Name: 生理患者衍生的3D类血球体用于抗肿瘤药物筛选,以靶向癌症干细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: 了解患者来源3D类血球体生成方法，用于卵巢癌靶向治疗与化疗耐药性研究。该技术支持高通量药物筛选和精准医疗，通过悬滴模型模拟生理环境，实现个体化药物反应评估。

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本研究主要由美国国防部卵巢癌研究计划早期职业研究者奖 W81XWH-13-1-0134（GM）、美国国防部试点项目奖 W81XWH-16-1-0426（GM）、美国国防部研究者发起项目奖 W81XWH-17-OCRP-IIRA（GM）、Rivkin 卵巢癌研究中心以及密歇根卵巢癌联盟资助。本出版物中报告的研究由美国国立卫生研究院国家癌症研究所资助，项目编号为 P30CA046592。CMN 获美国国家科学基金会研究生研究奖学金（资助号 1256260）支持。MEB 获美国教育部国家急需领域研究生资助（GAANN）奖学金支持。

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作者无任何利益冲突需要披露。

用于3D球状体形成的384孔悬滴培养板平台是一种易于实施的工具，适用于任何细胞生物学或癌症生物学实验室。该生理学平台能够在具有生理相关性的三维培养环境中研究细胞系以及原代患者样本，同时支持高通量药物筛选。该平台还可高度调节培养条件，精确控制接种密度、细胞&#160;共培养比例、细胞外成分及培养基组成。此外，该生理学平台使实验能够高度兼容下游分析技术，适用于需要大量或少量细胞的检测方法，如qRT-PCR、FACS以及多种成像技术。尽管操作熟练程度需通过经验积累，但新学员一旦掌握移液的速度与技巧，即可迅速成功操作。因此，该生理学平台非常适用于个体化3D药物筛选、肿瘤干细胞（CSC）生物学及化疗耐药性研究。
在首次实施该平台时，需要注意的几个问题包括培养板转移和药物处理。在进行常规换液、成像和分析等操作而需要将培养板从一个位置转移到另一个位置时，应采取谨慎措施，避免不必要的晃动。应从培养板的外缘抓握，并尽可能保持其水平，在放置培养板时注意避免突然的撞击动作。这有助于防止液滴丢失或相邻液滴合并。同样，在对悬滴球状体&#160;进行药物处理时也应保持高度警惕，以避免某个悬滴球状体的给药剂量错...

2018年，全球与癌症相关的死亡人数达到980万1，凸显了开发更有效治疗手段的迫切需求。然而，抗癌药物的研发成本不断上升，单个药物的研发费用约为6.5亿美元2，表明亟需改进新抗癌药物的开发策略。癌症干细胞（CSCs）具有更强的耐药性3、自我更新能力以及形成新肿瘤的能力4，被认为与肿瘤复发4、转移5和化疗耐药4,6密切相关，这些因素共同导致了肿瘤的恶性程度升高，从而造成高死亡率。在卵巢癌中，这些细胞在腹腔内的恶性腹水中富集，而该状况通常与不良的临床预后相关1。由于CSCs具有上述恶性特性，目前正积极推动开发靶向CSCs的新药，并将其与传统化疗联合使用。然而，靶向CSCs药物的研发面临若干挑战，包括：1）体外扩增和维持CSCs困难；2）患者样本稀缺；3）培养平台的生理相关性不足；4）不同患者之间药物敏感性存在异质性。本实验方案介绍了一种高通量三维培养平台的应用，可有效克服上述各项挑战。该系统尤其适用于利用少量来源于患者的卵巢癌干细胞进行快速药物筛选，并且高度兼容后续分析技术。尽管该平台非常适合研究卵巢癌和CSCs，也可广泛用于在复杂的三维环境中研究其他类型的癌症及分化细胞。
复杂的三维（3D）模型在研究肿瘤微环境（TME）中至关重要，TME 是由癌细胞、非癌支持细胞和细胞外基质（ECM）蛋白构成的三维生态位4。与传统的二维体外细胞培养相比，这种三维环境导致了独特的细胞形态、细胞间及细胞与基质间的相互作用、细胞分化、细胞迁移、细胞密度以及扩散梯度4。所有这些因素共同导致三维培养中出现不同的药物反应，表现出更强的耐药性和更高的生理相关性7,8。由于三维 TME 在肿瘤干细胞（CSC）分化和化学耐药性中起关键作用，因此在生理相关的微环境中筛选靶向 CSC 的药物至关重要。提高 CSC 药物筛选平台的生理相关性，有望改善针对患者的个体化药物筛选、药物开发、治疗策略制定，最终提升临床疗效。同样重要的是，用于药物筛选的平台应具备高通量特性，并能与下游分析方法兼容，以最大限度地降低有前景药物的成本、缩短研发时间和临床转化周期9。
目前，在药物筛选应用中，体内模型（如小鼠同源肿瘤模型、细胞系来源异种移植模型和患者来源异种移植（PDX）模型）12 仍能最好地维持复杂的肿瘤微环境（TME），因为它们可提供生理条件。然而，这些模型通量较低，且成本高、耗时长、技术要求高，限制了其在快速、高通量药物筛选中的应用13。作为这些体内模型的替代方案，已开发出多种体外三维模型，包括利用水凝胶的培养系统8、微流控装置或“器官芯片”装置中的培养10,14，以及非黏附性培养系统3,8，这些模型因成本低、耗时短、技术门槛低而具有较高的可及性。
水凝胶培养平台在基质成分、力学性能和基质结构的精细调控方面具有优势15；然而，它们可能限制高密度细胞培养14。此外，由于收获方法可能对细胞造成损伤，从水凝胶中回收细胞可能会使后续分析变得复杂15。相比之下，微流控装置是一种微尺度设备，可在同一装置内实现输出检测，并在生理相关尺度上进行细胞培养，同时试剂消耗极少、反应时间缩短、废物产生减少且扩散迅速14。这些特性使其成为研究药物毒性、药效及药代动力学的有前景平台。然而，高效、可量化、可重复且操作简便的三维细胞培养所面临的挑战，以及庞大且昂贵的泵送系统，限制了微流控技术在高通量研究中的应用10。此外，检测系统的高效构建以及在不同领域推广应用的潜在困难，也阻碍了微流控系统的广泛采用10。
相反，在非黏附条件下通过旋转混合器（nutator）、超低黏附培养板或悬滴法生成的类球体不包含用户定义的基质成分。这些方法在研究卵巢癌时尤为重要，因为非黏附条件模拟了类球体在腹腔内生长的环境5。在这些非黏附培养方法中，与超低黏附培养板生成的类球体相比，nutator法和悬滴法生成的类球体表现出更高的致密性、基质重塑能力以及化疗耐药性，提示其具有更高的生理相关性16,17,18,19。由于悬滴培养板具有更小的孔径尺寸和更低的细胞用量，更适合高通量筛选，因此悬滴法生成类球体是药物筛选的理想平台。本文介绍一种可在384孔悬滴培养板中调节的三维生理学平台，该平台易于实施，并且非常适合后续分析，是进行卵巢癌及卵巢肿瘤干细胞（CSCs）高通量药物筛选的理想选择。
我们的三维生理平台具备三维培养的所有优势，包括生理性的细胞间接触、扩散梯度、细胞密度以及自然分泌的细胞外基质（ECM）蛋白，这些因素可能有助于产生更真实的药物反应16,17,18,19。此外，通过使用患者来源的肿瘤干细胞（CSCs）构建这些球状体，我们能够同时进行多次技术重复，测定患者对药物的特异性反应1，从而克服患者肿瘤样本中可能存在的异质性20。进一步研究表明，三维培养有助于维持CSC群体的稳定性3,16，因此更能代表腹水中富集的CSC群体7。结合简便的下游分析方法，如通过流式细胞术检测细胞活力和CSC比例，可实现对靶向CSC药物疗效的最佳评估。最后，该生理平台支持在实验过程中多个时间点进行成像分析，可用于评估细胞死亡与增殖、通过免疫组织化学分析细胞排列与形态、通过培养上清的ELISA检测可溶性信号分子、通过流式细胞术分析细胞表型，以及通过PCR检测基因表达水平。

<table><tbody><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>ILT25200056</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 血清移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>10,000 cSt Si 油</td><td>Millipore Sigma</td><td>63148-62-9</td><td>用于包被类球体阵列模具，以促进组织处理凝胶（如 Histogel）从模具中脱模。</td></tr><tr><td>100 mm 组织培养皿</td><td>Thermo Scientific</td><td>130182</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 圆锥形离心管</td><td>Celltreat</td><td>FL4021</td><td></td></tr><tr><td>1× DMEM 无血清培养基</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>1× F12 无血清培养基</td><td>Gibco</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>1× 磷酸盐缓冲液 (PBS)</td><td>Gibco</td><td>ILT10010023</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;,6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI)</td><td>Thermo Fisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m 滤膜</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Fisher Scientific</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies Inc.</td><td>1449</td><td>一种温和的细胞解离酶，由蛋白水解酶和胶原酶组成。</td></tr><tr><td>ACK 裂解缓冲液</td><td>Thermo Scientific</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>alamarBlue</td><td>Invitrogen</td><td>DAL1025</td><td>刃天青染料，通过检测细胞将刃天青还原为高荧光性的试卤灵的能力，来评估细胞的活力和增殖能力。</td></tr><tr><td>ALDEFLUOR 检测试剂盒</td><td>Stem Cell Tech</td><td>1700</td><td>用于鉴定高表达醛脱氢酶的干细胞和祖细胞的试剂盒，该酶是肿瘤干细胞的标志物。试剂盒包含 ALDEFLUOR 试剂、DEAB、盐酸、二甲基亚砜和 ALDEFLUOR 检测缓冲液。</td></tr><tr><td>ALDEFLUOR 二乙氨基苯甲醛 (DEAB)</td><td>Stem Cell Tech</td><td>1705</td><td>二乙氨基苯甲醛 (DEAB) 是 ALDH 同工酶的抑制剂，用于确定非特异性 ALDH 染色。</td></tr><tr><td>Andor iXon x3 CCD 相机</td><td>Oxford Instruments</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>抗生素和抗真菌剂</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>APC-同型 IgG2b</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-092-217</td><td>同型对照，用于量化 IgG2b 抗体的非特异性染色。</td></tr><tr><td>B27 添加剂</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>碱性成纤维细胞生长因子</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>78003.1</td><td></td></tr><tr><td>BD Lo-Dose U-100 胰岛素注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-79</td><td></td></tr><tr><td>BioTek Synergy HT 微孔板读数仪</td><td>BioTek</td><td>7091000</td><td></td></tr><tr><td>CD133-APC</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-113-184</td><td>靶向 CD133 的荧光抗体，CD133 是肿瘤干细胞的标志物。</td></tr><tr><td>cellSens Dimension 软件</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>顺铂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4394</td><td>一种基于铂的化疗药物，作为烷化剂发挥作用，可破坏 DNA。</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>表皮生长因子</td><td>Gibco</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>EVOS XL Core 细胞成像系统</td><td>Life Technologies</td><td>AME3300</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 - 优质 (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4375</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Hausser Scientific</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Histogel</td><td>Thermo Scientific</td><td>HG-4000-012</td><td>组织处理凝胶，可渗透并固定样本于凝胶中，同时防止染色时样本周围出现变色。</td></tr><tr><td>人脂肪来源的间充质干细胞</td><td>Lonza</td><td>PT-5006</td><td></td></tr><tr><td>人微血管内皮细胞</td><td>Lonza</td><td>CC2543</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂</td><td>Gibco</td><td>51500-056</td><td></td></tr><tr><td>活/死细胞活力检测试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td>基于荧光检测活细胞（钙黄绿素-AM）和死细胞（溴化乙锭同源二聚体-1）的试剂盒。</td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph 7.8 软件</td><td>Molecular Devices</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX81 倒置共聚焦显微镜</td><td>Olympus</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX83 研究型倒置显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Thomas Scientific</td><td>7315D35</td><td>热塑性聚合物薄膜，用于悬挂滴板中限制液滴蒸发，同时允许气体交换。</td></tr><tr><td>Perfecta 3D 384 孔悬挂滴板</td><td>3D Biomatrix</td><td>HDP1384-8</td><td>可通过 Sigma-Aldrich 购买</td></tr><tr><td>鬼笔环肽 AlexaFluor488</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td>鬼笔环肽是一种可对固定细胞中的 F-肌动蛋白进行荧光标记的多肽。</td></tr><tr><td>ProJet 3500 HD Max</td><td>3D Systems</td><td>-</td><td>3D 打印机</td></tr><tr><td>无菌去离子水</td><td>Fisher Scientific</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td>偶氮染料，根据其能否穿透死细胞受损的细胞膜（而不能穿透活细胞完整的细胞膜）来区分活细胞与死细胞。</td></tr><tr><td>VisiJet M3 Crystal</td><td>3D Systems</td><td>-</td><td>一种用于 3D 打印的生物相容性聚合物材料。</td></tr><tr><td>Yokogawa CSU-X1 共聚焦扫描装置</td><td>Yokogawa</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

用于靶向肿瘤干细胞的抗肿瘤药物筛选的生理性患者来源三维球体

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

本方案中，我们概述了在384孔悬滴板中生成肿瘤类球体的实验流程，旨在构建一种生理环境高度模拟的微环境，用于抗癌药物的高通量筛选。我们详细描述了患者来源的肿瘤干细胞类球体的形成过程，以及药物处理后对这些类球体进行深入分析的操作方法。具体包括类球体形态学、增殖能力、存活率、药物毒性、细胞表型及细胞定位数据的采集与分析。本方案重点介绍适用于384孔悬滴平台的多种分析技术，使其成为高通量药物筛选的理想工具。尽管我们特别强调该模型在卵巢癌研究及肿瘤干细胞研究中的重要性，但384孔平台同样适用于其他类型癌症及疾病模型的研究，因而具有广泛的科研应用价值。通过采用易于实施且生理相关性良好的三维培养体系，提升个体化药物筛选的速度与结果质量，该平台有望推动新型治疗药物及个体化治疗策略的开发，从而产生深远的临床影响。

使用细胞系或患者来源的CSCs形成的球状体，可在悬滴中以少量细胞形成（图 2A）。每个孔中仅需10个细胞即可稳定形成类球体，有助于节约珍贵的患者样本。这些类球体中的细胞在三维空间中被其他细胞包围，类似于体内环境，可实现生理性的细胞间接触和扩散速率。类球体内的肿瘤细胞不断增殖，导致类球体随时间推移逐渐增大。图2B）。由于更具侵袭性的患者细胞或细胞系比其对应细胞生长更快，因此量化每个样本的增殖能力，并考察药物处理对各样本增殖的影响至关重要。为此，可利用384孔生理学平台便捷地开展基于代谢活性的检测，例如基于刃天青的荧光检测法，无需收集类球体，检测结果如图所示 图2C可同时收获多个类球体，经固定、切片后，使用苏木精和伊红或免疫荧光抗体染色，以鉴定类球体内的细胞形态与排列结构，以及细胞类型和细胞外基质蛋白的分布情况（图2D，E).
<p class="jove_con...

本方案描述了患者来源类球体的生成及后续分析，包括增殖定量、细胞毒性检测、流式细胞术、免疫荧光染色和共聚焦成像，以评估候选药物作为抗肿瘤治疗剂的潜力。该方案有助于精准医疗，可为每位患者及疾病阶段确定特定药物。

在本方案中，我们概述了在384孔悬滴板中生成肿瘤球体的步骤，以实现高通量筛选……

本方案提供了一种简便的三维细胞培养方法，且非常适合进行下游分析。这有助于评估具有异质性的患者样本及其特定的药物反应。该技术的优势在于，可以在细胞数量较少的情况下形成类球体，从而既能保留珍贵的原代样本，又能实现针对患者个体化药物反应的高通量筛选。悬滴模型可构建出具有三维药物扩散和对应肿瘤阶段反应的生理环境。这有助于靶向治疗和个体化治疗方案的开发。该方法非常适合用于研究卵巢癌、肿瘤异质性以及化疗耐药性的形成。然而，该方法也可用于研究其他癌症及耐药性细胞群体。在接种类球体时，准确移取精确体积至关重要，以确保类球体之间的一致性。类球体及其相应的液滴本质上较为脆弱，若操作不当极易丢失，因此我们将展示如何正确地接种、维持和分析悬滴培养板。本实验操作由本实验室的研究生 Michael Bregenzer 进行示范。首先，在六孔板的每个孔中加入 4 至 5 毫升经高压灭菌的去离子水，然后将悬滴培养板夹在培养板盖子与底部之间。在悬滴板的边缘加入 800 至 1000 微升水，以提供湿润环境并尽量减少蒸发。接着，用胰蛋白酶消化贴壁细胞，使二维培养的细胞脱落，然后加入六至八毫升含胎牛血清（FBS）的培养基。用 10 毫升血清移液管吸取细胞悬液，转移至 15 毫升锥形管中。使用血细胞计数板对细胞进行计数。根据文稿说明制备细胞悬液，并用移液器轻轻吹打混匀，以确保细胞均匀分布。将移液器枪头以45度角插入孔中，向每个悬滴孔加入20 µL细胞悬液。将六孔板的盖子盖回，并使用弹性热塑性密封条密封边缘。置于标准的二氧化碳恒湿培养箱中孵育，每两到三天向含有类球体的孔中添加二至三微升细胞培养基以换液。为了定量分析细胞的增殖和活性，向指定用于增殖分析的孔中加入两微升过滤后的基于刃天青的溶液，并根据论文中的指示进行孵育。孵育结束后，在生物安全柜中打开悬滴夹心装置，将带有盖子的384孔板转移至酶标仪。将板放入酶标仪中并读取数据。在弹出窗口中保存实验，并将数据导出至电子表格中。将培养板放回六孔板底座，并置于培养箱中。当天所有时间点的检测完成后，在培养前重新密封培养板。为进行流式细胞术分析而准备类球体时，使用1000微升移液器从每个孔中收集类球体，并将其转移至15毫升锥形管中，用于解离。将细胞悬液分装至五个微量离心管中，每管至少含有 50,000 个细胞。在微量离心机中以 400 × g 离心 5 分钟，随后吸除上清液，并将沉淀重悬于 100 µL Aldefluor 缓冲液中。根据论文中的说明标记各管。向 APC ISO 管中加入 0.5 微升 APC 同型对照抗体，向 ALDH CD133 管中加入 1 微升 CD133 抗体。然后向 DEAB 管中加入 5 微升 DEAB 试剂和 0.5 微升 ALDH，向 ALDH CD133 管中加入 1 微升 ALDH。将所有管涡旋振荡数秒，并在 37°C 下孵

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Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

生理患者衍生的3D类血球体用于抗肿瘤药物筛选,以靶向癌症干细胞

本文介绍了一种利用水相两相系统在96孔板高通量格式中进行癌细胞球体机器人打印的实验方案。...

利用水相两相系统进行癌症细胞球体的机器人化生产以用于药物测试

确定能够从临床前测试顺利过渡到人体试验的新药物靶点是当前科学研究的重点。为此，本文介绍了一种功能基因组学方法，用于研究基因耗竭对癌细胞系球状体的影响，该模型能更真实地模拟人类癌症 体内.

利用功能基因组筛选鉴定肿瘤细胞球状培养物中潜在的新型药物靶点

我们描述了一种基于球体的三维模型的演变过程 体外...

基于球体的三维细胞培养模型在头颈部鳞状细胞癌治疗测试中的应用

在多种疾病适应症中，越来越多具有更高生理相关性的模型正被开发并应用于药物发现项目。本文所述的新型模型系统展示了如何在高通量的1536孔板系统中培养和筛选三维肿瘤球体，以寻找新的肿瘤学药物。...

用于药物筛选的高通量三维肿瘤球体的生成

本方案旨在实时评估免疫治疗性重定向T细胞（CAR...

CAR T细胞介导的类球体杀伤实验

光学相干断层扫描（OCT）是一种三维成像技术，可用于监测和表征多细胞肿瘤球体的生长动力学。本研究展示了基于体素计数法对肿瘤球体进行精确的体积定量分析，并利用内源性光学衰减对比实现无需标记的球体内坏死组织检测。...

利用光学相干断层扫描对三维肿瘤球体进行长期形态学与生理学监测

建立了一种基于肿瘤细胞与基质成纤维细胞异质相互作用的新型三维球体模型。本文介绍了肿瘤细胞与基质成纤维细胞的共培养、延时成像及共聚焦显微镜技术，用于可视化球体的形成过程。该三维模型为研究肿瘤-基质相互作用及筛选抗癌治疗药物提供了一个恰当的研究平台。...

一种新型的由基质成纤维细胞调控的三维肿瘤球模型，用于研究肿瘤-基质相互作用及药物发现

本方案介绍了一种新颖、稳定且可重复的培养体系，用于从Caco2结肠腺癌细胞生成并培养三维球状体。研究结果首次证明了该方法适用于癌症干细胞生物学研究，包括对化疗反应的研究。...

用于研究结肠癌干细胞的三维类球体模型

本实验方案描述了如何从原代癌细胞生成三维肿瘤培养模型，并通过细胞活力检测和显微镜观察评估其对药物的敏感性。...

建立源自患者肿瘤样本的三维肿瘤球体并评估其对药物的敏感性

本文展示了一种构建三维肿瘤球体的标准化方法。同时介绍了一种利用自动化成像系统对球体进行观察及基于图像的深度学习分析的策略。...

用于药物评价研究的三维肿瘤球体的生成

本文介绍一种用于鉴定可调节ADCC机制化合物的方法，ADCC是抗肿瘤抗体杀伤癌细胞的重要机制。通过该方法，在存在曲妥珠单抗（Trastuzumab）的条件下，检测自然杀伤（NK）细胞对乳腺癌细胞球状体的细胞毒性作用。图像分析可识别球状体中存活和死亡的效应细胞及靶细胞。...

在肿瘤类球体模型中定量抗体依赖性细胞介导的细胞毒性：用于药物发现的应用

了解患者来源3D类血球体生成方法，用于卵巢癌靶向治疗与化疗耐药性研究。该技术支持高通量药物筛选和精准医疗，通过悬滴模型模拟生理环境，实现个体化药物反应评估。

用于靶向肿瘤干细胞的抗肿瘤药物筛选的生理性患者来源三维球体

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