用于肿瘤类球体半高通量分析的快速光学透明化

我的实验室专注于三维和四维肿瘤建模。肿瘤类球体模型在生物学和药物发现领域被广泛应用。然而，目前从这些实验中采集数据的现有方案成本高昂、操作困难且存在局限性。

本方案所需的化学试剂和设备易于获取，与目前可获得类似结果的方法相比，劳动强度较低。本方案设计为初学者相对容易实施，且对小错误具有较强的容错性，因为许多步骤是可逆的。首先，在玻璃瓶中称取 0.5 克低熔点琼脂糖。

加入25毫升PBS。将溶液在微波炉中加热煮沸30至60秒，盖上盖子并持续旋转，以溶解琼脂糖。称取9克N, N, N'N'四(2-羟丙基)乙二胺、22克尿素、44克蔗糖、0.1克Triton X-100和24.9克去离子水。

将溶液置于 56 摄氏度的水浴中加热，并持续搅拌。待晶体完全溶解后，将溶液静置于室温，使混合过程中产生的气泡上升至液面。采用文中所述的琼脂糖覆盖法生成球状体。

使用手术刀切下一毫升移液枪头的尖端，以扩大其开口。用移液器将球状体从孔中吸出，并转移至一个透明的1.5毫升锥形管中。相同条件下的多个球状体可合并至同一根管中。

用一毫升磷酸盐缓冲液将类球体清洗两次，然后加入中性的4%预热多聚甲醛溶液，并在37摄氏度下孵育类球体。20分钟后，移除多聚甲醛溶液，并用一毫升磷酸盐缓冲液将类球体再次清洗两次。随后进行染色时，使用移液器将最多15个类球体转移至一个200微升的PCR管中。

使用含有0.5% Triton X-100的PBS溶液200微升对细胞进行透化处理。将PCR管放入50毫升带螺口盖的离心管中，用铝箔包裹管子，并在室温下轻轻振荡孵育类球体。两小时后，更换为200微升抗体稀释缓冲液，并在室温下过夜孵育。

第二天，加入一抗前先移除抗体稀释缓冲液，随后加入75 µL一抗，在4°C条件下孵育2.5天。孵育结束后，移除上清液，并用200 µL含0.1% Tween和0.1% Triton X-100的PBS（即PBS-TT）将类球体洗涤两次。然后在室温下用200 µL PBS-TT孵育4小时。

接下来，在加入100微升二抗之前，先移除PBS-TT，并在4摄氏度下孵育两天半。孵育结束后，移除上清液，用PBS-TT洗涤两次，然后加入200微升PBS-TT，继续孵育4小时。进行封片时，使用200微升移液器将固定并染色的类球体转移至500微升PCR管中，每种条件对应一管。

加入 200 微升 2% 液体琼脂糖凝胶替换原有溶液，于室温下以固定最大转速快速离心 30 秒。用 50 微升液体琼脂糖凝胶重悬类球体，并将其接种至 24 孔玻璃底板的孔中。在凝胶凝固前，使用移液器吸头将类球体周围的凝胶分离，确保类球体被凝胶完全覆盖。

接下来，每孔加入500微升透明溶液，将凝胶完全浸没，并在室温避光条件下孵育24小时，然后进行成像。成像时，选择工作距离足够长的物镜，以确保涵盖整个类球体，包括类球体在容器中的安装高度。为确定赤道平面，调节焦距直至在XY平面上观察到最大表面积，然后使用所需的激光功率百分比、检测器电压、增益和偏移设置进行成像。

对于三维图像，设置类球体的起始和终止位置，并利用Z轴强度校正设置，在不同的Z深度选择适当的信号强度。本研究展示了透明化与未透明化的FUCCI人黑色素瘤类球体与PBS封片的类球体之间的比较。透明化溶液可提供高清晰度图像，且尺寸畸变最小。

透明化溶液可进一步实现对类球体更深层细胞水平细节的高分辨率成像，而无需进行组织学切片。通过三维共聚焦成像，可获得深度达200微米处的细胞水平细节。此外，还展示了经冰冻切片与透明化完整类球体在pimonidazole和p27kip1染色后的对比结果。

匹莫尼唑染色显示类球体的缺氧区域，p27kip1染色标记细胞周期阻滞，DAPI为细胞核染色。更深的穿透能力和更少的散射使得三维类球体结构的呈现更加清晰，同时光损失最小。图中展示了用DRAQ7染色的FUCCI类球体的三维重建图像。

透明溶液对类球体大小的影响极小。类球体的直径是根据与类球体具有相同横截面积的球体来定义的。在前六小时内，类球体的尺寸略有增加，直径倍数变化介于2%至6%之间。相比之下，在24至72小时后，类球体的尺寸恢复至与多聚甲醛固定后在PBS中相应的尺寸大致相等。

成像前至少需要等待 24 小时，以使透明化溶液与类球体及凝胶充分平衡。本方案使研究人员能够快速从大量类球体中收集数据，从而进行详细的定量数学与统计分析，深入揭示其生物学特性。