利用双光子显微镜定量分析单侧输尿管慢性梗阻对肾小球结构的影响

本研究中呈现的数据展示了单侧输尿管梗阻对肾功能、炎症及纤维化的显著影响，有助于我们理解单侧输尿管梗阻的病理生理机制。该技术的主要优势在于能够在一个功能正常的肾脏内，动态地研究细胞间相互作用、亚细胞事件以及结构与功能之间的关联。

输尿管手术操作将由本实验室的外科医生 Silvia Campos-Bilderback 博士进行演示。首先，对大鼠实施麻醉，然后沿腹中线做切口，找到左肾并将其与周围腹膜器官分离。找到包含肾动脉、肾静脉和输尿管的肾蒂后，小心分离输尿管，避免损伤其精细结构。

使用镊子将3-0缝线环绕输尿管并打结，然后在第一个结的两侧各数毫米处再打一个结，以确保完全阻塞。输尿管结扎后，仔细逐层缝合肌肉层，随后完全闭合腹腔。使用外科缝钉闭合皮肤外层。

手术准备时，将带有留置静脉通路的麻醉大鼠侧卧放置，左侧腹侧剃毛面朝上，平直地置于实验台上。确保大鼠的前肢相互接触，后肢也应如此。大鼠体位固定后，于肋骨下方轻触左侧腹侧，触摸肾脏位置，确定其在腹腔内的自然解剖位置，然后使用永久性记号笔沿剃毛区域画一条线，沿头尾方向平分肾脏中心。

使用带齿镊子夹住并向上提起皮肤，同时用止血钳夹紧永久标记线，压碎下方的血管组织以防止出血。对薄的外层肌肉层重复此操作，以尽量减少出血。为了完成对薄的内侧腹肌层的切口，先触诊肾脏以估计其大小和位置，然后用一对镊子提起内侧肌肉层，再用止血钳压碎位于肾脏上方皮肤中线处的一条线，该线长度约为估计肾脏大小的三分之一。

在用镊子夹住肌层的同时，进行最终切口。接着，双手各持镊子，采用交替递进的手法，夹住并固定肾脏下极的肾周脂肪，向下操作。用一只手牢固夹住脂肪后，牵拉脂肪，并轻轻挤压肾脏，使其从切口处缓慢娩出。

如果肾脏未完全通过，可轻松扩大切口。为了识别滞留在毛细血管环中的白细胞（WBC），通过留置的静脉通路以每千克大鼠体重8微克的剂量给予Hoechst 33342核染色剂。在显微镜下，将暴露的肾脏轻轻旋转并紧贴培养皿边缘放置，使肾脏的腹侧接触盖玻片，背侧朝向远离边缘的方向。

为进一步减少移动，将两块用生理盐水浸湿的无菌 2×2 纱布垫紧贴肾脏背侧，以加强肾脏腹侧与边缘的接触。样本定位后，在落射荧光照明下，使用双通道罗丹明-FITC 滤光片通过显微镜目镜观察。若发现样本位置有移动，可通过调整纱布进行微调，注意避免纱布推入肾脏下方。

将大鼠略微翻转，使胸腔远离培养皿。使用落射荧光照明扫描肾脏表面，并利用与电动载物台控制器配套的软件标记肾小球的位置。在双光子照明下，针对每个荧光通道，对每个已标记肾小球的上部区域采集浅层三维图像，作为背景图像。

在成像软件的显示选项中，使用伪彩调色板来可视化肾小球毛细血管袢背景荧光的微弱信号。以一条表浅的血管作为焦点，缓慢灌注荧光标记的Texas Red RAP血清白蛋白（TRRSA），同时观察由于全身分布引起的荧光信号升降，直至肾小管周围血管和毛细血管袢的荧光强度接近但未达到饱和。10分钟后，以1微米为间隔，采集所有标记并成像的肾小球的三维图像数据。

选择一个合适的血管，可以是毛细血管袢或管周血管，然后使用旋转功能旋转图像，因为图像采集软件中的线扫描功能要求血管呈垂直状态。待血管旋转至水平位置后，在采集菜单中选择XT功能，并设置为扫描4,000行。将扫描线置于待检测血管上方，焦平面位于该血管节段最大直径处。

接下来，左键单击彩色复合图像，选择“拍摄快照”选项卡，以生成线扫描区域的参考图像。随后立即点击“开始”按钮，捕获血管的线扫描图像。之后，将线扫描数据导入图像处理软件，以确定红细胞流速。

在“测量”下拉菜单中，打开“显示区域统计”对话框，选择“单线绘制”工具，绘制一条与红细胞阴影斜率相匹配的直线。记录该直线的宽度和高度后，利用公式计算速度，然后对五次计算结果取平均值，以报告每条扫描线的速度。将肾小球置于成像视野中央，采集三维数据集，起始于肾小球表面，终止于30至35微米深度处。

在Z方向上使用1微米的步长。通过比较蓝色Hoechst通道与Texas Red白蛋白通道，观察毛细血管环中红色染料的排除情况以及相应的细胞核染色，从而识别白细胞（WBCs）。如果白细胞在连续三个光学切片中保持静止，则将其定义为已黏附细胞，并以每10个光学切片（从肾小球顶部开始，以1微米间隔采集）中的出现次数报告结果。

Munich Wistar Fromter（MWF）大鼠在单侧输尿管梗阻5周后，每视野肾小球数量较未治疗大鼠增加。Sprague-Dawley（SD）大鼠在单侧输尿管梗阻5周后，肾表面小球由无变为每视野2.02个。通过观察三维重建图像来评估肾脏表面。

在SD大鼠中，5周单侧输尿管梗阻未形成类似正常肾小管上皮的区域，而这种区域在MWF大鼠、未治疗组以及部分5周UUO MWF大鼠中可见。在肾血管动力学研究中，与未治疗大鼠相比，5周UUO MWF大鼠和SD大鼠的肾血流量显著降低。与未治疗的MWF大鼠相比，5周UUO MWF大鼠和SD大鼠肾小球毛细血管袢内的红细胞流速显著减慢。

此外，未经处理的MWF大鼠在顶部10个光学切片中每单位的白细胞（WBC）数量较少，而在5周单侧输尿管梗阻（UUO）的MWF大鼠和5周UUO的SD大鼠中，该数量增加。在单侧输尿管梗阻情况下，观察到白蛋白通透性增加，并且在单侧输尿管梗阻后，肾小囊腔内出现明显的白蛋白积聚。

在未治疗的MWF大鼠中，S1节段在生理条件下可大量内吞白蛋白。然而，在MWF或SD大鼠经历5周单侧输尿管梗阻后，这种摄取现象则无法观察到。该技术可与其他多种方法联合使用，例如重复成像以随时间研究某一过程、对特定区域进行固定后成像，以及随后利用固定组织进行更高分辨率的显微镜观察。

该技术被认为是一种颠覆性技术，使研究人员能够回答许多新的科学问题。在此过程中，获得了新的见解，并取得了范式转变性的数据。