Name: 用于肿瘤球体半高通量分析的快速光学清除 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: 了解快速光学清除技术用于肿瘤球体半高通量成像分析的方法。该技术使用低熔点琼脂糖、多聚甲醛和抗体染色，结合透明化溶液处理，可在200微米深度获得高清晰度三维细胞图像，适用于肿瘤微环境相互作用和药物反应研究。

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本研究在澳大利亚昆士兰州伍伦加巴的转化医学研究所（TRI）进行。TRI 获得澳大利亚政府资助。&#8239;我们感谢TRI显微成像核心设施工作人员提供的出色技术支持。感谢日本和光市理化学研究所（RIKEN）的Atsushi Miyawaki教授提供了FUCCI质粒，感谢美国宾夕法尼亚州费城威斯塔研究所（The Wistar Institute）的Meenhard Herlyn教授和Patricia Brafford女士提供了细胞系。感谢Loredana Spoerri博士提供了C8161细胞的冷冻切片图像。
本工作获得了对 N.K.H. 的项目资助：澳大利亚研究理事会（DP200100177）和 Meehan 项目资助（021174 2017002565）。

该方案描述了制备足够数量肿瘤类球体的步骤，用于铺制一块24孔板（每孔200 µL琼脂糖凝胶，共约240-360个类球体，即每孔10-15个类球体），每孔还需加入500 µL透明溶液。完整操作流程见图1。
1. 2% 琼脂糖-PBS 凝胶的制备
<ol>
	<li>称取0.5 g低熔点琼脂糖（见材料表）于玻璃瓶中，加入25 mL磷酸盐缓冲液（PBS）。</li>
	<li>将溶液在微波炉中加热煮沸30–60秒以溶解琼脂糖，瓶盖需关闭但不要密封，并持续旋转混匀。确保琼脂糖完全溶解，且溶液不发生暴沸。 
	注意：凝胶可在室温下保存；使用前检查体积是否因蒸发而减少。使用前需重新加热至液态（微波加热20–60秒，期间持续旋转）。</li>
</ol>
2. 透明化溶液的制备
<ol>
	<li>称取 9 g N,N,N′,N′-四(2-羟丙基)乙二胺、22 g 尿素、44 g 蔗糖、0.1 g Triton X-100 以及 24.9 g 去离子水（见材料表）。 
	注意：可先粗略称量 N,N,N′,N′-四(2-羟丙基)乙二胺的质量，再调整其他组分的质量以获得所需浓度，操作更为简便。</li>
	<li>将溶液置于 56 °C 水浴中持续搅拌加热，直至所有晶体完全溶解。</li>
	<li>将溶液在室温下静置，使混合过程中产生的气泡上升至液面。该溶液在室温下可稳定保存长达 2 个月。</li>
</ol>
3. 类球体的制备
<ol>
	<li>采用之前所述的琼脂糖覆盖法生成球状体1,3,14。 
	注意：采用其他方法生成的球状体也适用于本成像方案。</li>
	<li>使用手术刀切割1 mL移液器吸头的尖端，以扩大其孔径。 
	注意：所有球状体均使用剪切过尖端的1 mL或200 µL移液器进行操作。</li>
	<li>使用移液器将球状体从孔中吸出，并转移至一个透明的1.5 mL锥形管中。相同条件下的多个球状体可合并置于同一管中。 
	注意：每次吸取培养基前，均应让球状体充分沉降至管底。</li>
	<li>用1 mL PBS洗涤球状体两次，加入中性预热的4%多聚甲醛（PFA）溶液，在37 °C孵育20分钟。</li>
	<li>去除PFA溶液，用1 mL PBS洗涤球状体两次。</li>
</ol>
4. 类球体染色
<ol>
	<li>使用移液器将最多15个类球体转移至一个200 µL的PCR管中。 
	注意：对于较脆弱的类球体，建议在进行后续步骤前先将其包埋于凝胶中（步骤5.1–5.4）。</li>
	<li>使用含0.5% Triton X-100的PBS溶液200 µL对细胞进行通透处理。将PCR管放入50 mL螺口离心管中，在室温下轻轻振荡孵育2小时。 
	注意：除非另有说明，所有孵育步骤均需在旋转仪、滚轴混合器或摇床上进行振荡（参见材料表），这对于实现均匀染色至关重要。固定后的类球体在PBS中有时会粘附在移液器吸头壁上。用0.5% Triton X-100冲洗吸头可减少类球体的粘附。</li>
	<li>弃去上一步溶液（步骤4.2），加入200 µL抗体稀释缓冲液（ABDIL）15，在室温下孵育过夜。</li>
	<li>移除ABDIL，加入75 µL用ABDIL稀释的一抗，于4 °C孵育2.5天。</li>
	<li>移除上清液，用含0.1% Tween和0.1% Triton X-100的PBS（PBS-TT）200 µL洗涤两次&#160;，再加入200 µL PBS-TT，在室温下孵育4小时。</li>
	<li>移除PBS-TT，加入100 µL用ABDIL稀释的二抗，于4 °C孵育2.5天。 
	注意：此步骤可加入DAPI或其他细胞核染料。大多数染料所需的孵育时间比抗体短。</li>
	<li>移除上清液，用200 µL PBS-TT洗涤两次，再加入200 µL PBS-TT在室温下孵育4小时。此时类球体已可进行封片。</li>
</ol>
5. 封片
<ol>
	<li>使用 200 µL 移液器，将固定并染色后的类球体转移至 500 µL PCR 管中，每种条件一管（约 10–15 个类球体）。</li>
	<li>用 200 µL 的 2% (w/v) 液态琼脂糖凝胶替换原有溶液，并在室温下以快速离心（固定最大转速，参见 材料表）离心 30 秒。 
	注意：除非立即进行封片，否则应将样品置于 50 °C 加热块中，以防凝胶硬化。</li>
	<li>用移液器吸取约 50 µL 含类球体的液态琼脂糖凝胶，滴加至 24 孔玻璃底培养板的孔中。</li>
	<li>在凝胶未凝固前，使用移液器吸头在周围凝胶中将类球体彼此分离，并确保类球体完全被凝胶覆盖。可选操作：将培养板置于冰上以加速凝胶凝固。 
	注意：每孔中类球体的数量取决于类球体的大小。类球体之间应保持足够距离，以确保成像时每次仅有一个类球体进入视野。这对自动图像处理至关重要。</li>
	<li>每孔加入 500 µL 透明化溶液（步骤 2），确保凝胶完全浸没。在室温下孵育至少 24 小时，随后在透明化溶液中对类球体进行成像。类球体在此溶液中于室温下可稳定保存长达一个月，前提是避免蒸发。</li>
</ol>
6. 成像
<ol>
	<li>选择一个工作距离足够长的物镜，以涵盖整个球状体，包括球状体在容器中的安装高度。 
	注意：需要工作距离为3 mm或更长的物镜才能对球状体的赤道平面进行成像。更高放大倍数且数值孔径（NA）更高的物镜可提供更好的分辨率，但会限制可成像球状体的最大深度。</li>
	<li>为确定赤道平面，调节焦距直至在XY平面上达到最大表面积，并使用所需的激光功率百分比、检测器电压、增益和偏移设置进行成像。 
	注意：激光功率百分比、检测器电压、增益和偏移设置会因荧光染料、染色强度、激光强度、检测器灵敏度等因素而有显著差异。</li>
	<li>对于三维图像，在成像前设置球状体的起始和终止位置，并利用z轴强度校正设置，在不同z深度选择适当的信号强度。 
	注意：为获得最佳图像分辨率，x、y和z方向应采用奈奎斯特采样率（详见参考文献16）。</li>
</ol>

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<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li>
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<li>Browning, A. P., Murphy, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrowning%2C+AP+%22Zenodo%22">Zenodo</a>. , (2021).</li>
<li>Browning, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+tumour+spheroid+structure%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of tumour spheroid structure.</a> eLife. 10, 73020(2021).</li>
<li>Klowss, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stochastic+mathematical+model+of+4D+tumour+spheroids+with+real-time+fluorescent+cell+cycle+labelling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+The+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">A stochastic mathematical model of 4D tumour spheroids with real-time fluorescent cell cycle labelling.</a> Journal of The Royal Society Interface. 19 (189), 20210903(2022).</li>
<li>Murphy, R. J., Browning, A. P., Gunasingh, G., Haass, N. K., Simpson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+and+interpreting+4D+tumour+spheroid+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Designing and interpreting 4D tumour spheroid experiments.</a> Communications Biology. 5 (1), 91(2022).</li>
</ol>

Olympus 赞助了出版费用。

本文介绍了一种获取高质量肿瘤类球体二维和三维图像的实验方案。现有的透明化方法，如CLARITY、See deep brain（SeeDB）和ScaleS，常导致高达30%的尺寸形变；而苯甲醇/苯甲酸苄酯（BABB）和溶剂清除器官三维成像（3DISCO）等技术则可能淬灭荧光蛋白18。许多此类方法专为具有完整结构的组织透明化设计，应用于类球体时易引起尺寸和结构的形变18。与使用商业化的昂贵透明试剂的其他方案不同，本方案采用易于获取的耗材，同时保持良好的光学透明性、内源性荧光，并最大限度减少尺寸形变。将类球体包埋于琼脂糖-PBS凝胶中，可为类球体提供结构支撑，并在加入透明溶液时最小化渗透压冲击，这对于药物处理后脆弱类球体的成像尤为关键。由于本方案源自整体组织透明化技术，因此可假设该光学透明方法适用于任何方法形成的类球体。这一假设基于不同类球体形成方法所获得的类球体在结构上的相似性。固定剂的选择可能影响类球体的尺寸及内源性荧光。本透明化方法适用于经中性4%多聚甲醛（PFA）溶液固定的类球体，与其他固定剂的兼容性尚需进一步验证。
由于该技术能够在多孔板中同时固定多个类球体，因此非常适合需要从每块24孔板最多360个类球体获取结构信息的定量分析流程。配备自动载物台和孔板定位功能的显微镜可减少成像过程的手动操作。尽管该方法比切片更快、更简便，但目前尚不适用于完全自动化。然而，通过该方法获得的图像适用于自动化的图像处理4,19，且按照本方案固定类球体的速度有利于对类球体内部结构进行定量分析20,21,22。
对于完整类球体的染色，每种抗体的抗体浓度、体积和孵育时间均需优化。作为参考，可使用推荐的二维免疫荧光抗体浓度的2.5倍，并根据每管中类球体的数量，加入100–200 µL抗体溶液。确保在旋转器上孵育时，所有类球体均被染色液完全覆盖。孵育时间取决于多种因素，包括类球体的大小、密度以及所用抗体的特性，通常可在16–72小时之间。尽管该方法能够实现类球体内部更深层信号的检测，但由紫外光激发的荧光染料会引起显著的光散射，导致信噪比较低。因此，在选择用于目标蛋白检测的荧光染料时需格外谨慎。例如，对丰度较低的蛋白或结构蛋白使用长波长荧光染料，而对丰度较高的蛋白或核染料使用短波长荧光染料，可获得最佳成像效果。最后，即使经过透明化处理的类球体，在坏死核心区域仍会因光散射而出现信号衰减，这在600 µm类球体的y/z维度图像中尤为明显（图2C）。
使用本方案进行固定和透明处理的类球体，可实现采用更高数值孔径物镜的高倍成像，但物镜的工作距离限制了成像深度。对于油浸物镜，为获得最佳效果，必须使用折射率为1.51的浸油。
综上所述，使用常见的耗材即可通过琼脂糖-PBS凝胶包埋透明化方法实现对类球体内部深层细胞的可视化观察。采用该方法固定并透明化的类球体经历的尺寸形变极小，且能保持其结构完整性，从而可获取有关类球体内部结构的高质量数据，并实现后续的自动定量分析。

三维（3D）细胞培养模型（如球状体）可提供生物学上更真实且可重复的细胞聚集生长模型1,2。这类模型在基础研究和药物开发中正迅速普及，通过比较不同处理条件下球状体的大小和结构差异，以评估药物疗效3,4。在这些研究中，能够从大量球状体中获取详细信息具有显著优势，不仅可提高统计效力，还能快速评估多种处理条件下细胞的行为变化。
获取类球体结构的详细显微图像的常用技术，要么耗时较长，要么成本高昂，要么生成的图像质量较差，无法保留类球体大小等关键定量特征4,5。例如，基于冷冻切片的组织学技术虽可提供高质量图像，但通常耗时较长，需要熟练的技术人员操作，且常产生切片伪影6,7；而诸如单平面照明显微镜（SPIM）8和多光子显微镜9等精密技术则需要专用显微镜设备，难以普及。近年来，现代显微技术实现了所谓的光学切片，即将类球体置于折射率匹配的透明溶液中，利用共聚焦显微镜获取图像4,5。尽管这些技术具有高产出的潜力，但仍存在常见问题，包括成像过程中类球体移动、透明处理时的尺寸畸变，以及专用透明溶液成本高昂等。此外，许多现有方案仅适用于直径或深度小于300 µm或100 µm的较小类球体，限制了该技术在肿瘤生长早期阶段之外的应用5,10,11。
本实验方案采用一种低成本、基于全器官透明化技术衍生而来的折射率匹配透明溶液，可实现类球体结构的半高通量、高产率、高细节成像12,13。为防止成像过程中类球体移动，并提供结构支撑以减少尺寸形变，将类球体固定于含琼脂糖-PBS凝胶的24孔#1.5玻璃底板中。由于该技术允许在24孔板的每个孔内固定多个类球体，因此可在不同实验条件下快速固定并成像多达360个类球体（每孔15个）。使用由常规耗材配制的折射率匹配透明溶液，对固定后的类球体及其周围凝胶进行光学透明化处理。经过24小时沉降后，本方案可获得高质量的类球体二维和三维结构图像，即使对于直径约700 µm的较大类球体，其尺寸形变也小于2%。

<table><tbody><tr><td>#1.5 玻底 24 孔板</td><td>Celvis</td><td>P24-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>500 &amp;micro;L 透明 PCR 管</td><td>Sigma</td><td>HS4422</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 AffiniPure 驴抗小鼠 IgG (H+L)</td><td>Jackson Immuno research</td><td>715-605-151</td><td>使用稀释倍数 1:500</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>终浓度 2% w/v</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542-10MG</td><td>终浓度 5 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>去离子水</td><td>MILLI Q</td><td></td><td></td></tr><tr><td>驴抗兔 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 647</td><td>Thermofisher</td><td>A-31573</td><td>使用稀释倍数 1:500</td></tr><tr><td>DRAQ7</td><td>Thermofisher</td><td>D15106</td><td>使用稀释倍数 1:250</td></tr><tr><td>加热金属块</td><td>Ratek</td><td>DBH10</td><td>或类似设备</td></tr><tr><td>Hypoxyprobe 试剂盒</td><td>Hypoxyprobe</td><td>HP1-1000Kit</td><td>抗体稀释倍数 1:500</td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖粉末</td><td>Sigma</td><td>A9414</td><td>终浓度 2% w/v</td></tr><tr><td>微波炉</td><td>Sharp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&amp;prime;,N&amp;prime;-四(2-羟丙基)乙二胺</td><td>Sigma</td><td>122262</td><td>终浓度 9% w/w</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>终浓度 150 mM</td></tr><tr><td>NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td>终浓度 0.10% w/v</td></tr><tr><td>p27 Kip1 (D69C12) XP</td><td>Cell Signalling technology</td><td>3686S</td><td>使用稀释倍数 1:500</td></tr><tr><td>多聚甲醛溶液</td><td>Proscitech</td><td>C004</td><td>终浓度 4% w/v</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (PBS)</td><td>Thermofisher</td><td>18912014</td><td>终浓度 1x</td></tr><tr><td>移液器</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quickspin 小型离心机</td><td></td><td></td><td>或类似设备</td></tr><tr><td>滚轴混合器</td><td>Ratek</td><td>BTR10-12V</td><td>或类似设备</td></tr><tr><td>转子</td><td>Ratek</td><td>RSM7DC</td><td>或类似设备</td></tr><tr><td>摇床</td><td>Ratek</td><td>EOM5</td><td>或类似设备</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td>终浓度 44% w/w</td></tr><tr><td>Tris-HCl pH 7.4</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td>终浓度 20 mM</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>终浓度 0.10% v/v</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>终浓度 0.1% v/v</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td>终浓度 0.1% v/v</td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma</td><td>U5379</td><td>终浓度 22% w/w</td></tr></tbody></table>

用于肿瘤类球体半高通量分析的快速光学透明化

Rapid Optical Clearing for Semi-High-Throughput Analysis of Tumor Spheroids

肿瘤类球体在基础癌症研究和药物开发中正迅速变得普遍。获取类球体在细胞水平上的蛋白表达数据对于分析至关重要，但现有技术往往成本高昂、操作繁琐、使用非标准设备、导致显著的尺寸变形，或仅限于相对较小的类球体。本实验方案介绍了一种新的类球体包埋与透明化方法，可解决上述问题，同时允许对类球体内部结构进行共聚焦分析。与现有方法相比，该方案利用标准设备和实验室耗材，能够快速完成大量类球体的包埋和透明化处理。在引入折射率匹配的透明化溶液之前，先将类球体包埋于pH中性的琼脂糖-PBS凝胶溶液中，可最大限度减少其他类似技术中常见的尺寸变形。这使得在尺寸测量精度至关重要的情况下，仍可进行详细的定量与统计分析。此外，与液体透明化方法相比，琼脂糖凝胶技术能将类球体固定在原位，便于采集三维（3D）共聚焦图像。本文详细阐述了该方法如何获得高质量的二维和三维图像，从而提供有关细胞间异质性及类球体内部结构的信息。

为了展示该透明化方法获取高质量二维和三维图像的能力，使用转导了荧光泛素化细胞周期指示剂（Fluorescent Ubiquitination-based Cell Cycle Indicator, FUCCI）的黑色素瘤细胞系 FUCCI-WM164 和 FUCCI-WM983b9,17 培养生成直径为 300–600 µm 的球状体。这些细胞系分别在细胞周期的 Gap1 期表达单体 Kusabira Orange2（mKO2）蛋白，在早期 S 期/Gap2 期/有丝分裂期表达单体 Azami Green（mAG）蛋白，具体操作依据步骤 3 提供的方案进行1,3,14。随后将球状体在 37 °C 条件下用 4% 甲醛溶液固定，进行通透处理，并使用抗 p27kip1/抗兔 Alexa Fluor 647、抗匹莫硝唑/抗鼠 Alexa Fluor 647、DAPI 或 DRAQ7 染色（见材料表）（图 2）。所有显微镜图像文件均已上传至 GitHub 仓库（https://github.com/ap-browning/SpheroidMounting）。与 PBS 封片的球状体相比，透明化溶液可提供清晰度更高且尺寸畸变最小的图像（图 2A）。本方案无需组织切片即可实现对球状体内部细胞水平细节的高分辨率成像，其中横截面图像使用 20 倍空气物镜（0.7 NA）以 4096 × 4096 px 分辨率获取，无需拼接（图 2B）。使用较低放大倍数、较低数值孔径但工作距离更长的物镜，可获得深度至少达 200 µm 且具有细胞水平细节的三维共聚焦图像（图 2C）。此外，还按照 Spoerri 等人4 的方案对球状体进行冷冻切片染色，并与完整球状体染色结果进行比较（图 2D、E）。图 2D 显示了由匹莫硝唑标记的球状体缺氧区域，图 2E 显示标记细胞周期阻滞的 p27kip1 染色（黄色）以及 DAPI 核染色（灰色）。冷冻切片与透明化处理后的蛋白定位及染色模式相似，表明该透明化方法未对结果产生影响。
在 z 轴上进行信号强度校正，可实现整个类球体的成像。然而，由于坏死核心引起的光散射，限制了对类球体远端区域的成像能力。使用近红外荧光染料（如 DRAQ7 核染色剂）可实现更深的穿透和更少的光散射，从而进一步改善三维类球体结构的成像效果（图 3）。视频 1 展示了经 DRAQ7 染色的 FUCCI 类球体的三维重建图像。虽然更薄的 z 轴切片可能提高 z 轴分辨率，但这会显著延长成像时间并加剧荧光染料的光漂白。
为了确定透明化溶液是否引起尺寸变形，将12个包埋于2%琼脂糖-PBS凝胶中的类球体在加入透明化溶液后的6小时、12小时、24小时、72小时和168小时进行成像。通过测定类球体的直径来汇总图像数据，该直径定义为与类球体具有相同横截面积的球体的直径（图4A）。尽管在最初6小时内观察到类球体尺寸略有增加，表现为直径倍数变化在2%至6%之间（图4B），但在24小时至72小时后，类球体的尺寸恢复至与PFA固定后在PBS中相应的尺寸大致相等的水平（图4C）。
<img alt="细胞培养制备步骤：类球体转移、PBS凝胶添加、24孔板孵育示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64103/64103fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 1"> 
图1：类球体包埋与透明化流程示意图。 固定并染色后的类球体被转移至500 µL离心管中；用200 µL琼脂糖-PBS凝胶替换多余液体后离心。随后将类球体转移至24孔板中的玻底孔内。待凝胶完全凝固后，加入500 µL透明化溶液，使类球体充分平衡。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64103/64103fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用FUCCI进行类球体的细胞成像；PBS和透明化处理后的显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64103/64103fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：透明化处理与未透明化处理的FUCCI人黑色素瘤类球体的比较。 着色表示mKO2阳性细胞核（红色），指示处于G1期的细胞；以及mAG阳性细胞核（绿色），指示处于G2期的细胞。(A) 由5000个FUCCI-WM983b细胞培养的类球体，在第10天收获，并在琼脂糖-PBS凝胶中成像，以及加入透明化溶液24小时后成像。比较透明化处理前后明场和共聚焦图像，显示尺寸畸变极小，清晰度显著提高。图像使用10倍物镜获取。(B) 由FUCCI-WM164细胞培养的类球体，使用Triton X-100进行通透化处理，并用DRAQ7染色，标记所有细胞核。图像使用20倍物镜（0.75 NA）获取，表明透明化溶液可实现细胞水平细节的高分辨率成像。(C) 在PBS中及加入透明化溶液24小时后，对FUCCI-WM164类球体获取三维图像（10倍，0.4 NA）。在不同z平面调节激光功率、电压和偏移量，可实现类球体内部更深层的成像。(D,E) 冷冻切片与透明化整体类球体在pimonidazole和p27kip1染色上的比较。(D) magenta色的pimonidazole染色显示类球体中的缺氧区域。红色和绿色表示FUCCI信号。(E) 冷冻切片与透明化类球体显示DAPI（灰色）和p27kip1（黄色）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64103/64103fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜分析；荧光显微镜；细胞球体图像阵列；尺寸梯度" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64103/64103fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3透明化处理可最大限度减少光损失，从而实现对类球体更深层的成像。 10倍物镜、较低数值孔径（0.4）下拍摄的FUCCI人黑色素瘤类球体的共聚焦显微镜图像，可在较高z轴深度下成像且信号损失最小。A) 3.88 µm 用 DRAQ7 染色的球状核切片。B-D在488（mAG）、568（mKO2）和647 nm（DRAQ7）通道中的y/z分辨率分别为。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64103/64103fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="PBS中的颗粒尺寸分布、直径倍数变化图；随时间推移的数据分析（实验）" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64103/64103fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：透明化溶液对类球体尺寸的影响极小。(A) PBS凝胶中类球体初始尺寸（等效直径）的分布（n = 12 个类球体）。(B) 添加透明化溶液后随时间变化的直径倍数变化。0 h时，类球体仅处于PBS凝胶中。(C) 12 h、24 h和72 h时直径倍数变化的分布。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64103/64103fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
视频 1：经 DRAQ7 染色的 FUCCI 类球体的三维重建图像。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64103/Movie%20S1.zip" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>

肿瘤类球体正越来越多地被用于评估肿瘤细胞与微环境之间的相互作用以及治疗反应。本方案描述了一种利用快速光学透明化技术对三维肿瘤类球体进行半高通量成像的稳健且简便的方法。

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我的实验室专注于三维和四维肿瘤建模。肿瘤类球体模型在生物学和药物发现领域被广泛应用。然而，目前从这些实验中采集数据的现有方案成本高昂、操作困难且存在局限性。本方案所需的化学试剂和设备易于获取，与目前可获得类似结果的方法相比，劳动强度较低。本方案设计为初学者相对容易实施，且对小错误具有较强的容错性，因为许多步骤是可逆的。首先，在玻璃瓶中称取 0.5 克低熔点琼脂糖。加入25毫升PBS。将溶液在微波炉中加热煮沸30至60秒，盖上盖子并持续旋转，以溶解琼脂糖。称取9克N, N, N'N'四(2-羟丙基)乙二胺、22克尿素、44克蔗糖、0.1克Triton X-100和24.9克去离子水。将溶液置于 56 摄氏度的水浴中加热，并持续搅拌。待晶体完全溶解后，将溶液静置于室温，使混合过程中产生的气泡上升至液面。采用文中所述的琼脂糖覆盖法生成球状体。使用手术刀切下一毫升移液枪头的尖端，以扩大其开口。用移液器将球状体从孔中吸出，并转移至一个透明的1.5毫升锥形管中。相同条件下的多个球状体可合并至同一根管中。用一毫升磷酸盐缓冲液将类球体清洗两次，然后加入中性的4%预热多聚甲醛溶液，并在37摄氏度下孵育类球体。20分钟后，移除多聚甲醛溶液，并用一毫升磷酸盐缓冲液将类球体再次清洗两次。随后进行染色时，使用移液器将最多15个类球体转移至一个200微升的PCR管中。使用含有0.5% Triton X-100的PBS溶液200微升对细胞进行透化处理。将PCR管放入50毫升带螺口盖的离心管中，用铝箔包裹管子，并在室温下轻轻振荡孵育类球体。两小时后，更换为200微升抗体稀释缓冲液，并在室温下过夜孵育。第二天，加入一抗前先移除抗体稀释缓冲液，随后加入75 µL一抗，在4°C条件下孵育2.5天。孵育结束后，移除上清液，并用200 µL含0.1% Tween和0.1% Triton X-100的PBS（即PBS-TT）将类球体洗涤两次。然后在室温下用200 µL PBS-TT孵育4小时。接下来，在加入100微升二抗之前，先移除PBS-TT，并在4摄氏度下孵育两天半。孵育结束后，移除上清液，用PBS-TT洗涤两次，然后加入200微升PBS-TT，继续孵育4小时。进行封片时，使用200微升移液器将固定并染色的类球体转移至500微升PCR管中，每种条件对应一管。加入 200 微升 2% 液体琼脂糖凝胶替换原有溶液，于室温下以固定最大转速快速离心 30 秒。用 50 微升液体琼脂糖凝胶重悬类球体，并将其接种至 24 孔玻璃底板的孔中。在凝胶凝固前，使用移液器吸头将类球体周围的凝胶分离，确保类球体被凝胶完全覆盖。接下来，每孔加入500微升透明溶液，将凝胶完全浸没，并在室温避光条件下孵育24小时，然后进行成像。成像时，选择工作距离足够长的物镜，以确保涵盖整个类球体，包括类球体在容器中的安装高度。为确定赤道平面，调节焦距直至在XY平面上观察到最大表面积，然后使用所需的激光功率百分比、检测器电压、增益和偏移设置进行成像。对于三维图像，设置类球体的起始和终止位置，并利用Z轴强度校正设置，在不同的Z深度选择适当的信号强度。本研究展示了透明化与未透明化的FUCCI人黑色素瘤类球体与PBS封片的类球体之间的比较。透明化溶液可提供高清晰度图像，且尺寸畸变最小。透明化溶液可进一步实现对类球体更深层细胞水平细节的高分辨率成像，而无需进行组织学切片。通过三维共聚焦成像，可获得深度达200微米处的细胞水平细节。此外，还展示了经冰冻切片与透明化完整类球体在pimonidazole和p27kip1染色后的对比结果。匹莫尼唑染色显示类球体的缺氧区域，p27kip1染色标记细胞周期阻滞，DAPI为细胞核染色。更深的穿透能力和更少的散射使得三维类球体结构的呈现更加清晰，同时光损失最小。图中展示了用DRAQ7染色的FUCCI类球体的三维重建图像。透明溶液对类球体大小的影响极小。类球体的直径是根据与类球体具有相同横截面积的球体来定义的。在前六小时内，类球体的尺寸略有增加，直径倍数变化介于2%至6%之间。相比之下，在24至72小时后，类球体的尺寸恢复至与多聚甲醛固定后在PBS中相应的尺寸大致相等。成像前至少需要等待 24 小时，以使透明化溶液与类球体及凝胶充分平衡。本方案使研究人员能够快速从大量类球体中收集数据，从而进行详细的定量数学与统计分析，深入揭示其生物学特性。

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