利用三天发育期鸡胚建立钩状缺血-再灌注模型

您好，我是赛义德·沙达布·拉扎博士，印度北方邦勒克瑙市Era大学校区生物技术系干细胞与修复神经病学实验室的首席研究员。在我的实验室中，我们致力于研究缺血-再灌注障碍背后的病理生理机制，以及能够逆转这些过程的干预手段。在此背景下，我们经常采用缺血性脑卒中的体外和体内模型。

最近，我们在发育三天的鸡胚中建立了缺血-再灌注损伤模型。现在，我的学生将向您展示如何在发育三天的鸡胚中复制缺血-再灌注损伤。接下来，我们将向您演示如何在三天龄鸡胚中建立缺血-再灌注损伤模型。

我们的模型具有成本效益高、节省时间且高度可重复的优点。现在就开始吧。第一天。

第一天所需条件。操作步骤：使用擦拭纸巾蘸取70%乙醇清洁零日龄鸡蛋。随后，用OHP记号笔在鸡蛋上标注当天日期，然后将鸡蛋放入温度为36至37摄氏度、湿度为60%至65%的蛋类孵化箱中。

将卵孵育接下来的24小时。第二天。第二天所需材料。实验步骤。

用70%乙醇擦拭手术剪，或随后进行高压灭菌。培养24小时后，将鸡蛋从培养箱中取出用于分层操作。接着，取一小块约一英寸长宽的透明胶带，贴在鸡蛋边缘，然后用尖头剪刀在蛋壳边缘剪出一个小孔，再以约75度角插入一支5 mL注射器。

将针头插入卵黄囊后，缓慢抽出5至6 mL的蛋清。去除蛋清后，用透明胶带重新封住小孔，并将鸡蛋放回37摄氏度的孵卵器中，继续孵化48小时。第四天。

第四天所需条件。操作步骤：根据本文提供的表格配制林格氏液、0.9%生理盐水和一种X磷酸盐缓冲液，然后对这三种溶液进行高压灭菌。

高压灭菌后，可将各溶液置于室温下。接下来，从37度的孵蛋箱中取出鸡蛋。现在，在切割蛋壳之前，先用透明胶带覆盖开窗区域。

现在在蛋壳上开一个小孔，然后开始切割出一个圆形的开口。此过程称为开窗。确保圆形切口足够大，以便能够从任意方向方便地接触到胚胎，因为可能需要根据胚胎的位置调整蛋的摆放位置。

现在，使用体视变倍手术显微镜定位右侧卵黄动脉（RVA）。此处箭头指示胚胎发育的第三天阶段。一旦定位到RVA，使用26 G针头在RVA左右两侧各刺两个小孔。

接下来，将多普勒血流成像探头调整至RVA处。多普勒血流成像探头应放置在距离缺血部位5±1毫米、RVA远端三分之二的位置。根据需要，采集30秒至2分钟的血流读数。

这将完成常氧阶段的读数。现在，使用鼻钳配合齿镊，手动将脊髓穿刺针的尖端弯曲成钩状。接着，利用显微操作器，将脊髓穿刺针插入右侧玻璃体动脉下方。

现在可以抬起脊髓针。在显微操作仪的辅助下，缓慢抬起动脉，直至多普勒血流信号显示动脉血流减少至少80%。当多普勒血流信号下降达到80%或以上时，保持脊髓针处于抬起状态，持续牵拉动脉五分钟。

这将是缺血期。在持续五分钟的缺血后，借助显微操作器缓慢松开动脉，以恢复正常的血流水平。此时，多普勒血流仪的读数应与常氧状态下观察到的数值相似。

这将是RVA中的再灌注阶段。I/R过程结束后，向胚胎中加入一至三滴1×PBS。最后，用透明胶带重新封好窗口，然后将鸡蛋放回孵卵器中继续孵育5小时55分钟。

5小时55分钟后，从孵蛋器中取出鸡蛋，放置于蛋托上，并重新打开窗口。处理要求。操作步骤：对动脉进行药物、激活剂或抑制剂处理时，应在缺血/再灌注（I/R）过程1小时后切除RVA。

将胚胎从蛋壳中取出，置于无菌的100 mm培养皿中。一旦胚胎被释放到培养皿中，即在体视变倍手术显微镜的引导下，使用眼科虹膜剪切除右侧体节动脉（RVA）。RVA的切除范围应自躯干远端起始，向躯干方向延伸，长度为15 ± 1 mm，宽度为2 ± 1 mm。

切除RVA后，在新的无菌培养皿中用1× PBS冲洗。根据所需处理，将动脉放入装有500微升任氏液的无菌1.5毫升离心管中。将动脉放入离心管后，置于37摄氏度的实验室培养箱中孵育5小时。

孵育5小时后，从37摄氏度的实验室培养箱中取出RVA，并进行所需的处理。接下来展示结果。为了验证我们的模型在缺血性动脉缺血-再灌注研究中的应用价值，我们首先检测了氧调节蛋白150（ORP150）、细胞质超氧化物歧化酶1（SOD1）和过氧化氢酶的活性。

与对照组相比，经I/R处理的RVAs显示出ORP150、胞质SOD1和过氧化氢酶活性增加；然而，补充ROS清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）可降低I/R组的氧化应激水平，这一点在当前图中可以明显看出。为了验证该模型在炎症研究中的应用价值，我们检测了I/R处理组与对照组RVAs中I/R-1β和TNF-α的表达水平。结果显示，与对照组相比，Hook-I/R组中这两种白细胞介素均呈过表达状态。

补充抗炎药物柚皮素（Naringenin）显著降低了IL1-β和TNF-α的水平。接下来，我们通过蛋白质印迹法检测了NLRP3和NF-κB的表达。该分析发现，在RVA中由缺血/再灌注（I/R）引起的NLRP3炎性小体以及NF-κB的激活证据。

与之前的结果类似，柚皮素降低了NLRP3和NF-kappa beta的表达。这些结果表明，我们的模型可用于研究炎症变化。接下来，我们检测了缺血/再灌注（I/R）对细胞凋亡和自噬通路的影响。

首先，在图A中，我们检测了cleaved caspase-3的表达水平。与对照组相比，I/R组中cleaved caspase-3的表达显著增强，而接受ZVADFMK处理的I/R组则表现出caspase-3表达的下降。在自噬方面，I/R组中自噬体标志物LC3、哺乳动物细胞自噬关键调控因子Beclin-1以及基础自噬所必需的蛋白ATG-7的蛋白水平均高于对照组；而接受自噬抑制剂3-MA处理的各组中，上述三种自噬相关蛋白的表达均降低，如图B至图D所示。图E展示了Hook介导的I/R对ambra-1和ATG-7 mRNA水平的影响。

这些结果与先前的结果一致，即与各自的对照组相比，在经 I/R 处理的 RVAs 中，ambra-1 和 ATG-7 的 mRNA 表达增强。然而，当向 I/R 组添加 3-ma 后，结果发生逆转。当前图像表明了我们模型在研究 DNA 改变方面的有效性。

与对照组相比，我们观察到I/R处理组出现了明显的DNA弥散条带。然而，在I/R RVA组中补充NAC后，该现象得以逆转。为了评估我们的模型相较于其他模型的有效性，本实验中我们将Hook-I/R模型与MCAO模型所产生的数据进行了比较。

简而言之，与对照组RVAs相比，经I/R处理的RVAs中凋亡相关蛋白caspase-3剪切产物、自噬相关蛋白Beclin-1和ATG-7，以及炎症性细胞因子TNF和IFN的表达水平均显著升高。有趣的是，无论是在炎症应激还是细胞死亡通路的分析中，Hook-I/R模型所得结果均与MCAO模型高度相似。本研究建立的模型可用于常规的缺血-再灌注实验，既可单独使用，也可与现有模型平行使用。

然而，在模拟缺血-再灌注过程中，制作 RVA 左右两侧的孔洞以及夹闭或松开 RVA 时，必须采取最高程度的预防措施，以避免损伤任何动脉或静脉。在常规分子生物学实验中，可灵活运用 Western 印迹、实时定量 PCR 分析仪、化学酸类试剂及成像技术，以研究三日龄发育中鸡胚缺血-再灌注相关的病理生理机制。该模型可有效用于在 DNA、RNA 和蛋白质水平上研究分子机制。

正如我们向您展示的，在发育三天的鸡胚中建立的缺血/再灌注（I/R）模型，我们相信该模型将为I/R研究领域开辟新的途径。通过这项工作，我们衷心祝愿您在实验中取得成功。谢谢。