利用双光子显微镜在慕尼黑Wistar大鼠量化肾小球通透性荧光大分子

该程序的总体目标是成功地可视化肾单位的过滤单元，并量化荧光大分子穿过过滤屏障进入体内尿液空间的过滤。这是通过首先为活体动物准备显微镜载物台来实现的。接下来，暴露肾脏并将大鼠放在舞台上。

然后识别和映射单个肾小球，并获取背景 3D 图像。最后，注入荧光白蛋白。获取单个肾小球的 3D 体积，并量化通透性。

最终，通过使用小瓶内双光子显微镜，可以获得显示大分子穿过肾脏肾小球的过滤系数的结果。双光子显微镜的主要优点是它允许同时量化动物体内的肾小球滤过和近端肾小管重吸收和转胞吞作用。同时，该技术的意义从机械扩展到诊断和治疗，因为了解肾小球滤过和近端肾小管的作用很重要。

白蛋白的重吸收对于确定治疗目标至关重要。麻醉大鼠后，通过颈静脉或股静脉插入留置静脉通路，并从胸腔下方到左大腿上方剃除左侧。这是一种非存活手术。

将大鼠平放在右侧，使剃光的左侧朝上。确保它平放在长凳上，姿势拉长，不要蹲下，前爪相互接触，后爪非常轻柔地相互接触。触诊感受肾脏以确定它自然位于腹膜后的位置，并使用记号笔用一对牙钳画一条平行于身体的直线。

拿起皮肤，用一把止血钳沿着画线捏住皮肤，用一把手术剪刀压碎组织，防止出血。沿切口切割。使用相同的程序切割外层肌肉，根据需要将其变薄。

使用止血钳防止切口进入内肌肉层出血，这将暴露腹膜。重新触诊肾脏以估计大小。捏住一条比肾脏小的切口线，确保切口刚好在肾脏上方。

最好把这个切口做得太小，如果需要，把它做得更大。找到肾脏并使用镊子以手交手的方式抓住周围的脂肪，朝向肾脏的底部极工作。到达肾脏的下极后，轻轻地将肾脏拉过切口，同时非常轻柔地挤压肾脏下方以使其外部化。

如果切口太小，请压碎肌肉层并切割以扩大它。在将大鼠的肾脏取出并将大鼠置于显微镜载物台上进行成像后，重复该过程以使肾脏外出。如果您的显微镜配备了能够标记位置的电动载物台，请使用双通道荧光素棒、domine 滤光片和低倍物镜，找到单个肾小球并将其居中，这些肾小球将显示为被近端小管包围的空圆形结构。

用固有的黄橙色自发荧光标记每个位置，将转台切换到更高功率的水浸物镜，并获取每个肾小球的 3D 数据集。确保毛细管环和 Bowman 空间清晰可见。使用伪调色板将有助于可视化这些结构。

接下来，专注于浅表血管，缓慢注入荧光白蛋白，确保给予时间以允许肾小球吸附系数或 GSC 低分子的全身分布，必须最大化血浆中的强度值，但不要达到会使显微镜中的光电检测器饱和的水平。这提高了过滤分子的可检测性等待大约 10 分钟以清除任何潜在的小分子量片段后，以 1 微米的间隔获取 3D 体积，以用于使用图像处理软件计算白蛋白。在包含荧光白蛋白的体积中加载每个肾小球的 3D 数据集以及背景图像。

找到一个浅表毛细血管环，在其定义的边缘和 Bowman 胶囊的边缘之间有足够的空白空间。在背景卷中。找到相同的焦平面，该焦平面应包含包含图像的白蛋白的所有视觉线索。

在感兴趣的毛细管环内选择一个区域，并记录平均强度读数。接下来，在 Bowman 空间内选择一个区域并记下平均强度读数。这些将用作定量的背景值。

在包含白蛋白的图像中，在 Bowman 空间内选择相似区域。至少对其他两个区域执行此作，以获取 Bowman 空间内的平均强度值。选择等离子体强度最亮的毛细管环，并在其周围绘制一个区域。

接下来，使用阈值功能，突出显示循环血浆中的亮值，避免循环红细胞的深色条纹。请注意所选等离子体空间的平均强度值。优先选择血浆的明亮区域很重要，因为血液中的因素只会导致低估血浆荧光水平。

在 Excel 电子表格中输入值以计算 GSC，其中 GSC 等于原始 bowman 空间的差值。强度减去背景 Bowman 空间强度除以原始毛细管环强度减去背景毛细管环强度的差值。滤过的荧光白蛋白的摄取主要发生在近端肾小管的早期段。

S 一，该面板显示了肾小球的横截面和 S 一段，取自慕尼黑 Wistar 提示大鼠，大约在输注初始德克萨斯红 RSA 推注后 20 分钟。Bowman 间隙的开放和红色白蛋白的狂热摄取显示在 S one 片段中。该面板显示了同一数据集的 20 微米浅层 3D 投影，此处显示的是输注后约 60 分钟拍摄的较低功率投影。

这些图像表明，活体显微镜可以在一定程度上证实过滤后注入材料的命运，此处观察到的过滤系数是从肾小球表面拍摄的图像。该面板是背景图像，该图像是在输注 Texas Red 大鼠血清白蛋白后约 12 分钟拍摄的。这两个面板以伪彩色绘制。

在 Bowman 空间中绘制的三个小感兴趣区域用于计算穿过过滤屏障的荧光白蛋白的平均强度。各个区域的平均强度值在 Show region Statistics 对话框内的高亮区域中报告。在进食条件下，为该单个肾小球得出的白蛋白的 GSC 值为 0.0111，属于该品系慕尼黑星鼠的范围场景。

按照此程序，可以对其他肾脏结构进行定量和定性分析等其他方法，以回答其他问题，例如大分子在过滤到尿腔后最终运输到尿腔发育后。这项技术使肾脏生理学的研究人员能够探索动态生理和病理生理过程，不仅仅是一次，而是纵向的。随着时间的推移，它确实如此。