使用2光子显微镜量化慢性单侧输尿管梗阻对肾小球过程的影响

本研究提供的数据显示了单侧输尿管梗阻对肾功能、炎症和纤维化的巨大影响。它有助于我们了解单侧输尿管梗阻的病理生理机制。该技术的主要优点是能够研究细胞间相互作用，亚细胞事件，并在功能正常的肾脏内以动态方式关联结构和功能。

演示输尿管手术将由我们实验室的外科医生Silvia Campos-Bilderback博士完成。首先，麻醉大鼠，然后沿着中线切开一个切口，定位左肾以将其与周围的腹膜器官分开。定位包括肾动脉、肾静脉和输尿管的肾蒂后，在不破坏脆弱结构的情况下分离输尿管。

使用镊子在输尿管周围缠绕并系上 3-0 缝合线，然后在第一个结的两侧打一个几毫米的结，以确保完全阻塞。一旦输尿管被绑住，小心地关闭连续的肌肉层，然后完全关闭腹部。用手术钉关闭外皮。

对于手术准备，将带有留置静脉通路的麻醉大鼠放在侧面，剃光的左胁面朝上并笔直地放在桌子上。确保老鼠的前爪像后爪一样相互接触。一旦大鼠被定位，触诊肋骨下方的左胁以感受肾脏并确定腹部的自然位置，然后沿着剃须区域使用永久性标记画一条线，将肾脏中心一分为二鼻子到尾巴的方向。

用一对齿镊子抓住并向上提起皮肤，用一对止血器捏住永久性标记线，以压碎下面的脉管系统并防止出血。对薄的外层肌肉层重复该过程，以尽量减少出血。为了对薄的内腹肌层进行最后的切口，触诊肾脏以估计大小和位置，并用一对镊子提起内肌层，然后用大约是肾脏估计大小的 1/3 的止血器压碎一条将肾脏上方皮肤一分为二的线。

在用镊子保持对肌肉层的抓地力的同时，做最后的切口。接下来，用每只手的镊子抓住并握住肾脏下极的肾脏脂肪，手把手向下工作。用一只手牢牢抓住脂肪，拉动脂肪，然后非常轻轻地通过切口挤压肾脏。

如果肾脏没有通过，请轻松扩大切口。为了识别滞留在毛细血管环中的白细胞或白细胞，通过留置静脉通路以每公斤大鼠重量 8 微克施用 Hoechst 33342 核染色。在显微镜下，将暴露的肾脏放在培养皿的边缘，稍微旋转一下，使肾脏的腹部接触盖玻片，背侧背对边缘。

为了进一步减少运动，将两个用盐水润湿的无菌 2×2 纱布垫贴在肾脏的背侧，以加强肾脏腹部与边缘的接触。定位样品后，使用双通道罗丹明FITC立方体在落射荧光照明下通过显微镜目镜观察。如果在样品位置检测到运动，请通过调整纱布进行细微调整，确保它不会推到肾脏下方。

将老鼠稍微翻过来，使胸部离盘子更远。使用落射荧光照明扫描肾脏表面，并使用与电动载物台控制器关联的软件标记肾小球位置。对于2光子照明下的每个颜色通道，取每个标记肾小球上部的浅3D体积作为背景图像。

在成像软件的显示选项中，使用伪调色板可视化肾小球毛细血管袢的背景荧光的微弱强度。使用浅表血管作为焦点，缓慢输注荧光德克萨斯红RAP血清白蛋白或TRRSA，同时观察由于全身分布引起的荧光的上升和下降，直到肾小管周围脉管系统和毛细血管袢的强度略低于饱和度。10 分钟后，以 1 微米的间隔获取所有标记和成像肾小球的 3D 体积。

找到合适的容器，毛细管环或管状血管，然后使用旋转功能旋转图像，因为图像采集软件中的线扫描功能要求容器垂直。容器旋转并平放后，选择采集菜单上的 XT 功能并将其设置为扫描 4， 000 条线。将线穿过要检查的容器，焦平面位于段的最大直径处。

接下来，左键单击彩色合成图像并选择"拍摄快照"选项卡以生成线扫描区域的参考图像。立即单击"开始"按钮以捕获船舶的线扫描。稍后，将线扫描导入图像处理软件以确定RBC流速。

在测量下拉菜单下，打开显示区域统计数据对话框，然后选择单线绘制工具以绘制与 RBC 阴影斜率匹配的线。记下线的宽度和高度后，使用公式计算速度，然后获得五次计算的平均值，以报告每次线扫描的速度。将肾小球置于成像视野的中心，并从肾小球表面开始，在 30 至 35 微米处结束获取 3D 数据集。

在 Z 方向上使用 1 微米的步长。通过将蓝色Hoechst通道与德克萨斯红白蛋白通道进行比较来识别WBC，方法是寻找毛细管环中红色染料的排除和相应的核染色。如果白细胞在三个光学切片上显示为静态，则将细胞定义为粘附，然后将值报告为以 1 微米间隔从肾小球顶部开始的每 10 个光学切片的发生次数。

慕尼黑Wistar Fromter或MWF大鼠中每田的肾小球数量在5周UUO组中比未治疗的大鼠增加。Sprague-Dawley大鼠或SD大鼠在单侧输尿管梗阻五周后从没有表面肾小球到每场2.02个。观察三维重建图像以观察肾脏表面。

SD大鼠的5周单侧输尿管梗阻未导致类似于MWF中可见的正常肾小管上皮的区域，未经治疗，并且在5周的UUO MWF大鼠中部分出现。在肾血管动力学研究中，与未治疗的大鼠相比，5周UUO MWF和SD组的肾血流量显着减少。与未治疗的MWF大鼠相比，5周UUO MWF和SD大鼠肾小球毛细血管袢内的红细胞速度显着降低。

此外，未经治疗的MWF大鼠每10个光学切片的WBC较少，而5周UUO MWF和5周UUO SD大鼠的数量增加。单侧输尿管梗阻时，白蛋白通透性增加。单侧输尿管梗阻后，Bowman 腔内白蛋白积聚强烈。

S1段内吞作用大量白蛋白，如在未经治疗的MWF大鼠的生理条件下观察到的那样。在单侧输尿管梗阻5周后，MWF或SD大鼠看不到相同的摄取。许多不同的方法，例如重复成像以研究随时间推移的过程，固定特定区域以进行成像，以及随后利用固定组织进行更高分辨率的显微镜检查，可以与该技术结合使用。

该技术被认为是颠覆性技术。它使调查人员能够回答许多新问题。在此过程中，提供了新的见解，并获得了范式转换数据。