用于分层操作。接着，取一小块约一英寸长宽的透明胶带，贴在鸡蛋边缘，然后用尖头剪刀在蛋壳边缘剪出一个小孔，再以约75度角插入一支5 mL注射器。将针头插入卵黄囊后，缓慢抽出5至6 mL的蛋清。去除蛋清后，用透明胶带重新封住小孔，并将鸡蛋放回37摄氏度的孵卵器中，继续孵化48小时。第四天。第四天所需条件。操作步骤：根据本文提供的表格配制林格氏液、0.9%生理盐水和一种X磷酸盐缓冲液，然后对这三种溶液进行高压灭菌。高压灭菌后，可将各溶液置于室温下。接下来，从37度的孵蛋箱中取出鸡蛋。现在，在切割蛋壳之前，先用透明胶带覆盖开窗区域。现在在蛋壳上开一个小孔，然后开始切割出一个圆形的开口。此过程称为开窗。确保圆形切口足够大，以便能够从任意方向方便地接触到胚胎，因为可能需要根据胚胎的位置调整蛋的摆放位置。现在，使用体视变倍手术显微镜定位右侧卵黄动脉（RVA）。此处箭头指示胚胎发育的第三天阶段。一旦定位到RVA，使用26 G针头在RVA左右两侧各刺两个小孔。接下来，将多普勒血流成像探头调整至RVA处。多普勒血流成像探头应放置在距离缺血部位5±1毫米、RVA远端三分之二的位置。根据需要，采集30秒至2分钟的血流读数。这将完成常氧阶段的读数。现在，使用鼻钳配合齿镊，手动将脊髓穿刺针的尖端弯曲成钩状。接着，利用显微操作器，将脊髓穿刺针插入右侧玻璃体动脉下方。现在可以抬起脊髓针。在显微操作仪的辅助下，缓慢抬起动脉，直至多普勒血流信号显示动脉血流减少至少80%。当多普勒血流信号下降达到80%或以上时，保持脊髓针处于抬起状态，持续牵拉动脉五分钟。这将是缺血期。在持续五分钟的缺血后，借助显微操作器缓慢松开动脉，以恢复正常的血流水平。此时，多普勒血流仪的读数应与常氧状态下观察到的数值相似。这将是RVA中的再灌注阶段。I/R过程结束后，向胚胎中加入一至三滴1×PBS。最后，用透明胶带重新封好窗口，然后将鸡蛋放回孵卵器中继续孵育5小时55分钟。5小时55分钟后，从孵蛋器中取出鸡蛋，放置于蛋托上，并重新打开窗口。处理要求。操作步骤：对动脉进行药物、激活剂或抑制剂处理时，应在缺血/再灌注（I/R）过程1小时后切除RVA。将胚胎从蛋壳中取出，置于无菌的100 mm培养皿中。一旦胚胎被释放到培养皿中，即在体视变倍手术显微镜的引导下，使用眼科虹膜剪切除右侧体节动脉（RVA）。RVA的切除范围应自躯干远端起始，向躯干方向延伸，长度为15 ± 1 mm，宽度为2 ± 1 mm。切除RVA后，在新的无菌培养皿中用1× PBS冲洗。根据所需处理，将动脉放入装有500微升任氏液的无菌1.5毫升离心管中。将动脉放入离心管后，置于37摄氏度的实验室培养箱中孵育5小时。孵育5小时后，从37摄氏度的实验室培养箱中取出RVA，并进行所需的处理。接下来展示结果。为了验证我们的模型在缺血性动脉缺血-再灌注研究中的应用价值，我们首先检测了氧调节蛋白150（ORP150）、细胞质超氧化物歧化酶1（SOD1）和过氧化氢酶的活性。与对照组相比，经I/R处理的RVAs显示出ORP150、胞质SOD1和过氧化氢酶活性增加；然而，补充ROS清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）可降低I/R组的氧化应激水平，这一点在当前图中可以明显看出。为了验证该模型在炎症研究中的应用价值，我们检测了I/R处理组与对照组RVAs中I/R-1β和TNF-α的表达水平。结果显示，与对照组相比，Hook-I/R组中这两种白细胞介素均呈过表达状态。补充抗炎药物柚皮素（Naringenin）显著降低了IL1-β和TNF-α的水平。接下来，我们通过蛋白质印迹法检测了NLRP3和NF-κB的表达。该分析发现，在RVA中由缺血/再灌注（I/R）引起的NLRP3炎性小体以及NF-κB的激活证据。与之前的结果类似，柚皮素降低了NLRP3和NF-kappa beta的表达。这些结果表明，我们的模型可用于研究炎症变化。接下来，我们检测了缺血/再灌注（I/R）对细胞凋亡和自噬通路的影响。首先，在图A中，我们检测了cleaved caspase-3的表达水平。与对照组相比，I/R组中cleaved caspase-3的表达显著增强，而接受ZVADFMK处理的I/R组则表现出caspase-3表达的下降。在自噬方面，I/R组中自噬体标志物LC3、哺乳动物细胞自噬关键调控因子Beclin-1以及基础自噬所必需的蛋白ATG-7的蛋白水平均高于对照组；而接受自噬抑制剂3-MA处理的各组中，上述三种自噬相关蛋白的表达均降低，如图B至图D所示。图E展示了Hook介导的I/R对ambra-1和ATG-7 mRNA水平的影响。这些结果与先前的结果一致，即与各自的对照组相比，在经 I/R 处理的 RVAs 中，ambra-1 和 ATG-7 的 mRNA 表达增强。然而，当向 I/R 组添加 3-ma 后，结果发生逆转。当前图像表明了我们模型在研究 DNA 改变方面的有效性。与对照组相比，我们观察到I/R处理组出现了明显的DNA弥散条带。然而，在I/R RVA组中补充NAC后，该现象得以逆转。为了评估我们的模型相较于其他模型的有效性，本实验中我们将Hook-I/R模型与MCAO模型所产生的数据进行了比较。简而言之，与对照组RVAs相比，经I/R处理的RVAs中凋亡相关蛋白caspase-3剪切产物、自噬相关蛋白Beclin-1和ATG-7，以及炎症性细胞因子TNF和IFN的表达水平均显著升高。有趣的是，无论是在炎症应激还是细胞死亡通路的分析中，Hook-I/R模型所得结果均与MCAO模型高度相似。本研究建立的模型可用于常规的缺血-再灌注实验，既可单独使用，也可与现有模型平行使用。然而，在模拟缺血-再灌注过程中，制作 RVA 左右两侧的孔洞以及夹闭或松开 RVA 时，必须采取最高程度的预防措施，以避免损伤任何动脉或静脉。在常规分子生物学实验中，可灵活运用 Western 印迹、实时定量 PCR 分析仪、化学酸类试剂及成像技术，以研究三日龄发育中鸡胚缺血-再灌注相关的病理生理机制。该模型可有效用于在 DNA、RNA 和蛋白质水平上研究分子机制。正如我们向您展示的，在发育三天的鸡胚中建立的缺血/再灌注（I/R）模型，我们相信该模型将为I/R研究领域开辟新的途径。通过这项工作，我们衷心祝愿您在实验中取得成功。谢谢。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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