Name: 使用2光子显微镜量化慢性单侧输尿管梗阻对肾小球过程的影响 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: 了解双光子显微镜技术如何量化慢性单侧输尿管梗阻对肾小球功能的影响。本研究使用Munich Wistar Fromter大鼠模型，实时观察细胞相互作用与肾脏病理生理机制，为肾脏疾病研究提供重要数据。

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本研究工作由美国国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所资助，资助编号为RO1DK091623和P30DK079312（授予B.A.M.）。我们感谢密歇根州立大学研究技术支撑设施（RTSF）基因组学核心实验室工作人员完成Nanostring分析。

所有实验均遵循《实验动物护理和使用指南》，并经印第安纳大学医学院动物护理与使用委员会批准。
1. 准备用于UUO手术的Munich Wistar Frömter或SD大鼠
<ol>
	<li>使用异氟烷（5%诱导，1.5-2.5%维持）对大鼠进行麻醉，然后以碘伏或氯己定消毒液和酒精对手术区域进行多次环形剃毛、清洗和消毒。根据机构IACUC指南，给予长效/缓释镇痛剂以进行疼痛管理。</li>
	<li>使用手术刀沿正中线做切口；找到左肾，并将其从周围腹膜器官中分离出来。</li>
	<li>仔细辨认肾蒂结构，其包括肾动脉、肾静脉和输尿管。将输尿管与其他结构分离时需格外小心，避免损伤其脆弱组织。</li>
	<li>使用精细镊子，小心地将3-0缝线环绕输尿管一周并打结结扎，注意避免撕裂。在第一个结的两侧数毫米处重复此操作，打第二个结以确保完全阻塞。</li>
	<li>完成操作后，逐层仔细缝合肌肉层。在关闭最外层前，向腹腔内注入2 mL温热的无菌0.9%氯化钠溶液，然后完全闭合切口。使用外科缝钉关闭皮肤。</li>
	<li>给予长效/缓释镇痛剂以进行疼痛管理，并根据机构IACUC指南密切观察恢复情况。之后定期监测，并在第五周末准备进行影像学检查。</li>
</ol>
2. 德州红标记大鼠血清白蛋白（TR-RSA）的合成
<ol>
	<li>称取100 mg大鼠血清白蛋白，溶于50 mL锥形管中的6.67 mL pH 8.4的0.1 M碳酸氢钠缓冲液中。</li>
	<li>向含有5 mg德克萨斯红-X-琥珀酰亚胺酯的试剂瓶中加入100 µL高质量二甲基甲酰胺（DMF），涡旋至染料完全溶解。</li>
	<li>将大鼠血清白蛋白溶液置于涡旋振荡器上，调节至低/中速，使溶液在敞口管内充分旋转但不触及管口。</li>
	<li>在持续涡旋的同时，加入已溶解的染料。</li>
	<li>取50 mL锥形管，用铝箔包裹，置于摇床或滚轴混合器上，室温（RT）缓慢振荡反应1小时。</li>
	<li>在装有磁力搅拌子并处于轻柔搅拌状态的5 L 0.9% NaCl溶液桶中，润湿适当规格的50 kDa分子量截留膜透析器膜片（带夹子的膜、封闭式膜管或透析夹具均可使用）。</li>
	<li>将TR-RSA溶液装入膜系统中，并连接至系统配套的浮力固定装置。将装有0.9%氯化钠溶液和TR-RSA的5 L容器置于4 °C冷藏室内的搅拌板上，轻柔搅拌过夜。在接下来的36小时内至少更换三次透析液。</li>
	<li>膜溶胀将导致澄清的TR-RSA溶液体积增加。用初始100 mg除以最终体积，可估算其浓度：此时染料与蛋白的摩尔比为1:1。分装至合适体积后冻干，以长期保存。</li>
</ol>
3. 在倒置显微镜上进行双光子活体成像的准备工作
<ol>
	<li>取下直径为50 mm、底部带有40 mm盖玻片的培养皿盖，在内底边缘周围放置8块高压灭菌胶带。每侧使用4块胶带形成一个金字塔形状的空窗区域，使外置的肾脏能够紧密地嵌入该空间，同时通过周边与高压灭菌胶带接触，从而有助于最大限度减少组织移动。根据大鼠体型调整胶带间距，以确保肾脏获得最佳贴合接触。</li>
	<li>在50 mm盖玻片底部培养皿的两侧各放置1个加热垫。确保加热垫覆盖显微镜载物台。</li>
	<li>使用40倍水浸物镜，配合0.75倍和1.5倍缩放，分别获得30倍和60倍的图像，以实现低倍与高倍放大成像。如有需要，使用带有长段PE-200管的1 mL注射器，以向下倾斜的角度将水滴加至物镜顶部，防止水滴沿管壁被虹吸流失。</li>
	<li>设置激光透射率为2%，并将蓝色、绿色和红色探测器调节至预设水平，以确保不同实验间图像的一致性。在所引用的激光器（见材料表）上将激发波长设为800 nm，可高效激发本研究中使用的所有荧光染料。
	<ol>
		<li>使用外部（非扫描型）探测器，通过光电倍增管（PMT）收集蓝色发射光（420–490 nm，增益950）。</li>
		<li>使用HyD探测器采集绿色发射光（500–550 nm，增益100）。</li>
		<li>使用HyD探测器采集红色发射光（590–660 nm，增益200）。</li>
		<li>调节PMT（蓝色发射光）的偏移量，使组织空白区域中仅有少数像素的强度值为零。 
		注：绿色和红色发射光的HyD探测器具有自动偏移调节功能，仅可设置增益。</li>
		<li>将位深设为12位，使图像在黑色与白色之间具有4,096级灰度强度。 
		注：必须正确设置探测器的下限（PMT中的偏移量），避免排除低强度信号，以确保采集到肾小囊腔内的微弱荧光发射。若灵敏度设置过低，系统会通过视觉警告标记提示；此类信号将被赋予零强度值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将约6 mg Texas-Red-X-Rat Serum Albumin稀释至终体积1 mL，将溶液装入1 mL注射器中，并在步骤9.1注入Hoechst 33342后，通过步骤4.1中已置入的静脉导管进行给药。</li>
</ol>
4. 活体双光子成像的手术准备
<ol>
	<li>将已预先麻醉且带有留置静脉通路（股静脉或颈静脉）的大鼠侧卧放置，腹部左侧剃毛区域朝上，平直置于实验台上。确保其前肢相互接触，后肢 likewise 保持接触。</li>
	<li>轻轻触诊肋骨下方的左侧 flank 区域，以感知肾脏位置，确定其在腹腔内的自然位置。如有需要，使用永久性标记笔在剃毛区域沿头尾方向画一条线，平分肾脏中心。</li>
	<li>使用一对带齿镊子夹住皮肤并向上提起，以便用止血钳夹住永久性标记线，压闭皮下血管，从而在使用手术剪进行切口时防止出血。对薄的外层肌肉组织重复此操作，以减少出血。</li>
	<li>为完成对薄层腹内肌的最终切口，需再次触诊肾脏以估计其大小和位置。用一对镊子小心提起腹内肌层，并用止血钳在肾脏上方皮肤处夹压出一条约1/3长度的切割线，使其贯穿该区域rd 肾脏的估计大小</li>
	<li>用镊子夹住肌层并保持稳定，进行最后的切口。 
	注意：最好先做一个较小的切口，然后根据需要逐步扩大，避免切口过大而需要用缝线部分关闭。</li>
	<li>用镊子轻轻夹住肾脏周围的脂肪组织。双手各持一把镊子，采用交替递进的手法，从肾脏下极开始夹住并固定脂肪组织，逐步向下操作。</li>
	<li>用一只手牢固地抓住肾脏下极的脂肪组织，轻轻牵拉脂肪，如有需要，可非常轻柔地通过切口挤压肾脏。如果肾脏不能顺利通过切口，可适当扩大切口。</li>
</ol>
5. 将大鼠摆放到成像位置
<ol>
	<li>将暴露的肾脏轻轻贴住培养皿边缘放置，稍作旋转，使肾脏的腹侧接触盖玻片，背侧则朝向远离边缘的方向。</li>
	<li>为进一步减少移动，取两块无菌的 2 × 2 纱布，用生理盐水润湿后，紧贴于肾脏背侧进行填塞，以加强肾脏腹侧与皿缘的接触稳定性。</li>
	<li>在落射荧光照明下，使用双通道Rhodamine/FITC滤光片组，通过显微镜目镜观察。若发现组织移动，可微调肾脏位置，并小心调整纱布，确保其不会滑入肾脏下方。为进一步减少运动，可将大鼠身体稍作翻转，使胸腔部分略微远离培养皿。</li>
</ol>
6. 定量分析的图像采集
<ol>
	<li>使用落射荧光照明（步骤 5.3）扫描肾脏表面，并利用与电动载物台控制器配套的软件标记肾小球的位置（现代系统具备此功能）。</li>
	<li>在双光子照明下，对每个荧光通道，采集每个已标记肾小球上部的浅层三维图像，作为背景图像。在成像软件的 显示 选项中使用伪彩调色板，以更清晰地观察肾小球毛细血管袢背景荧光的微弱信号。</li>
	<li>以表层血管为焦点，缓慢输注荧光标记白蛋白，留出足够时间观察因全身分布导致的荧光信号上升与下降过程。输注足量的 TR-RSA，使管周血管和毛细血管袢的荧光强度达到接近但未达到饱和的水平。 
	注意：当肾脏灌注正常时，通常在输注物质后约 5 秒才会在血液中检测到该物质。</li>
	<li>在步骤 6.2 中对所有已标记并成像的肾小球，等待约 10 分钟后，开始采集三维图像（层厚 1 µm）。 
	注意：Simonsen 的慕尼黑 Wistar 大鼠表面肾小球数量较少；而 Frömter 品系的 MW 大鼠表面肾小球较多，通常可对多达 10 个肾小球进行成像。</li>
	<li>研究结束时，通过过量吸入异氟烷处死大鼠，并实施双侧气胸以确认动物死亡。</li>
</ol>
7. 计算肾小球通透性
<ol>
	<li>使用显微镜系统配套的图像浏览软件，将图像导出为12位原始图像，用于后续处理与分析。</li>
	<li>加载背景三维图像数据和含有循环荧光白蛋白的原始三维图像数据。在三维图像中定位到肾小球内表层毛细血管袢最亮的焦平面，并确保该位置与周围鲍曼氏囊边缘之间有足够的空间。</li>
	<li>利用视觉标志物，在背景图像的三维数据中定位到相同的焦平面。在毛细血管袢内选择一个区域，同时在鲍曼氏腔内选择另一个区域，记录每个区域的平均强度值，并将这些强度值用作背景值。</li>
	<li>在含有白蛋白的图像中，于鲍曼氏腔内勾画一个区域（面积至少为20 × 20像素），记录其强度读数（应选择不邻近毛细血管袢或鲍曼氏囊的区域，以确保对鲍曼氏腔强度的最纯净测量）。将所绘制的区域移至另外两个不同位置，取三个测量值的平均值作为鲍曼氏腔内的平均强度。</li>
	<li>在毛细血管袢区域中选择最亮的血浆荧光强度区域，并用圆圈标出。使用阈值功能突出显示高亮度值（通常位于毛细血管壁边缘），避开循环红细胞的阴影，并记录该数值。 
	注意：由于血液中的某些因素会导致血浆荧光水平被低估，因此选择最亮区域至关重要。</li>
	<li>将上述数值输入电子表格，使用公式（1）计算肾小球选择性系数（GSC）： 
	GSC = <img alt="静态平衡公式；显示强度计算方法的方程；数学过程。" src="/files/ftp_upload/63329/63329eq01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 1"> （1）</li>
</ol>
8. 使用线扫描功能计算肾小球表层毛细血管环和肾血管系统中的红细胞流动
<ol>
	<li>选择一个合适的血管（毛细血管环或管周血管）。由于所引用的图像采集软件中的linescan功能要求血管必须垂直，因此请使用rotate功能旋转图像（参见材料表）。</li>
	<li>当血管被旋转至水平后，在acquisition菜单中选择XT功能。设置扫描4,000行。将扫描线横跨待检测的血管；确保成像节段的最大直径处于焦平面位置。</li>
	<li>在彩色复合图像上左键单击，选择Take Snapshot，以生成linescan扫描区域的参考图像。随后立即点击Start按钮，开始采集该血管的linescan图像。</li>
	<li>为测定红细胞（RBC）流速，将linescan图像导入图像处理软件（参见材料表）。在Measure下拉菜单中打开Show Region Statistics对话框。选择单线绘制工具，绘制一条与红细胞阴影斜率相匹配的直线。记录该直线的宽度和高度数值。 
	注：宽度对应的像素值代表距离；高度对应的像素值代表时间。</li>
	<li>使用以下公式（公式（2））计算流速。 
	红细胞流速（µm/s）= <img alt="基于像素的测量公式示意图：(宽度像素 × 0.379 µm) / (高度像素 × 0.0025 s)。" src="/files/ftp_upload/63329/63329eq02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 2"> （2） 
	注：该公式对应于所引用显微镜系统在60倍放大倍数和400 Hz扫描速率下的采集参数（参见材料表）。
	<ol>
		<li>对每条linescan至少进行五次计算并取平均值，作为最终报告的流速。 
		注：这些参数取决于显微镜系统的像素尺寸和采集速度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. 计算白细胞在肾小球毛细血管袢中的阻塞情况
<ol>
	<li>通过留置的静脉通路以约 8 µg/kg 大鼠体重的剂量注射 Hoechst 33342 核染料，以识别滞留在毛细血管袢中的白细胞。 
	注意：由于血红蛋白对光子的散射和吸收，尤其是对较短波长的蓝光发射，成像可用深度将受到限制。</li>
	<li>将肾小球置于成像视野中央，采集三维数据集，起始于肾小球表面，并至少深入至 30 至 35 µm 处结束。Z 方向步长设为 1 µm。</li>
	<li>通过比较蓝色 Hoechst 通道与 Texas Red 标记的白蛋白通道来识别白细胞；在毛细血管袢中观察红色染料的排除区域，并对应出现细胞核染色，以此明确鉴定白细胞。若白细胞在连续 3 个光学切片中保持静止，则定义为“黏附”。结果以每 10 个光学切片（从肾小球顶部开始，每隔 1 µm 取一个切片）中白细胞出现的频率表示。</li>
</ol>
10. 对肾小球表面红细胞缗钱状排列的评分
<ol>
	<li>按照步骤9.3的相同方法操作，获取三维数据集。观察红细胞呈串钱状聚集的形态，即红细胞堆叠成簇，在沿毛细血管袢移动时仍保持聚集不分散。使用红色荧光染料可更好地显示深层结构，因为较长波长的红光发射光子散射较少。结果以肾小球顶部每25个光学切片中的出现次数表示，切片间隔为1 µm。</li>
</ol>
11. 肾小球的分离
<ol>
	<li>采用标准过筛法从新鲜肾脏中分离三组肾小球，所得大鼠肾小球纯度接近90%15.
	<ol>
		<li>将肾皮质置于冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS）中，使用多把精细剪刀或剃刀片切碎。</li>
		<li>将切碎的组织加入到一个 100 µm 使用无菌细胞滤网，并用5 mL注射器活塞及50-100 mL冷PBS轻柔推压过滤。 
		注意：大多数肾小管被保留，而肾小球则通过。</li>
		<li>将富集的肾小球组分置于 70 µm 过滤并用大量冷PBS洗涤。用100–200 mL冷PBS冲洗滤膜，以去除残留的大部分小管。</li>
		<li>使用1-2 mL冷的PBS从滤器中收集肾小球，离心（10,000 × g，2 分钟， 4 °C）并立即在液氮中速冻，待进行RNA提取。 
		注：通过相差显微镜确定的肾小球纯度为 &gt;90%，每2个肾脏的产量约为10 mg。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
12. 肾小球 RNA 提取
<ol>
	<li>使用RNA提取试剂，通过加入该试剂对冷冻的肾小球沉淀进行匀浆处理 400 µL 试剂的加入以及用以破坏沉淀物的操作 200 µL 移液枪头，随后短暂涡旋并室温孵育5分钟16.</li>
	<li>添加 40 µL 加入1-溴-3-氯丙烷（BCP），涡旋15秒，室温孵育15分钟。</li>
	<li>在 12,000 × g，15 分钟， 4 °C. 移除水相层，将下层用等体积的70%乙醇稀释，然后直接上样至离心柱中（参见 材料列表).</li>
	<li>洗涤后，每次均向柱中加入相应溶液，随后在12,000 x g，15 秒， 26 °C [共3个，前2个带有 500 µL RPE（含有乙醇的专有温和洗涤缓冲液，用于去除盐分残留，3rd 用……洗涤 500 µL 80% EtOH]，通过加入 15 µL H的2O并离心，洗涤步骤相同。检测RNA的浓度和纯度，并将RNA样本运送至核心实验室进行Nanostring分析17,18. 
	注意：总 RNA 产量约为 1-2 µg. 此处，24个样品各含有30 ng/μL浓度的RNA，总量为200 ngµL.</li>
</ol>
13. Nanostring 分析
注意：Nanostring 技术基于对目标分子的数字检测和直接分子条形码技术，该技术利用颜色编码的探针对。捕获探针（Capture probe）在其 3' 端携带一个生物素基团，而报告探针（Reporter probe）在其 5' 端携带信号。
<ol>
	<li>将 Nanostring 基因探针对和 CodeSets 运送至密歇根州立大学基因组核心设施，并按照 NanoString 公司的说明使用。 
	注意：颜色编码共有六个位置，每个位置可呈现四种颜色之一，从而实现大量多样化的标签，可在数据采集过程中被单独分辨和识别。</li>
	<li>使用专有的 Nanostring nCounter 数字分析仪获取基因组核心设施工作人员收集的数据，该仪器通过显微镜物镜和 CCD 相机采集视野图像，并对条形码计数进行统计和显示。</li>
	<li>将原始数据导入 Nanostring 的 nSolver 软件进行分析。使用其默认设置对数据进行标准化处理，并按照其用户手册中的说明对各组间数据进行比较。 
	注意：本实验的目的是监测先前已在单侧输尿管梗阻（UUO）模型19、肾脏疾病17,20,21,22,23,24,25,26的皮质组织中被证实发生改变的基因变化。在每组肾小球（CONT、SHAM 和 UUO）中，共分析了 126 个基因，包括推荐的阳性和阴性对照基因。</li>
</ol>

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</ol>

作者无利益冲突。

肾小球生理学的研究已采用多种不同方法，其中最显著的包括微穿刺技术、离体肾小球灌流以及显微镜观察。Munich Wistar 大鼠的 Fromter 和 Simonsen 品系具有表层肾小球，这一特点使得 在体 动态研究。采用该技术的研究人员需要注意的一点是，必须设置采集参数，以保持不同研究之间图像的一致性，从而使组织中的自发荧光保持稳定。使用双通道荧光素/罗丹明落射荧光滤光片组，并调节绿色和红色发射通道的增益设置，以在计算机屏幕上模拟目镜中所见的图像，可确保不同显微镜系统之间自发荧光的颜色特征一致。
Fromter品系被广泛使用，因其肾小球总数减少，约为正常的75%，雄性大鼠在约12周龄时会自发性发展为高血压，并逐渐出现蛋白尿及局灶性肾小球硬化，最终因肾功能衰竭死亡12。这些大鼠的应用，结合双光子显微镜技术所具有的光毒性低、穿透深度更佳以及可同时观察多种荧光探针的优势，为新的科学发现铺平了道路1,4,5。随着计算机硬件和软件的发展，定量数据现已成为所有双光子实验室的标准。多种定量技术已被开发并应用于生理和疾病状态下肾小球、近端小管、血管及间质过程的研究1,4,5,27,28,29,30。
转基因小鼠制备技术为肾脏生理学与病理学研究开辟了新的维度，而将这一技术与双光子显微镜相结合，以进一步阐明特定基因产物在肾脏结构与功能中的重要作用，只是时间问题。然而，除幼龄小鼠外，小鼠肾小球通常位于肾脏表面下超过100 µm的深度9。双光子显微镜成像最适深度为20至50 µm，超过此深度后，由于发射光的散射以及血红蛋白对光的吸收，分辨率和荧光强度会迅速下降。因此，有必要诱导出位于浅表的肾小球。目前常用的方法是建立持续12周的单侧输尿管梗阻模型。然而，这类模型无法进行基线指标的测定，因而难以区分单侧输尿管梗阻（UUO）本身的影响与所研究过程之间的效应差异。
利用MWF大鼠，可以将基线肾小球功能与单侧输尿管梗阻（UUO）后的功能进行比较。已知该UUO模型可诱导炎症反应并迅速发生纤维化，已被用于慢性肾病（CKD）和纤维化的研究10,11,12。正如预期，MWF大鼠和SD大鼠的肾表面肾小球数量均有所增加。此外，MWF大鼠与SD大鼠在UUO处理后的定量结果非常相近。此处记录到的血流减少此前已有报道，通过显微成像数据与微穿刺数据的比较得以证实3。众所周知，肾小管和间质组织学发生显著改变，近端小管（PTs）大多失去功能，正如本文所述，表现为白蛋白内吞作用缺失。图2和图3中的研究显示，肾小球和管周毛细血管中的红细胞（RBC）流速显著降低，同时白细胞（WBC）黏附增强。血流减少可能归因于白细胞黏附及缗钱状红细胞聚集所导致的毛细血管阻塞。
为了进一步评估炎症程度，我们量化了白蛋白通透性，结果显示其增加了十倍。此外，分离的肾小球显示，许多已知在多种肾脏疾病状态下肾内炎症会升高的基因，其mRNA表达也出现上调17,19,20,21,22,23,24,25,26。肾小球表面密度和白蛋白通透性的增加呈进行性发展，12周的单侧输尿管梗阻（UUO）数据已证实了这一点。本研究首次直接证明，在UUO模型中，肾小球会发生显著的结构损伤、炎症反应及分子水平改变。该结果与先前一项针对全肾组织的研究一致，该研究通过对单侧输尿管梗阻后绵羊肾活检样本的分析，发现多种炎症标志物升高19。本研究结果表明，肾小球内存在明显炎症，而此前此类炎症仅在皮质组织中被发现。
目前的数据与早期在小鼠中的研究结果不同，早期研究发现12周后肾积水肾小球与正常肾小球在黏附分子表达、补体沉积以及中性粒细胞浸润方面均无变化31。此外，Hickey实验室曾采用12周单侧输尿管梗阻（UUO）模型研究小鼠肾小球的免疫反应，他们发现4周龄小鼠肾小球与梗阻后肾小球在中性粒细胞浸润方面亦无差异32,33。这些后续研究是在阻塞肾脏的肾盂排空尿液后进行的。我们未进行此类操作，目的是为了评估UUO对肾小球功能的影响，即在未人为移除导致梗阻的液体的情况下，模拟其在体（in vivo）的真实状态。最后，目前在小鼠中使用UUO模型正逐渐被成像深度超过100 µm的肾小球成像技术所取代。尽管该技术可行，但存在分辨率和信号强度的权衡问题，当成像深度超过50 µm时，两者均会显著下降34。
如果将现有文献中关于组织学改变、无小管性肾小球形成、炎症、纤维化及血流动力学的数据综合起来，本文呈现的结果并不令人意外10,11,12。本文提供的数据，包括白细胞黏附、红细胞缗钱状聚集、肾小球分子炎症标志物以及白蛋白通透性增加，进一步表明在此单侧输尿管梗阻（UUO）模型中，即使在五周时仍存在广泛的持续性炎症，且在十二周时依然可见。显然，慢性 UUO 并非生理状态，利用 UUO 诱导出现表浅肾小球的方法实际上是一种损伤模型。MWF 大鼠在生理条件下即具有表浅肾小球，因此可在损伤发生过程中对其进行纵向研究。目前有可能构建转基因大鼠，许多研究人员正在利用生物传感器构建此类大鼠以回答特定科学问题。特别是，威斯康星医学院现已建立了一个 MWF 大鼠种群，并已成功培育出转基因大鼠，用于研究生理和病理条件下肾小球的相关过程。这些 MWF 大鼠为研究正常、疾病状态以及基因修饰大鼠中的肾小球过程提供了极佳的机会。

了解肾小球过程，特别是足细胞生物学，一直是过去50多年的研究目标。具有表层肾小球的慕尼黑维斯塔大鼠在这些研究中发挥了核心作用，包括通过微穿刺技术研究生理和病理过程的多个方面1,2,3。由于光毒性的影响，利用显微镜对肾小球组分进行活体观察曾受到限制，直到双光子显微镜的出现，显著降低了这种毒性暴露并提高了成像穿透深度1,2。结合计算机硬件和软件的快速进步，现已能够在单次实验中持续数小时进行三维（3D）和四维（时间）动态研究1,4,5。
肾小球毛细血管血流、对药物刺激产生的血管收缩与舒张反应、通透性，以及电荷对通透性和炎症的影响等肾小球生理过程均已得到研究。此外，近端小管的S1节段可被识别，且S1与S2小管上皮细胞行为的差异亦可被定量分析1,4。在小鼠中开展的研究，尤其是随着小鼠转基因技术的广泛应用，极大地推动了人们对肾小球疾病分子生物学机制的理解。在基因敲除研究中，特定蛋白被证实与肾小球功能障碍相关，尤其在蛋白尿的发生中起关键作用6,7,8。然而，由于在已研究的多个小鼠品系中，肾小球位于组织表面下超过100 µm的深度，限制了其在肾小球成像研究中的应用9。
这促使研究人员开发并利用小鼠模型，以获得可用于研究的表面肾小球。最常见的模型是完全性单侧输尿管梗阻（UUO）10,11,12。在延长的UUO阶段结束后，小鼠肾脏中会出现大量可用于研究的表面肾小球13,14。然而，在这些小鼠研究中，尚无基线或对照研究来确定长期UUO对肾小球生物学的影响。由于这是一种严重且持续时间较长的损伤模型，会导致快速的纤维化和皮质破坏10,11,12，我们推测其会对肾小球的生理过程和功能产生影响。为回答这一问题，我们采用具有表面肾小球的Munich Wistar Fromter（MWF）大鼠来研究对照/基线参数，并将该基线结果与MWF大鼠在经历五周UUO后的肾小球研究结果进行比较。此外，我们还研究了在UUO后不具有表面肾小球的Sprague Dawley（SD）大鼠。研究结果表明，MWF和SD大鼠在经历5周UUO后，表面肾小球数量确实增加。然而，这些肾小球存在异常，表现出肾小球血流、炎症反应以及大分子通透性和尺寸的显著改变。

<table><tbody><tr><td>70 &amp;micro;m 无菌细胞滤筛</td><td>Corning</td><td>#421751</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;micro;m 无菌细胞滤筛</td><td>Corning</td><td>#421752</td><td></td></tr><tr><td>CA 微型剪刀型号 1C300</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>货号# 72930</td><td></td></tr><tr><td>电热垫</td><td>Sunbeam</td><td>Kroger</td><td></td></tr><tr><td>操作镊子</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>货号# 72962</td><td></td></tr><tr><td>Kelly 止血镊（直型）</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>货号#72930</td><td></td></tr><tr><td>Leica Dive SP-8 多光子倒置显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>注：版本 7.1r1</td><td></td></tr><tr><td>MaiTai DeepSee 钛宝石激光器</td><td>Spectra-Physics</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>梅奥组织剪</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>货号# 78180-1C3</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph 图像处理软件</td><td>Molecular Dynamics</td><td>货号# 78266-04</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft Corportation</td><td>2007 版本</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT RNA 检测试剂盒</td><td>Invitrogen/ThermoFisher</td><td>Q33140</td><td></td></tr><tr><td>Reptitherm 底部加热垫</td><td>Zoomed</td><td>Amazon</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MinElute 纯化试剂盒（离心柱）</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>RPE 缓冲液</td><td>Qiagen</td><td>1018013</td><td></td></tr><tr><td>Strate-Line 高压灭菌指示胶带</td><td>Fisher Scientific</td><td>货号# 11-889-1</td><td></td></tr><tr><td>TRI 试剂</td><td>Sigma</td><td>T9424</td><td></td></tr><tr><td>Willco-dish 盖玻片底培养皿（50 mm/40 mm 盖玻片）</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>货号# 70665-07</td><td></td></tr></tbody></table>

利用双光子显微镜定量分析单侧输尿管慢性梗阻对肾小球结构的影响

Using 2-Photon Microscopy to Quantify the Effects of Chronic Unilateral Ureteral Obstruction on Glomerular Processes

将新型显微技术应用于合适的动物疾病模型以探索肾脏的动态生理过程仍然是一项挑战。具有表层肾小球的大鼠为利用活体双光子显微镜研究生理和病理生理过程提供了独特的机会。肾小球毛细血管血流、药物诱导的血管收缩与舒张、通透性以及炎症反应等过程均可在此模型中进行量化研究。此外，转基因大鼠（例如，足细胞被荧光染料标记）及其他分子生物标志物技术的应用，可进一步提高分辨率，从而直接监测并量化蛋白质-蛋白质相互作用以及特定分子改变所产生的效应。
在小鼠中，出生四周后即缺乏表层肾小球，因此常通过单侧输尿管结扎（UUO）数周来诱导表层肾小球的形成。由于该诱导模型无法进行基线研究，我们在慕尼黑维斯特大鼠弗勒姆特品系（MWF）大鼠中量化了UUO对肾小球过程的影响，该品系在生理状态下具有表层肾小球。持续五周或更长时间的UUO模型导致肾脏大体形态、肾小管周围及肾小球微血管系统，以及肾小管上皮细胞结构与功能发生显著改变。肾小球和肾小管周围的红细胞（RBC）血流显著减少（p &#60; 0.01），这可能是由于白细胞（WBCs）在肾小球和肾小管周围毛细血管中的黏附显著增加所致。白蛋白的肾小球筛过系数从未经处理的MWF大鼠的0.015 ± 0.002上升至5周UUO处理MWF大鼠的0.045 ± 0.05。持续12周的UUO进一步增加了表层肾小球密度以及白蛋白的肾小球筛过系数（GSC）。经肾小球滤过的荧光标记白蛋白未被近端小管重吸收。这些数据表明，利用UUO诱导表层肾小球会限制对正常肾小球功能及疾病相关改变进行研究和解释的能力。

本文介绍了一种利用双光子显微镜在具有表层肾小球的慕尼黑维斯塔大鼠中定量研究长期输尿管梗阻对肾小球动力学和功能影响的实验方案。

将新型显微技术应用于合适的动物疾病模型以探索肾脏动态生理学仍是一项挑战。表面……的大鼠

本研究中呈现的数据展示了单侧输尿管梗阻对肾功能、炎症及纤维化的显著影响，有助于我们理解单侧输尿管梗阻的病理生理机制。该技术的主要优势在于能够在一个功能正常的肾脏内，动态地研究细胞间相互作用、亚细胞事件以及结构与功能之间的关联。输尿管手术操作将由本实验室的外科医生 Silvia Campos-Bilderback 博士进行演示。首先，对大鼠实施麻醉，然后沿腹中线做切口，找到左肾并将其与周围腹膜器官分离。找到包含肾动脉、肾静脉和输尿管的肾蒂后，小心分离输尿管，避免损伤其精细结构。使用镊子将3-0缝线环绕输尿管并打结，然后在第一个结的两侧各数毫米处再打一个结，以确保完全阻塞。输尿管结扎后，仔细逐层缝合肌肉层，随后完全闭合腹腔。使用外科缝钉闭合皮肤外层。手术准备时，将带有留置静脉通路的麻醉大鼠侧卧放置，左侧腹侧剃毛面朝上，平直地置于实验台上。确保大鼠的前肢相互接触，后肢也应如此。大鼠体位固定后，于肋骨下方轻触左侧腹侧，触摸肾脏位置，确定其在腹腔内的自然解剖位置，然后使用永久性记号笔沿剃毛区域画一条线，沿头尾方向平分肾脏中心。使用带齿镊子夹住并向上提起皮肤，同时用止血钳夹紧永久标记线，压碎下方的血管组织以防止出血。对薄的外层肌肉层重复此操作，以尽量减少出血。为了完成对薄的内侧腹肌层的切口，先触诊肾脏以估计其大小和位置，然后用一对镊子提起内侧肌肉层，再用止血钳压碎位于肾脏上方皮肤中线处的一条线，该线长度约为估计肾脏大小的三分之一。在用镊子夹住肌层的同时，进行最终切口。接着，双手各持镊子，采用交替递进的手法，夹住并固定肾脏下极的肾周脂肪，向下操作。用一只手牢固夹住脂肪后，牵拉脂肪，并轻轻挤压肾脏，使其从切口处缓慢娩出。如果肾脏未完全通过，可轻松扩大切口。为了识别滞留在毛细血管环中的白细胞（WBC），通过留置的静脉通路以每千克大鼠体重8微克的剂量给予Hoechst 33342核染色剂。在显微镜下，将暴露的肾脏轻轻旋转并紧贴培养皿边缘放置，使肾脏的腹侧接触盖玻片，背侧朝向远离边缘的方向。为进一步减少移动，将两块用生理盐水浸湿的无菌 2×2 纱布垫紧贴肾脏背侧，以加强肾脏腹侧与边缘的接触。样本定位后，在落射荧光照明下，使用双通道罗丹明-FITC 滤光片通过显微镜目镜观察。若发现样本位置有移动，可通过调整纱布进行微调，注意避免纱布推入肾脏下方。将大鼠略微翻转，使胸腔远离培养皿。使用落射荧光照明扫描肾脏表面，并利用与电动载物台控制器配套的软件标记肾小球的位置。在双光子照明下，针对每个荧光通道，对每个已标记肾小球的上部区域采集浅层三维图像，作为背景图像。在成像软件的显示选项中，使用伪彩调色板来可视化肾小球毛细血管袢背景荧光的微弱信号。以一条表浅的血管作为焦点，缓慢灌注荧光标记的Texas Red RAP血清白蛋白（TRRSA），同时观察由于全身分布引起的荧光信号升降，直至肾小管周围血管和毛细血管袢的荧光强度接近但未达到饱和。10分钟后，以1微米为间隔，采集所有标记并成像的肾小球的三维图像数据。选择一个合适的血管，可以是毛细血管袢或管周血管，然后使用旋转功能旋转图像，因为图像采集软件中的线扫描功能要求血管呈垂直状态。待血管旋转至水平位置后，在采集菜单中选择XT功能，并设置为扫描4,000行。将扫描线置于待检测血管上方，焦平面位于该血管节段最大直径处。接下来，左键单击彩色复合图像，选择“拍摄快照”选项卡，以生成线扫描区域的参考图像。随后立即点击“开始”按钮，捕获血管的线扫描图像。之后，将线扫描数据导入图像处理软件，以确定红细胞流速。在“测量”下拉菜单中，打开“显示区域统计”对话框，选择“单线绘制”工具，绘制一条与红细胞阴影斜率相匹配的直线。记录该直线的宽度和高度后，利用公式计算速度，然后对五次计算结果取平均值，以报告每条扫描线的速度。将肾小球置于成像视野中央，采集三维数据集，起始于肾小球表面，终止于30至35微米深度处。在Z方向上使用1微米的步长。通过比较蓝色Hoechst通道与Texas Red白蛋白通道，观察毛细血管环中红色染料的排除情况以及相应的细胞核染色，从而识别白细胞（WBCs）。如果白细胞在连续三个光学切片中保持静止，则将其定义为已黏附细胞，并以每10个光学切片（从肾小球顶部开始，以1微米间隔采集）中的出现次数报告结果。Munich Wistar Fromter（MWF）大鼠在单侧输尿管梗阻5周后，每视野肾小球数量较未治疗大鼠增加。Sprague-Dawley（SD）大鼠在单侧输尿管梗阻5周后，肾表面小球由无变为每视野2.02个。通过观察三维重建图像来评估肾脏表面。在SD大鼠中，5周单侧输尿管梗阻未形成类似正常肾小管上皮的区域，而这种区域在MWF大鼠、未治疗组以及部分5周UUO MWF大鼠中可见。在肾血管动力学研究中，与未治疗大鼠相比，5周UUO MWF大鼠和SD大鼠的肾血流量显著降低。与未治疗的MWF大鼠相比，5周UUO MWF大鼠和SD大鼠肾小球毛细血管袢内的红细胞流速显著减慢。此外，未经处理的MWF大鼠在顶部10个光学切片中每单位的白细胞（WBC）数量较少，而在5周单侧输尿管梗阻（UUO）的MWF大鼠和5周UUO的SD大鼠中，该数量增加。在单侧输尿管梗阻情况下，观察到白蛋白通透性增加，并且在单侧输尿管梗阻后，肾小囊腔内出现明显的白蛋白积聚。在未治疗的MWF大鼠中，S1节段在生理条件下可大量内吞白蛋白。然而，在MWF或SD大鼠经历5周单侧输尿管梗阻后，这种摄取现象则无法观察到。该技术可与其他多种方法联合使用，例如重复成像以随时间研究某一过程、对特定区域进行固定后成像，以及随后利用固定组织进行更高分辨率的显微镜观察。该技术被认为是一种颠覆性技术，使研究人员能够回答许多新的科学问题。在此过程中，获得了新的见解，并取得了范式转变性的数据。

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