用于肿瘤球体半高通量分析的快速光学清除

我的实验室专门从事三维和四维肿瘤建模。肿瘤球状体模型广泛应用于生物学和药物发现。然而，从这些实验中收集数据的现有协议是昂贵、困难和有限的。

该协议需要易于获取的化学品和设备，并且与提供类似结果的当前方法相比，不是非常劳动密集型。该协议的开发对于初学者来说相对容易实现，并且对小错误具有鲁棒性，因为许多步骤是可逆的。首先称量玻璃瓶中的0.5克低熔点琼脂糖。

并加入25毫升PBS。通过将溶液在微波炉中煮沸 30 到 60 秒，盖上盖子并不断旋转来融化琼脂糖。称取 N、N、N'N'N'四（2-羟丙基）乙二胺 9 克、尿素 22 克、蔗糖 44 克、Triton X-100 0.1 克和去离子水 24.9 克。

在56摄氏度的水浴中加热溶液，并不断混合。晶体溶解后，将溶液置于室温下，以使混合过程中形成的气泡上升到表面。使用文本手稿中描述的琼脂糖叠加方法生成微球。

用手术刀切开一毫升移液器吸头的尖端以扩大孔口。使用移液器，从孔中吸出球体并将其转移到透明的1.5毫升锥形管中。来自相同条件的多个球体可以组合在同一管中。

在一毫升PBS中洗涤球体两次，然后加入中性4%预热的多聚甲醛溶液，并在37摄氏度下孵育球体。20分钟后，除去多聚甲醛溶液，用一毫升PBS洗涤球体两次。然后为了染色，使用移液管将多达 15 个球体转移到 200 微升 PCR 管中。

在PBS中使用200微升0.5%Triton X-100透化细胞。将PCR管放入50毫升螺旋盖管中，并用铝箔覆盖管，并在室温下温和搅拌孵育微球。两小时后，用200微升抗体稀释缓冲液替换溶液，并在室温下孵育过夜。

第二天，在加入75微升一抗之前取出抗体稀释缓冲液，并在4摄氏度下孵育两天半。孵育后，除去上清液并用含有0.1%吐温和0.1%Triton X-100或PBS-TT的200微升PBS洗涤球状体两次。然后在室温下与200微升PBS-TT孵育4小时。

接下来，在加入 100 微升二抗之前去除 PBS-TT，并在 4 摄氏度下孵育两天半。孵育后，除去上清液并用PBS-TT洗涤两次，然后与200微升PBS-TT孵育4小时。对于安装，请使用 200 微升移液器，将固定和染色的球体转移到 500 微升 PCR 管中，每个条件一个管。

用200微升2%液体琼脂糖凝胶代替溶液，并在室温下以固定的最大速度快速旋转30秒。将球状体吸出在50微升液体琼脂糖凝胶中，并在24孔玻璃底板的孔中分配。在凝胶变硬之前，使用移液器吸头在周围的凝胶中分离球体，并确保微球被凝胶覆盖。

接下来，通过每孔加入500微升透明溶液来浸没凝胶，并在室温下在黑暗中孵育24小时，然后成像。对于成像，请选择工作距离足够长以涵盖整个微球的物镜，包括球体在容器中的安装高度。要识别赤道平面，请调整焦点，直到达到XY平面中的最大表面积，并使用所需的激光功率百分比，检测器电压，增益和偏移设置进行成像。

对于三维图像，使用 Z 强度校正设置设置微球的起点和终点，并在各种 Z 深度选择合适的信号强度。这项研究显示了清除和未清除的FUCCI人黑色素瘤球体与PBS安装的球体的比较。清除解决方案可提供高清晰度的图像，尺寸失真最小。

透明化溶液进一步允许对球状体更深处的细胞水平细节进行高分辨率成像，而无需组织学切片。使用三维共聚焦图像，可以获得200微米深度的细胞级细节。此外，显示了对啐莫硝唑和p27kip1染色的冷冻切片和清除孔球体之间的比较。

匹莫硝唑染色显示微球的缺氧区域，p27kip1染色标志着细胞周期停滞和DAPI核染色。更深的穿透力和更少的散射，允许以最小的光损失改进三维球体结构表示。图中显示了用 DRAQ7 染色的 FUCCI 椭球体的三维渲染图。

透明溶液对球体尺寸的影响最小。椭球体的直径是根据与椭球体横截面积相同的球体定义的。观察到微球在前六个小时内尺寸略有增加，如直径倍数变化在2%至6%之间所示相反，在24至72小时后，微球恢复到大约等于PBS中相应大小的多聚甲醛固定后。

重要的是在成像前至少等待24小时，以使澄清溶液与微球和凝胶平衡。该协议允许从业者从大量微球中快速收集数据，允许进行详细的定量数学和统计分析，从而提供对生物学的详细见解。