生理患者衍生的3D类血球体用于抗肿瘤药物筛选,以靶向癌症干细胞

该协议描述了患者衍生球体的生成,以及下游分析,包括增殖定量、细胞毒性测试、流式细胞测定、免疫荧光染色和共聚焦成像,以便评估药物候选人作为抗肿瘤治疗的潜力。该协议支持精密医学,用于识别每个患者和疾病阶段的特定药物。

我们的协议为3D细胞培养提供了一种简单的方法，并且非常适合下游分析。这有助于评估异构患者样本及其特定的药物反应。该技术的优点是，球体可以从小细胞数中形成，既可保存稀缺的原样品，又可对患者特异性药物反应进行高通量筛选。

悬滴模型创造了一个三D药物扩散的生理环境，并做与肿瘤阶段相对应的反应。这允许开发有针对性的疗法和患者特定的治疗。该方法是研究卵巢癌、异质性和化疗抗性发展的理想之选。

然而，它也可以用来研究其他癌症和抗药细胞种群。电镀球体时，移液器精确体积非常重要。这确保了球体之间的一致性。

球体及其各自的液滴本质上是脆弱的，在没有正确处理的情况下很容易丢失，因此我们将展示如何适当地对悬挂落板进行板式、维护和分析。演示这个程序将是迈克尔·布雷根泽，一个研究生从我们的实验室。首先，用四到五毫升的解洗脱压水填充六井板的每个井，将悬挂的落盘夹在盖子和板底之间。

在悬挂落盘边缘周围加入800至1000微升水，以提供潮湿的环境并最大限度地减少蒸发。接下来，收集2D生长细胞，用三足动物分离它们，然后加入六或八毫升含有FBS的介质。用10毫升血清移液器吸气细胞，并将它们沉积在15毫升锥形管中。

使用血细胞计计算细胞数。根据手稿指示准备细胞悬浮液，并轻轻地与移液器混合，以确保均匀分布。将移液器的尖端以 45 度的角度放入井中，将移液器 20 微升悬浮液放入每个悬挂落井中。

将六井板的盖子放回去，并使用弹性热塑性带密封边缘。在标准的二氧化碳加湿培养箱中孵育，每两到三天给挂滴喂食一次，在每个含球类的井中加入两到三个微升的细胞培养基。为了量化细胞的增殖和生存能力，在指定用于增殖分析和根据手稿方向孵育的井中加入两个微升的过滤雷萨祖林溶液。

孵育期后，打开生物安全柜中的挂滴三明治，将盖有盖的384井板固定到板读卡器上。将它放在板读卡器中并读取板。在弹出窗口中保存实验，将数据导出到电子表格中。

将板放回六井底座，并放在培养箱中。一旦读取了当天的所有时间点，在孵化前重新密封板。要准备用于流式细胞分析的球体，请使用 1000 微升移液器从每孔收集它们，并将它们存入 15 毫升锥形管中进行分解。

等离子细胞悬浮成5个微离心管，使每个管至少含有5万个细胞。在微离心中以 400 次 G 离心管，5 分钟，然后在 100 微升的 Aldefluor 缓冲液中吸升液和重新悬浮颗粒。根据手稿指示对管子进行标记。

在 APC ISO 管中加入 0.5 微升 APC 等型抗体，在 ALDH CD133 管中加入 1 微升 CD133 抗体。然后将五微升的DEAB试剂和0.5微升的ALDH添加到DEAB管中，在ALDH CD133管中加入1微升ALDH。漩涡所有管几秒钟，并在37摄氏度孵育45分钟。

孵育后，再次涡流所有管，并在400次G下离心5分钟。根据手稿方向标记 FACS 管，并用冰填充绝缘泡沫容器。从微离心管中吸出上流液。

然后重新挂起 400 微升 FACS 缓冲液中的未污染控制，并在 400 微升 FAPI 缓冲液中重新挂起其余单元。将管子放在冰上，直到它们可以在流动的圆度仪上进行分析。使用 FlowJo 分析流式细胞仪中的数据。

双击未污染的文件，将 Y 轴设置为侧散点高度或 SSCH，将 X 轴设置为向前散射高度或 FSCH。单击每个轴旁边的 T 按钮以调整比例并最大化不同细胞群之间的分离。接下来，单击多边形浇注按钮，在单元格总体周围绘制多边形门并标记总体单元格。

双击工作区中的单元格总体，然后将 FSC 轴更改为 FSC 宽度，将 SSC 轴更改为 FSC 高度。选择矩形门，仅围绕最左侧密集的单元格群体周围绘制一个矩形，跨越整个 Y 轴。标记此门单单元。

然后右键单击并复制嵌套的单单元格门中的此单元格，并将其粘贴到工作区的每个样本下。双击嵌套在 DAPI 样本下的单细胞门，以查看该样本管中的单个细胞总体。将 FSC 轴通道更改为 DAPI 区域通道，然后将 SSC 轴通道更改为直方图。

单击 DAPI 轴旁边的 T 按钮，然后单击自定义轴以调整比例并最大化 DAPI 正峰和 DAPI 负峰之间的分离。单击弹出窗口中的"应用"并选择"范围门"按钮。将它铺在 DAPI 负峰上，并为此门实时单元格添加标签。

复制活细胞门并将其粘贴在单细胞门下，在 APC ISO DEAB 和 ALDH CD133 管下，选择每个管中相同部分的活细胞。然后双击嵌套在 APC ISO 样本文件下的实时单元格总体，然后将 X 轴切换到 ALDH 区域，将 Y 轴切换到 APC 区域。应用象限门并调整栅极的交点，例如大约 0.5% 的人口位于绘图窗口的左上角。

然后根据需要命名象限，然后复制并粘贴象限门到嵌套在 DEAB 文件下的活细胞群，并调整垂直线，使大约 0.15% 的单元格群位于 ALDH 正象限内。最后，复制并粘贴象限门到ALDH CD133文件活细胞种群和评估癌症干细胞比例的基础上ALDH和CD133比例。该协议可用于患者衍生的癌症干细胞的高通量分析。

每井只有10个细胞可以形成可靠的球体，随着细胞的增殖，球体的大小会扩大。增殖能力可以很容易地量化与雷萨祖林为基础的荧光测定。药物对球状形态的影响可以通过相位对比成像来可视化，并通过比较未经治疗和治疗的细胞中的雷萨祖林荧光来量化。

细胞死亡可以通过添加钙素-AM和同性I来验证球体，随后在共声显微镜上成像。最后，球体可以收获并分散到单个细胞悬浮液中，用于流式细胞学分析，从而能够辨别不同药物治疗对特定细胞群的有效性。为了避免液滴丢失、中等蒸发和球状尺寸的变化，重要的是小心处理您的板，精确移液器，并完全密封悬挂滴板。

为了评估药物治疗导致的基因表达和可溶性信号的变化，单细胞RNA测序和酶相关免疫吸附测定，可用于促进治疗的发展。该技术允许肿瘤学、精密医学和药物开发领域的研究，通过小活检的高通量药物筛选，探索患者内部和患者之间的异质性以及化疗耐药性。执行此协议时，请务必佩戴所有标准个人防护设备。

包括手套、安全眼镜、实验室外套、裤子和近趾鞋。