诱导眼表炎症和受累组织收集

该协议依次描述了诱导眼表炎症和收集涉及睑板腺功能障碍的相关受影响器官的步骤。这种新的MGD模型能够研究疾病的先天免疫方面，特别是中性粒细胞细胞外陷阱的形成，阻塞睑板腺。协议中展示的技术可以扩展到在临床前阶段引入局部治疗干预。

此外，眼分泌物和器官的收集反映了治疗的有效性。要进行免疫原溶液的腹膜内注射，请抓住笼子网格的同时，轻轻握住七到九周大的C57黑六非麻醉雌性小鼠的尾巴。然后将背部和颈部区域的皮肤牢牢夹在拇指和食指之间，将无名指和小指之间的尾巴和下肢固定在手掌上。

保持小鼠头部朝下固定，在下腹腔的右象限或左象限注射100微升制备的免疫原溶液。要在免疫后进行眼表挑战，请在麻醉小鼠的每只眼睛上涂抹五微升卵清蛋白或卵子或盐水，并等待五分钟以使滴剂被眼睛吸收。接下来，在激发后立即将50微升无菌盐水涂抹在眼睛上来收集眼部渗出物。

为了切除眼表组织，将小鼠放在平坦的表面上，并用70%乙醇拭子对眼睛周围的眼眶区域进行消毒。要在眼睛周围形成切口，请在耳朵和眶后窦之间以及沿鳞状骨上方的表面垂直切开切口，将切口沿上颌骨水平延伸至下眼睑下方，沿额骨在上眼睑上方。用弯曲的镊子小心地握住眼睛周围的解剖组织，然后将组织和眼球拉出。

将切除的器官放入无菌PBS中。然后在体视显微镜下使用手术刀，修剪切除的上眼睑周围多余的面部肌肉组织。为了收集结膜，将上眼睑放在干燥的培养皿上。

然后使用细镊子和手术刀将白色粘液层轻轻地从眼睑内表面剥离出来。在解剖角膜旁边，将眼球放在干冰顶部的新干培养皿上。三分钟后，将培养皿放在工作台表面上，保持稳定位置。

使用细而锋利的剪刀在角膜缘旁边的角膜边缘做一个小切口。用手术刀继续切开眼球，将巩膜与角膜分开。然后用生理盐水大量冲洗，从角膜背面去除虹膜和晶状体残留物。

要评估睑板腺及其孔口，请将切除的眼睑在体视显微镜下直立放置。然后根据相机曝光时间和ISO设置，在白光落射照明下拍摄图像。要评估睑板腺区域，请将切除的眼睑置于水平位置，并打开配备红外相机的体视显微镜的背光。

根据相机ISO调整曝光时间，拍摄图像。盐水给药的小鼠睁大眼睛显示出健康的眼表。相比之下，卵应用会引起严重的眼表炎症、眼睛狭窄的睁开和水肿的迹象。

切除的眼睑显示大闭塞堵塞了睑板腺的孔口和水肿，而健康的眼睑显示眼睑内壁腺体的小塞子。对腺体红外透照的进一步检查揭示了睑板腺腺泡的外消旋外观。盐水挑战小鼠的眼睑显示圆形腺泡。

相比之下，卵子应用诱导一些患有过敏性眼病或AED的腺体的破坏和损失。眼睑的组织学分析显示，与仅使用盐水给药的小鼠相比，睑板腺扩张。在干冰上孵育眼球可以在角膜缘旁边的角膜处切开，并将角膜与巩膜分开。

这项研究促进了角膜的采集。此外，卵管给药对结膜造成严重的炎症，外观充血。趋化因子CXCL-1水平升高促进中性粒细胞外渗、吞噬作用和脱颗粒，在AED小鼠上清液中观察到介导急性期反应和中性粒细胞浸润的白细胞介素-6。

另一方面，白细胞介素-10的浓度在幼稚小鼠和AED小鼠中均未显示显着变化。这种新模型能够开发和评估靶向先天免疫途径的药物的功效，并且对抗炎剂给药方式的数据挖掘有很大帮助。在适当收集器官后，高度多重的方法（如单细胞测序和成像质谱细胞术）与该协议兼容。