Name: 利用双光子显微镜在慕尼黑Wistar大鼠量化肾小球通透性荧光大分子 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: 学习利用双光子显微镜在活体慕尼黑Wistar大鼠中可视化肾小球滤过单元，并量化荧光大分子通过滤过屏障的通透性。该方法可实时测定正常与病理状态下的滤过系数，为肾脏疾病研究提供重要的功能学数据。

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作者谨向 Silvia B Campos-Bilderback 博士和 George J Rhodes 博士致谢，感谢他们完成了涉及静脉通路置管的外科手术。作者还感谢 Sara E Wean 对由 Simonsen 和 Frömter 品系组成的 Munich-Wistar 大鼠品系的保种工作。本研究得到了印第安纳大学生物显微中心的资金支持，以及美国国立卫生研究院授予 Bruce A Molitoris 的项目资助（资助号：P30-DK079312 和 5RO1-DK091623）。

1. 大鼠血清白蛋白与磺化罗丹明101磺酰氯（Texas Red）的偶联
<ol>
	<li>在50 ml锥形管中，将100 mg大鼠血清白蛋白（RSA）溶解于6.667 ml 100 mM pH 9.0的碳酸氢钠溶液中，终浓度为15 mg/ml。</li>
	<li>将溶液置于冰/水浴烧杯中，冷却至0至4 °C之间。</li>
	<li>向含有10 mg德克萨斯红磺酰氯（TRSC）的西林瓶中加入200 μl高纯度无水二甲基甲酰胺（DMF），中速涡旋振荡15秒。</li>
	<li>中速涡旋振荡RSA溶液，然后加入已溶解的TRSC。</li>
	<li>用铝箔包裹50 ml锥形管（可使用Parafilm密封以确保密闭），水平放置于仅含冰的冰桶中，并置于摇床上缓慢振荡（避免产生气泡），在0至4 °C条件下反应1小时。</li>
	<li>配制5 L 0.9%生理盐水溶液，并润湿一个分子量截留值为50 kDa的透析装置，该装置可以是：a）带夹子的透析膜，b）浮式透析器（float-a-lyzer）中的透析管，或c）滑入式透析盒（slide-a-lyzer cassette）（均适用于去除未结合的TRSC）。</li>
	<li>将反应混合物转移至透析装置中，放入盛有5 L 0.9%生理盐水溶液的容器内，在4 °C下以磁力搅拌器轻柔搅拌，透析过夜。</li>
	<li>早晨和傍晚更换5 L透析液，直至过夜孵育后透析液几乎无颜色变化（通常需要约48小时，至少更换4次）。此外，由于50 kDa的截留分子量与RSA的分子量（66 kDa）较为接近，可能始终无法获得完全澄清的溶液；这取决于透析膜孔径分布情况；60小时和5次换液已足够充分。</li>
	<li>测量终体积，用初始的100 mg质量除以体积，计算TR-RSA的近似浓度；通常浓度范围为10–13 mg/ml。最终染料与白蛋白的摩尔比应约为4:1，即每15,000道尔顿蛋白分子量含有1个荧光基团。将溶液储存于4 °C；切勿冷冻TR-RSA溶液，因为可能发生的断裂会改变其通透性测定值。</li>
</ol>
2. 成像用倒置显微镜载物台的准备 / 显微镜设置
<ol>
	<li>在底部带有40 mm盖玻片的50 mm培养皿内（盖玻片底培养皿），将约4–7段长度约为¾英寸的高压灭菌指示胶带完全重叠堆叠放置。胶带应靠近培养皿的一侧边缘放置，使得胶带边缘能与肾脏的曲率边缘接触，但不遮挡物镜的光路（图1A和1B）；体型较大的大鼠需要在胶带与培养皿边缘之间留出更多空间。</li>
	<li>将2个Repti-therm加热垫放置在载物台旁侧，紧邻50 mm培养皿（图1A）。在载物台上覆盖加热循环水毯。</li>
	<li>为提高图像采集效率，确保物镜转盘上配备有10倍空气物镜或20倍（空气或水浸）物镜，以及一个更高倍数的水浸物镜，用于定量图像的采集。</li>
	<li>成像过程中，向物镜加水最有效的方法是将物镜旋转至侧方，使用连接长段PE-200导管的1 mL注射器向物镜顶部加水。</li>
	<li>通过软件中的中性密度滤光片将10瓦激光器的激发强度设置为约15–20%。使用磷化镓砷化物非扫描型光电探测器时，绿色荧光信号的采集设定为750，红色荧光信号设定为625。蓝色荧光信号（如核染料Hoechst 33342）则使用标准非扫描多碱探测器，设定值在750–800之间。</li>
	<li>为确保肾小囊腔内低强度荧光信号的准确采集，需设置探测器的下限值，避免排除这些信号。若灵敏度设置过低，视觉警示标记将提示这些信号的强度值已被设为零。</li>
	<li>用1 mL注射器吸取约5–8 mg荧光标记白蛋白溶液，并用0.9%无菌生理盐水稀释至总体积为1 mL。</li>
</ol>
3. 对慕尼黑维斯塔大鼠进行活体双光子成像前的肾脏暴露
<ol>
	<li>使用戊巴比妥钠（50 mg/ml 溶液，120 μl/100 g 体重）、戊基巴比妥（Inactin，130 mg/ml 溶液，120 μl/100 g 体重）或异氟烷（5% 诱导，1.5 至 2.5% 维持）对大鼠进行预先麻醉，并建立静脉通路（颈静脉或股静脉），同时将左侧腹侧从肋缘下方至左大腿上方区域剃毛。</li>
	<li>将大鼠平置于右侧，使左侧剃毛侧朝上；确保其身体平直地放置于操作台上，体位伸展而非蜷缩，前肢相互接触，后肢也相互接触（图 2A）。</li>
	<li>非常轻柔地触诊以感知肾脏位置，确定其在腹膜后间隙的自然位置，并使用记号笔沿身体方向（从肋缘至大腿）画一条与之平行的直线（图 2A）。</li>
	<li>用有齿镊夹起皮肤，再用止血钳沿所画线夹捏皮肤，压碎组织以防止出血；随后使用手术剪沿夹捏处切开。在切割前压碎表层皮肤及肌肉层可显著减少甚至完全避免出血。</li>
	<li>对外层肌肉层重复上述操作，该层较薄。</li>
	<li>对于切开内层肌肉（将暴露腹膜）的操作，需再次触诊肾脏以估计其大小；夹捏的切口线应略小于肾脏尺寸，确保切口正位于肾脏上方。建议初始切口偏小，必要时再扩大；若切口过大，则需缝合。此最后一层切口至关重要：若切口位置任何方向偏移过多，将影响器官在操作台上的稳定性，可能引起呼吸所致的运动伪影（较轻情况），或牵拉肾蒂导致肾灌注不良（最严重情况）。</li>
	<li>找到肾脏（如 图 2B 所示），用镊子夹住周围脂肪组织，采用交替推进的方式逐步向肾脏下极分离。</li>
	<li>到达肾脏下极后，轻柔地将肾脏拉出切口，同时在肾脏下方轻轻挤压以协助其完全外置。若切口过小，可再次压碎肌肉层并剪开以扩大切口；重复操作直至成功外置肾脏。</li>
</ol>
4. 将慕尼黑维斯塔大鼠放置于成像台上
<ol>
	<li>将肾脏置于盖玻片培养皿的边缘处，使肾脏略微向大鼠背部（背侧）方向旋转，从而使肾脏的腹侧与盖玻片培养皿底部接触（图1A）。向培养皿中加入预热的无菌0.9%生理盐水溶液。</li>
	<li>通过10倍或20倍物镜观察，检查是否存在运动。若观察到运动，可将大鼠身体略微翻转，使胸腔远离盖玻片培养皿底部；确保肾脏尽可能靠近培养皿边缘，但不要牵拉肾蒂（图1B）。</li>
</ol>
5. 获取图像以定量分析白蛋白的肾通透性
<ol>
	<li>要计算任何大分子的肾小球通透性（肾小球滤过系数；GSC），需在输注荧光分子前，对单个肾小球拍摄参考背景图像。如果显微镜配备有可标记位置的电动载物台，可先使用低倍物镜找到并居中单个肾小球，并标记每个位置。此操作理想情况下应使用双通道荧光素/罗丹明落射荧光滤光片，但单独使用任一发射滤光片亦可（相差显微镜或其他非荧光照明方式则不可行）。在双通道滤光片下观察时，肾小球呈现为空心的圆形结构，周围被具有天然黄橙色自发荧光的近端小管所包围。</li>
	<li>若显微镜无电动载物台，则使用低倍物镜以光栅扫描方式遍历肾脏，并根据自然解剖标志（如位于肾包膜上方的大型表浅血管或脂肪斑块）粗略绘制单个肾小球的位置图。</li>
	<li>将物镜转至高倍水浸物镜，对每个肾小球采集三维数据集，确保毛细血管袢和鲍曼腔清晰可见。使用伪彩调色板（而非黑白）有助于更好地分辨这些结构。</li>
	<li>聚焦于一条表浅血管，缓慢输注荧光标记白蛋白，并留出足够时间以确保其在全身充分分布。对于GSC较低的分子，关键在于最大化血浆中的荧光强度，但不可达到使显微镜光电探测器饱和的水平，以提高滤过分子的可检测性。注意：荧光白蛋白注入后通常需5–7秒才会在屏幕上显现（以约每秒1帧的速度采集完整图像帧）。</li>
	<li>在采集用于计算白蛋白GSC的三维图像（以1 μm为间隔）前，需等待约10分钟，以便可能存在的小分子量片段清除。通常，慕尼黑Wistar大鼠的Simonsen品系表面肾小球数量较少，因此所有可观察到的肾小球均应成像并定量；而Frömter品系的肾小球数量显著更多，因此我们通常限制定量数量至约10个。</li>
	<li>实验结束时，通过过量使用实验所用麻醉剂处死大鼠，并实施双侧气胸以确保动物死亡。</li>
</ol>
6. 从三维体积计算荧光白蛋白的GSC
<ol>
	<li>使用 Metamorph 图像处理软件加载每个肾小球的三维数据集，包括背景数据集和注入荧光白蛋白后获得的数据集。</li>
	<li>在含有荧光白蛋白的体积图像中，定位一个浅表的毛细血管袢，并确保其明确边界与鲍曼氏囊边缘之间有足够的空隙。</li>
	<li>在背景图像体积中，找到与含白蛋白图像具有相同焦点平面的位置，该平面应包含含白蛋白图像中的所有视觉参照特征。选择毛细血管袢内感兴趣区域，并记录该区域的平均强度值；随后选择鲍曼氏腔内的一个区域，并记录其平均强度值。这些数值将用作背景值。</li>
	<li>为进行定量分析，在含白蛋白图像的鲍曼氏腔内选择相似区域。至少重复此操作两次，以获取鲍曼氏腔内平均强度的平均值。</li>
	<li>选择血浆荧光强度最亮的毛细血管袢，并在其周围绘制感兴趣区域。接着使用阈值功能突出显示循环血浆中的高亮度信号，注意避开其中呈暗条纹状的循环红细胞。记录所选血浆区域的平均强度值。优先选择血浆中较亮区域非常重要，因为血液中的某些因素会导致血浆荧光水平被低估。</li>
	<li>使用 Microsoft Excel 电子表格输入上述数值，用于计算 GSC，其中：</li>
</ol>
<img alt="静态平衡方程，GSC公式；光谱分析装置中的强度分析示意图。" fo:content-width="2.95in" fo:src="/files/ftp_upload/50052/50052eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50052/50052eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1">

<ol><li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+normal+kidney+filters+nephritic+levels+of+albumin+retrieved+by+proximal+tubule+cells%3B+retrieval+is+disrupted+in+nephritic+states%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The normal kidney filters nephritic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells; retrieval is disrupted in nephritic states.</a> Kidney International. 71, 504(2007).</li>
<li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+tubular+uptake+explains+albuminuria+in+early+diabetic+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (3), 489(2009).</li>
<li>Sandoval, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+factors+influence+glomerular+albumin+permeability+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Multiple factors influence glomerular albumin permeability in rats.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (3), 447(2012).</li>
<li>Tojo, A., Endou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrarenal+handling+of+proteins+in+rats+using+fractional+micropuncture+technique%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Intrarenal handling of proteins in rats using fractional micropuncture technique.</a> American Journal of Physiology. 263, 601(1992).</li>
<li>Asgeirsson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular+sieving+of+three+neutral+polysaccharides%2C+polyethylene+oxide+and+bikunin+in+rat%3A+Effects+of+molecular+size+and+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica%22%5BJournal%5D)">Glomerular sieving of three neutral polysaccharides, polyethylene oxide and bikunin in rat: Effects of molecular size and conformation.</a> Acta Physiologica. 191 (3), 237(2007).</li>
<li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+endocytosis+in+vivo+using+intravital+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantifying endocytosis in vivo using intravital two-photon microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 440, 389(2008).</li>
<li>Dunn, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-animal+imaging+of+renal+function+by+multi-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cytom%22%5BJournal%5D)">Live-animal imaging of renal function by multi-photon microscopy.</a> Curr. Protoc. Cytom. Chapter 12, Unit 12.9(2007).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

此处强调的步骤是我们认为能够获得稳定且准确的通透性数值的操作，因为它们规避了以下陷阱：
<ol>
 <li>散射：使用红色发射荧光染料可更高效地收集光信号，因为长波长光子更不易发生散射。若使用绿色或蓝色发射荧光染料，则由于肾小球毛细血管袢和鲍曼氏囊腔内强度值的变异性增加，将导致肾小球滤过系数（GSC）的变异性增大3。</li>
 <li>成像深度：尽管通常会采集较深的三维数据集（总深度常在30–45微米之间），但最适宜用于确定GSC值的焦平面深度为表层10–15微米。更深的成像深度会导致灵敏度下降和变异性增加，这是由于发射光子的散射所致。然而更重要的是，在肾小球更深层处毛细血管袢更为密集，这些毛细血管袢被挤压至紧邻包围鲍曼氏囊腔的鲍曼氏囊壁边缘。这会增加意外选中覆盖在毛细血管袢周围众多足细胞之一正上方区域的可能性，从而导致GSC值被低估，因为滤过的白蛋白真实且较高的荧光强度将无法被准确检测。请参见图3中的B和D图示，注意毛细血管袢边缘与鲍曼氏囊腔边缘之间存在较大空间3。</li>
 <li>取样：在鲍曼氏囊腔内选择多个区域，有助于更准...

<table><tbody><tr><td>奥林巴斯Fluoview 1000共聚焦/多光子显微镜</td><td>奥林巴斯美国公司</td><td></td><td>探测器滤光片：蓝色 430/100，绿色 525/50，红色 605/90</td></tr><tr><td>锁模钛宝石Mai Tai激光器</td><td>光谱物理公司</td><td></td><td>可调激发波长：~750-1150 nm</td></tr><tr><td>砷化镓磷化物光电探测器</td><td>滨松公司</td><td></td><td>注：可提供前置或侧置安装配置。</td></tr><tr><td>MetaMorph图像处理软件</td><td>分子动力学公司</td><td></td><td>注：版本6.1r1</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>微软公司</td><td></td><td>2007版本</td></tr><tr><td>操作镊子</td><td>电子显微科学公司</td><td>Cat# 78266-04</td><td></td></tr><tr><td>梅奥解剖剪刀</td><td>电子显微科学公司</td><td>Cat# 72962</td><td></td></tr><tr><td>CA显微剪刀型号1C300</td><td>电子显微科学公司</td><td>Cat# 78180-1C3</td><td></td></tr><tr><td>凯利止血钳（直型）</td><td>电子显微科学公司</td><td>Cat# 72930</td><td></td></tr><tr><td>水循环毯式加热垫</td><td>Gaymar公司</td><td></td><td>T/Pump PN 11184-000 毯子-66N111CC</td></tr><tr><td>爬行动物用罐底加热器Repti-Therm</td><td>ZooMed公司</td><td></td><td>RH-4</td></tr><tr><td>德克萨斯红磺酰氯</td><td>英杰公司/分子探针</td><td>Cat# T-353</td><td></td></tr><tr><td>大鼠血清白蛋白</td><td>西格玛-奥德里奇公司</td><td>Cat# A-6272</td><td></td></tr><tr><td>高质量无水DMF</td><td>西格玛-奥德里奇公司</td><td>Cat# 270547</td><td></td></tr><tr><td>Strate-Line高压灭菌指示胶带</td><td>费希尔科技公司</td><td>Cat# 11-889-1</td><td></td></tr><tr><td>Willco-dish盖玻片底培养皿（50 mm/40 mm盖玻片）</td><td>电子显微科学公司</td><td>Cat# 70665-07</td><td></td></tr></tbody></table>

使用双光子显微镜定量中国台湾慕尼黑维斯塔大鼠肾小球对荧光大分子的通透性

Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

长期以来，人们认为肾脏疾病中出现尿液大量丢失重要的大分子物质（如血清白蛋白）的现象，是由足细胞、血管内皮细胞和基底膜共同构成的通透性屏障发生改变所致。我们实验室利用活体双光子显微镜获得的数据表明，在生理条件下，肾小球滤过屏障（GFB）的通透性比以往认为的更高，滤过的白蛋白可在一组早期细胞——近端小管细胞（PTC）中被重新吸收1,2,3。
既往研究肾小球滤过功能及滤过屏障特性的技术，涉及对近端小管起始段管腔进行微穿刺，采集管腔内液体并进行分析4。这些研究表明，管腔液中的白蛋白浓度几乎检测不到，与正常尿液中所观察到的水平相近。然而，利用该技术对具有确定分子大小的葡聚糖聚合物进行表征时发现，分子大小与血清白蛋白相似的葡聚糖在肾小管管腔和尿液中的含量更高，提示其通透性增加5。
本文详细阐述了一种用于直接可视化并定量评估肾小球荧光白蛋白通透性的 in vivo 技术。该方法可检测白蛋白穿过滤过屏障进入鲍曼氏囊（尿液滤过的起始腔室）的情况，同时还能定量近端小管对白蛋白的重吸收，并可视化后续的白蛋白转胞吞作用6。在通往膀胱的远端小管各段中未观察到荧光白蛋白的存在，突显了近端小管早期节段在白蛋白回收通路中的高效性。此外，当该技术被用于测定与白蛋白大小相似的葡聚糖的通透性时，报道了几乎相同的通透性数值2。这些发现直接支持有必要将多种蛋白尿性肾病的研究重点扩展至近端小管细胞重吸收功能的改变。

图3展示了一张来自慕尼黑维斯塔大鼠（Munich Wistar Frömter rat）肾小球表面的图像示例，以及测定荧光白蛋白通透性的操作步骤。该肾小球所得白蛋白GSC值为0.0111，处于进食状态下此品系慕尼黑维斯塔大鼠的典型范围内3。这些图像中所呈现的稳定性，得益于对图1和图2所示操作步骤的周密规划与准确执行。如前所述，在暴露肾脏时切口位置的选择是获得无运动伪影稳定图像的最关键步骤。
<img src="/files/ftp_upload/50052/50052fig1.jpg" alt="小鼠肾脏成像装置示意图；手术示意图中显示加热装置和浸水物镜。" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50052/50052fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> ...

一种利用高分辨率活体双光子显微镜直接观察和量化表层肾小球滤过功能的技术。该方法可直接测定大分子在正常和疾病状态下的通透性特征。

涉及大量重要大分子（如血清白蛋白）经尿液丢失的肾脏疾病，长期以来被认为是由……引起的

本实验的总体目标是成功地在体内可视化肾单位的滤过结构，并定量分析荧光大分子在滤过屏障中滤过进入尿液腔的过程。该目标首先通过准备适用于活体动物的显微镜载物台来实现，随后暴露肾脏并将大鼠放置于载物台上。随后识别并定位单个肾小球，并采集背景三维图像。最后，注入荧光标记的白蛋白，获取单个肾小球的三维体积图像，并定量分析通透性。最终，可以通过使用管内双光子显微镜获得显示大分子在肾脏肾小球中滤过系数的结果。双光子显微镜的主要优势在于，它能够在活体动物中同时定量肾小球滤过以及近端小管重吸收和转胞吞作用。同时，该技术的意义不仅限于机制研究，还延伸至诊断与治疗领域，因为理解肾小球滤过和近端小管功能的作用至关重要。白蛋白的重吸收对于确定治疗靶向性至关重要。在麻醉大鼠后，通过颈静脉或股静脉插入留置静脉通路，并剃除左侧腰部从肋骨下方至左大腿上方的毛发。此为非存活性手术。将大鼠平放在其右侧，使左侧剃毛的一侧朝上。确保大鼠身体平直地置于实验台上，体位伸长，前肢轻轻相互接触，后肢也轻轻相互接触，避免蜷缩。通过触诊感知肾脏位置，以确定其在腹膜后腔的自然位置，并使用记号笔和一对有齿镊子沿身体平行画一条直线。提起皮肤，用一把止血钳沿画好的线夹住皮肤以压碎组织并防止出血，同时使用一把手术剪沿切口线进行切割。采用相同的步骤切开外层肌肉层，根据需要将其切开至适当厚度。使用止血钳防止切开内层肌肉时出血，以暴露腹膜。重新触诊肾脏以估计其大小。捏住一条小于肾脏的切口线，确保切口位置刚好位于肾脏上方。切口宁可偏小，必要时再扩大。找到肾脏后，用镊子夹住其周围的脂肪组织，以交替递进的方式逐步向肾脏下极游离。到达肾脏下极后，轻柔地将肾脏通过切口拉出，同时在肾脏下方轻轻挤压，以协助其顺利外置。如果切口过小，需压碎肌层并剪开以扩大切口。在暴露大鼠肾脏并将大鼠置于显微镜载物台上进行成像后，重复该操作以暴露肾脏。若显微镜配备可标记位置的电动载物台，使用双通道荧光素棒、阻断滤光片和低倍物镜，寻找并居中单个肾小球，肾小球将呈现为空心的环状结构，周围被近端小管环绕。由于固有的黄橙色自发荧光标记了每个位置，将物镜转盘切换至高倍水浸物镜，并对每个肾小球采集三维数据集。确保毛细血管袢和鲍曼腔清晰可见。使用伪彩调色板有助于可视化这些结构。接下来，针对一条表浅的血管缓慢注入荧光标记的白蛋白，并确保给予足够时间，使肾小球滤过系数（GSC）较低的分子在全身充分分布。此步骤的关键在于最大限度地提高血浆中的荧光强度，但需避免达到使显微镜光电探测器饱和的水平，以增强滤过分子的可检测性。等待约10分钟，使可能存在的小分子量片段充分清除后，以1微米为间隔采集三维图像数据，用于后续通过Metamorph图像处理软件计算白蛋白的滤过情况。将含有荧光白蛋白的每个肾小球的三维数据集及其对应的背景图像一并载入分析软件中。在包曼氏囊边缘与其明确边界之间存在足够空隙的区域，寻找一个表浅的毛细血管袢。在背景体积中，定位到相同的焦平面，该平面应包含含白蛋白图像的所有视觉线索。在感兴趣的毛细血管袢区域中选择一个区域，并记录平均强度读数。接着，在鲍曼氏腔内选择一个区域，并记录平均强度读数。这些数值将用作定量分析的背景值。在含有白蛋白的图像中选择肾小囊腔内的相似区域。至少对另外两个区域重复此操作，以获得肾小囊腔内的平均强度值。选择血浆荧光强度最亮的毛细血管袢，并在其周围绘制一个区域。接下来，使用阈值功能突出显示循环血浆中的高亮度区域，避开其中循环的红细胞形成的暗条纹。记录所选血浆区域的平均荧光强度值。优先选择血浆中较亮的区域非常重要，因为血液中的某些成分会导致血浆荧光水平被低估。将数值输入 Excel 电子表格以计算 GSC，其中 GSC 等于原始鲍曼腔强度减去背景鲍曼腔强度的差值，除以原始毛细血管袢强度减去背景毛细血管袢强度的差值。滤过的荧光白蛋白的摄取主要发生在近端小管的起始段。S1段，此图显示了来自慕尼黑维斯塔大鼠的肾小球及S1段的横截面，图像采集于初次注入Texas red RSA团注后约20分钟。图中可见肾小囊腔的开口以及S1段对红色示踪白蛋白的强烈摄取。此图展示了同一数据集的浅层20微米三维投影，此处显示的是注入后约60分钟时拍摄的低倍投影图像。这些图像表明，活体显微镜可实现对滤过后的输注物质去向的可视化观察，这在一定程度上验证了所观察到的滤过系数。此处展示的图像采集自肾小球表面。该图面板为背景图像，是在输注Texas Red标记的大鼠血清白蛋白约12分钟后拍摄的。这两个图面板采用伪彩绘制。在鲍曼腔内选取三个小的兴趣区域，用于计算穿过滤过屏障的荧光白蛋白的平均荧光强度。各个区域的平均强度值显示在“显示区域统计”对话框的高亮区域内。该肾小球所得的白蛋白GSC值为0.0111，处于进食状态下慕尼黑星状大鼠品系的典型范围内。通过该操作流程，可对其他肾结构进行定量和定性分析，以回答更多问题，例如大分子在滤过进入尿腔后最终的转运路径。该技术使肾脏生理学领域的研究人员能够对生理及病理生理动态过程进行多次、纵向的探索。随着时间推移，这一方法得到了持续发展和应用。

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利用双光子显微镜在慕尼黑Wistar大鼠量化肾小球通透性荧光大分子

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离体血液灌注肺制备方法使得肺表面微血管网络的可视化成为可能。本文介绍了一种利用实时荧光成像技术定量分析离体肺中单个微血管通透性的方法。...

在离体血液灌注大鼠肺模型中定量单个微血管通透性

靶向特异性探针是分析多种疾病（例如，炎症、感染和肿瘤发生）中分子机制（如蛋白质表达）的一种创新工具。本研究描述了一种利用F4/80特异性荧光介导断层成像技术，对结肠炎小鼠模型中肠道巨噬细胞浸润进行定量三维断层评估的方法。...

用于检测与定量小鼠肠道巨噬细胞相关炎症的荧光介导断层成像技术

本文介绍了一种利用腹腔注射荧光示踪剂并结合灌注技术的小鼠脑血管通透性检测方法，适用于血脑屏障功能障碍的动物模型。一侧半脑用于通透性的定量评估，另一侧用于示踪剂的可视化或免疫染色。该实验流程可在10只小鼠中于5至6小时内完成。...

一个 在体 内 利用荧光标记示踪剂检测小鼠血脑屏障通透性实验

本方案描述了应在肾小球疾病小鼠模型中进行的完整肾脏检查。这些方法可对肾小球功能进行详细的功能性、结构性和机制性分析，适用于所有肾小球疾病的小鼠模型。...

肾小球疾病小鼠模型中肾功能的评估

我们介绍了利用双光子显微镜将微吸管置入小鼠肾小囊尿腔的技术，结合了肾脏生理学中的两项基础技术。相比传统显微镜，双光子显微镜克服了肾微穿刺生理学研究中的关键局限性。...

利用双光子显微镜实现小鼠肾小囊腔的微穿刺

本文介绍了一种使用经皮肾小球滤过率（GFR）监测仪在清醒、自由活动的小鼠中测定肾小球滤过率的实验方案。...

小鼠肾小球滤过率的经皮测量

本文介绍了一种使用高灵敏度、非放射性示踪剂检测小鼠肾小球通透性的实验方案。该方法可利用少量尿液样本进行多次重复的尿液分析。...

使用异硫氰酸荧光素-多聚蔗糖70对小鼠肾小球通透性进行高灵敏度测量

本文介绍了一种利用双光子显微镜在具有表层肾小球的慕尼黑维斯塔大鼠中定量研究长期输尿管梗阻对肾小球动力学和功能影响的实验方案。...

利用双光子显微镜定量分析单侧输尿管慢性梗阻对肾小球结构的影响

本研究提供了一套易于使用、完整且简便的方法，用于标记和分析经CUBIC透明化处理的小鼠肾脏中的肾小球。利用异硫氰酸荧光素（FITC）-葡聚糖、光片荧光显微镜（LSFM）或常见的共聚焦显微镜，结合Imaris等软件，可轻松、可靠地获取肾小球数量和体积等数据。...

一种高效快速的小鼠肾小球标记与分析方法

学习利用双光子显微镜在活体慕尼黑Wistar大鼠中可视化肾小球滤过单元，并量化荧光大分子通过滤过屏障的通透性。该方法可实时测定正常与病理状态下的滤过系数，为肾脏疾病研究提供重要的功能学数据。

使用双光子显微镜定量中国台湾慕尼黑维斯塔大鼠肾小球对荧光大分子的通透性

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