Name: 福尔马林固定、石蜡包埋细胞沉淀免疫组化对照的标准化处理 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-27T14:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: 学习福尔马林固定和石蜡包埋细胞沉淀的标准化制备方法，用于免疫组化对照实验。该方案使用293T细胞系建立阳性和阴性对照，确保抗体特异性检测的准确性，为生物标志物开发和治疗研究提供可靠的技术支持。

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我们谨感谢基因泰克公司研究部门同事们的合作，特别是病理学核心（P-core）实验室的同事们，他们多年来为这些方法的开发做出了贡献。

1. 细胞沉淀制备
<ol>
	<li>在4至8个150 mm2培养皿或8个T175培养瓶中，按照目标细胞系推荐的培养基和培养条件培养细胞，使其达到80%–90%融合度。例如，将293T细胞培养于含10%胎牛血清和2 mM L-谷氨酰胺的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中15。 
	注意：应根据目标细胞系所需的特定条件和培养基进行细胞培养16。不同细胞系的培养条件可能有所不同，但后续的细胞沉淀方法应可适用于不同培养条件下的各种细胞系。</li>
	<li>当细胞接近融合（80%–90%）时，使用真空移液器吸除培养基，并用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞。</li>
	<li>向每个培养瓶中加入5 mL 5–10 mM EDTA，于37 °C孵育5–10分钟。轻轻敲击培养瓶侧面以使细胞脱落。 
	注意：请勿使用胰蛋白酶，因其可能切割细胞表面表位，从而对某些抗原产生不利影响。
	<ol>
		<li>待细胞脱落后，向每个培养瓶中加入5 mL该细胞系所用的生长培养基（例如，293T细胞使用DMEM），然后将细胞转移至50 mL锥形管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在室温下以930 × g离心5分钟。离心后，用真空移液器吸除上清液及EDTA。</li>
	<li>用10–20 mL 1× PBS洗涤细胞沉淀；若使用多个培养板或培养瓶，应将所有细胞汇集至同一个50 mL锥形管中（如图1所示实验中约合并六个T175培养瓶的细胞）。</li>
	<li>以930 × g离心5分钟。离心后，用真空移液器吸除PBS。</li>
	<li>将含有细胞沉淀的离心管置于湿冰上，直至进行固定。 
	注意：保持细胞低温可抑制降解酶活性，减少细胞自溶及相关蛋白质变化，包括蛋白质定位的改变。</li>
</ol>
2. 细胞沉淀的固定
<ol>
	<li>通过向3 mL细胞沉淀中加入30 mL 10%中性缓冲甲醛溶液，使固定剂与细胞的体积比达到10:1（vol:vol），进行固定。</li>
	<li>将盖紧盖子的50 mL离心管反复倒置，直至细胞完全悬浮。 
	注意：在完全固定前若形成致密的细胞沉淀，可能导致固定不均匀，从而在后续染色和免疫标记过程中产生人为假象。</li>
	<li>将细胞悬液在室温下静置过夜。</li>
	<li>次日再次倒置离心管以重新悬浮细胞，增加表面积与体积之比，以提高固定效果。 
	&#8203;注意：不建议也不需要使用涡旋振荡器处理细胞沉淀，因其可能导致细胞损伤。</li>
</ol>
3. 细胞沉淀的修剪与处理
<ol>
	<li>固定24小时后，将50 mL锥形管在5 °C条件下以930 × g离心10–15分钟。确保管盖拧紧，对称分布并平衡放置于离心机中。 
	注：可根据实验室所用组织固定时间或特定实验条件的要求，调整固定时间。</li>
	<li>离心后，确认细胞形成可见的沉淀。通过倾倒和/或使用无菌移液管小心吸除固定液。</li>
	<li>向细胞沉淀中加入熔融状态（40–60 °C）的羟乙基琼脂糖基凝胶（见材料表），凝胶与细胞沉淀的体积比为1:4（vol:vol）。</li>
	<li>使用经自来水冲洗过的洁净5英寸、2 mm尖端的Sterling探针，轻轻搅拌熔融凝胶与固定的细胞沉淀，使固定细胞在50 mL锥形管底部形成均匀的悬浮液（图1A）。</li>
	<li>将装有熔融凝胶与固定细胞沉淀混合物的锥形管盖紧后置于湿冰上5–10分钟，使凝胶化的细胞沉淀固化。</li>
	<li>使用洁净的微型刮铲，将沉淀从锥形管中小心取出：将刮铲沿管壁插入，轻轻撬动沉淀物，避免刺穿。将取出的沉淀置于活检纸上。</li>
	<li>使用洁净的微型刮铲，将细胞沉淀修整为4–5 mm厚的切片，使每片均可放入26 mm × 26 mm × 5 mm的组织包埋盒中（图1B）。</li>
	<li>将单个凝胶沉淀切片置于一片活检纸中央。将活检纸相对的两端折起，包裹住沉淀。将包裹好的沉淀放入26 mm × 26 mm × 5 mm的组织包埋盒中。盖上盒盖，并用盒盖压紧活检纸未折叠的两侧（图1C）。</li>
	<li>将修整后的细胞沉淀包埋盒放入装有10%中性缓冲福尔马林的组织处理仪处理罐中，运行短程处理程序。 
	&#8203;注：短程处理程序包括在10%中性缓冲福尔马林中处理30分钟，随后经梯度酒精脱水，二甲苯透明（更换三次），最后在60 °C熔融的浸蜡/包埋石蜡（熔点56 °C）中进行两次石蜡浸润。</li>
</ol>
4. 细胞沉淀物的包埋
<ol>
	<li>将处理好的包埋盒放入包埋机的放置区。</li>
	<li>打开组织包埋盒盖子，小心展开活检纸。</li>
	<li>将细胞沉淀块放入一个小型的一次性包埋模具（15 mm × 15 mm）中，切面朝下。 
	注意：使用小型包埋模具可使最多三个细胞沉淀块切片置于同一张未染色的组织切片上，适用于免疫组化检测。</li>
	<li>用镊子轻轻夹住细胞沉淀块，使其位于模具底部，然后加入62 °C的组织浸透/包埋用石蜡，覆盖细胞沉淀块。</li>
	<li>将模具移至冷台以开始石蜡固化。在石蜡固化过程中调整细胞沉淀块的位置，使其固定在模具底部的合适位置。</li>
	<li>取下包埋盒盖子，将包埋盒底部朝下放置在包埋模具上方，并加入额外的熔化石蜡，覆盖整个包埋盒。</li>
	<li>当石蜡完全覆盖组织包埋盒后，将模具放回冷台使其完全固化17,18。</li>
</ol>
5. 细胞沉淀的切片
<ol>
	<li>使用旋转式切片机，将切片厚度设为 20 µm，修块至蜡块表面完全暴露细胞团块的横截面，使细胞团块在整个石蜡切片带中完整呈现。此步骤称为对蜡块进行&#34;修面&#34;。</li>
	<li>将修面后的细胞团块蜡块置于冰浴托盘中冷却并浸润 5–15 分钟，以使蜡块充分冷却并水化，便于后续切片。 
	注意：当蜡块充分水化后，细胞团块在石蜡切片带上呈半透明状；若呈不透明状，则需延长浸润时间，且可能出现组织学伪影。</li>
	<li>使用旋转式切片机以连续切片模式，将细胞团块蜡块切成 4 µm 厚度或其他所需厚度的石蜡切片带。</li>
	<li>将石蜡切片带转移至设定为 42 °C 的温水展片浴中展平。</li>
	<li>用正电荷载玻片从展片浴中捞取由旋转式切片机制备的石蜡切片。
	<ol>
		<li>将第一张切片置于盖玻片和染色区域边界内的载玻片顶部位置，第二张切片置于其下方，第三张细胞团块切片再置于其下方（图 1D）。</li>
		<li>切片完成后，先于室温（约 23 °C）干燥 24 小时，再于 60 °C 烘烤 30 分钟。 
		注意：60 °C 烘烤后，细胞团块切片可用于任何标准免疫组化（IHC）实验流程，包括基于热诱导或酶消化的抗原修复流程9。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

所有作者均为基因泰克/罗氏的员工，因此也是罗氏的股东。

本方案描述了一种制备甲醛固定、石蜡包埋细胞沉淀物的方法，该沉淀物可作为后续免疫组织化学检测的对照 原位 杂交研究。本方案中描述的组织学方法适用于多种癌症和原代细胞系，主要是对常规组织学技术进行改进，以制备此类细胞团块17,18当处理并包埋后，细胞沉淀物可像组织一样使用，包括在免疫组织化学实验中采用热诱导和酶法抗原修复方案。本实验方案的目的之一是在整个过程中保持细胞的形态和抗原性。因此，使用相对温和的EDTA来解离细胞，以尽量减少对细胞形态和抗原性的影响。这并不是说其他方法（如物理破碎）不可行；但无论采用何种解离方法，都必须确保细胞在过程中不受损伤。本方案的第二个目的是以类似于组织的方式对细胞进行固定和处理，即使用相同的固定剂、固定剂比例、处理程序（固定、脱水、透明和石蜡浸润）以及包埋技术，从而使细胞沉淀物可作为后续检测中可比的对照。因此，用于制备细胞沉淀物的固定和处理方法应尽量模拟组织所用的方法。
本报告中所述方案不适用于处理含有感染性病原体的细胞，例如被致病性细菌或病毒所感染的细胞，因为在固定前需将细胞解离、收集并进行离心。研究人员可考虑在细胞解离前先行固定，但这需要进一步优化以确保在不破坏细胞形态的前提下有效收集细胞。此外，针对含有感染性病原体的细胞，其固定时间及操作条件需根据具体病原体类型以及相关机构的生物安全规范进行额外考量。
福尔马林固定、石蜡包埋的细胞团块在具有明确的蛋白表达水平方面具有独特优势10。尽管癌细胞系和内源性细胞系可提供不同蛋白表达水平的细胞选择，但基因工程技术使研究人员能够通过过表达目标蛋白，以及利用CRISPR技术切除或插入目标编码基因，来模拟蛋白表达情况20,21。&#160;细胞系中过表达蛋白的缺点在于，其不适合作为检测方法灵敏度的评估指标，因为其表达水平可能无法代表内源性蛋白的真实水平22。相比之下，内源性细胞系和癌细胞系更能真实反映内源性蛋白的表达水平，而通过CRISPR介导在对应细胞系中敲除编码基因，则可作为相应的阴性对照。此外，具有不同蛋白表达水平的内源性细胞系或癌细胞系非常适合用于滴定实验，以确定最终的抗体稀释比例，并更准确地评估检测方法的灵敏度（图2）。选择何种细胞系应基于具体的实验需求，通常需要结合多种策略进行综合考量。
除了评估抗体是否能够检测目标蛋白外，还可以利用一组细胞系来确定抗体的特异性。例如，可以使用分别表达一组密切相关蛋白的细胞系，以检测该抗体是特异性识别单一蛋白，还是也会识别其他密切相关蛋白。更复杂的对照实验可能涉及使用通过CRISPR敲入或过表达方式表达突变蛋白的细胞系，这些突变蛋白无法发生特定的信号事件（例如，在评估磷酸化位点特异性抗体时，使用特定磷酸化位点发生突变的蛋白）。尽管这些方法更为复杂，但在确认所用抗体仅在特定条件下产生标记时可能是必要的10。
需要注意的是，对细胞系进行基因操作可能无法获得均一的细胞群体。例如，在过表达细胞系中，转染效率通常达不到100%，部分细胞可能并未过表达目标蛋白。在转染过程中引入FLAG标签或相关标签，并通过标准方法进行检测，有助于评估细胞系的转染效率23。这不仅有助于判断转染是否成功，并排除因蛋白表达不足而导致检测失败的可能性，还可作为预期表达目标蛋白细胞比例的参考依据。
原位杂交（ISH）也可作为一项有益的工具，用于表征细胞沉淀物中靶基因的表达，并为免疫组化（IHC）方法开发提供参考10。在筛选抗体时，了解转录本（从而推断潜在蛋白）的可检测时间点具有重要意义。此外，对细胞沉淀物进行 ISH 筛选也有助于 ISH 方法的开发。尽管特异性在 ISH 检测中较少成为问题，但仍需设置适当的对照，并在对照的开发与使用方面采取类似的考量，以适用于 ISH 研究。
组织微阵列是通过从供体蜡块中取出组织芯，并将这些组织芯以网格模式转移至一个受体石蜡块中制成的。最终，受体蜡块在一个单一蜡块中包含了多种样本，使得所有样本可经历完全相同的免疫组化（IHC）处理过程，从而能够在同一张切片上直接比较多个样本24,25。&#160;由于细胞沉淀物通常为相对均一的细胞群体，因此可用1 mm的组织芯准确代表，使其成为构建类似微阵列的理想候选材料。利用细胞沉淀物微阵列，可在同一张切片中包含表达水平不同的细胞沉淀物、特异性表达相关蛋白的细胞沉淀物，以及来自不同物种、表达目标蛋白直系同源物的细胞沉淀物（图3）。这使得所有细胞沉淀物可在统一条件下快速地被同时评估，同时最大限度减少试剂的使用量25。
建议本方案至少使用来自八个T175培养瓶的细胞，获得的起始细胞沉淀体积不少于2 mL。此体积可支持制备和存档多个细胞沉淀块，从而在较长时间内实现细胞沉淀对照的标准化，并可从单个沉淀制备多个细胞沉淀阵列。当处理原代患者来源的细胞系、生长缓慢的细胞系，或样本体积受限时，可使用较小的细胞沉淀体积。当然，起始体积较低会放大固定和沉淀制备过程中细胞损失带来的负面影响，并限制后续实验可用的材料量。因此，在离心后去除固定剂时应格外小心，以尽量减少细胞损失。对于较小的样本体积，可使用1.5 mL带盖离心管来沉淀细胞。这些离心管可用刀片沿纵向切开以便后续处理。
与组织固定类似，该细胞沉淀物内的细胞固定对于后续的免疫组化（IHC）评估至关重要。为了实现完全固定，我们采用至少10:1的甲醛与细胞沉淀物比例，并反复倒置锥形管以保持细胞处于悬浮状态。若在固定时细胞未充分悬浮，可能导致固定不完全或不足，从而影响后续的免疫标记效果。这种情况常表现为沉淀物边缘标记较强，而中心区域标记减弱，或在整个沉淀物中出现标记强度不均的现象。
本方案使用主要由羟乙基琼脂糖组成的Histogel，既可结合细胞沉淀，又能使细胞在沉淀中均匀分布。若不使用Histogel，细胞会变得紧密，导致细胞形态学细节丢失。这些细胞形态学细节在抗体筛选过程中往往至关重要，因为它们可提供额外信息，用于判断抗体是否在适当的亚细胞结构（如细胞核、细胞质或质膜）中发生标记。相反，若凝胶用量过多，则会导致沉淀中细胞密度降低，使细胞分布过于分散，从而减少每张切片中的细胞数量。
本方案可常规用于制备免疫组化（IHC）对照。制备这些细胞沉淀所需的材料在科研生物学和组织学实验室中十分常见，方法简单且易于调整。尽管细胞沉淀作为免疫组化对照存在一定的局限性，但它们在抗体初筛以及与其他组织对照互补方面具有重要应用价值。

免疫组织化学（IHC）是研究性和诊断病理学中最常用的检测方法之一。根据具体背景和检测目的，IHC 可用于辅助癌症诊断1,2、预测治疗反应3,4、识别病原体5、表征病变组织中的细胞类型6，以及研究生物学通路和组织反应7,8。在所有情况下，IHC 检测的基本原理是抗体特异性结合目标分子（最常见的是蛋白质），随后在组织切片中可视化该结合事件9。然而，任何 IHC 检测面临的最大挑战之一是确保抗体能够特异性地检测目标分子10。抗体特异性是大多数免疫检测中的难题，而免疫组织化学具有其独特挑战，即缺乏诸如分子量等二级检测手段来区分特异性与非特异性标记。当评估那些特征不明确或广泛表达、且缺乏明确定义的细胞定位模式的目标分子时，这一问题尤为突出。因此，在开发新的 IHC 检测方法时，建立可靠的对照以帮助表征结合特异性至关重要10。
对于具有明确特征和典型细胞表达模式的靶标，免疫组化（IHC）方法开发中常使用组织对照。基于大量已有数据，可以判断抗体是否在已知表达该靶标的组织、细胞及亚细胞结构中进行标记，同时确认其未在不应表达的组织成分中产生信号11。然而，对于表达模式未知或缺乏特异性表达特征的低表征新型靶标，以及广泛表达且无明显表达模式的蛋白质，组织对照的应用价值有限。在这两类情况下，由于缺乏明确的表达模式，无法区分组织中的特异性标记与非特异性标记。此时，细胞沉淀物可作为免疫组化对照的一种有效替代方案。细胞沉淀物对照包括：内源性或固有（非诱导）表达目标蛋白的癌细胞系或其他细胞系，其蛋白表达水平可通过Western blot、流式细胞分析或转录谱数据推断得出；经基因工程改造、过表达目标蛋白或敲除相应编码基因的细胞系；以及经特定处理以诱导目标蛋白表达或特定信号事件（如磷酸化）的细胞10,12。通过使用高、中、低及无目标蛋白表达水平的细胞系组合，还可利用细胞沉淀物评估检测方法的灵敏度。此外，针对家畜等动物物种，当缺乏充分表征或可用的组织对照时，经工程化构建的细胞沉淀物可作为有价值的物种特异性对照13。尽管细胞沉淀物存在局限性，例如细胞系的蛋白质组较为有限，无法完全反映组织中复杂的蛋白质组多样性，但其仍可作为合适的对照，用于验证抗体是否能够识别目标抗原，并排除一抗、二抗或其他试剂在检测中发生的非特异性结合10。
诊断和研究病理学中的大多数组织通常用中性缓冲甲醛固定，经一系列酒精脱水，二甲苯透明，再进行处理并包埋于石蜡中。甲醛固定会导致蛋白质交联，而固定及组织处理中的每个附加步骤都可能直接影响蛋白质及其被抗体识别的能力9,14。因此，在免疫组织化学（IHC）检测中所使用的任何对照都必须经过相同的固定、组织处理和包埋程序。本文描述了将培养细胞处理并包埋作为IHC检测对照时需考虑的特殊因素，方法学重点在于组织学实验室中对细胞沉淀物的操作与处理过程。

<table><tbody><tr><td>10% 中性缓冲福尔马林</td><td>VWR</td><td>16004-128</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 圆锥形离心管</td><td>Becton Dickinson Labware</td><td>#0747-1886</td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>Koptec</td><td>V1401</td><td></td></tr><tr><td>95% 乙醇</td><td>Koptec</td><td>V1101</td><td></td></tr><tr><td>活检包埋纸</td><td>Surgipath Medical Industries, Inc</td><td>#01090</td><td></td></tr><tr><td>Costar Stripette 血清移液管 10 mL</td><td>Corning</td><td>CLS4101</td><td></td></tr><tr><td>Flex 100</td><td>Epredia</td><td>8101</td><td></td></tr><tr><td>Flex 95</td><td>Epredia</td><td>8201</td><td></td></tr><tr><td>Histogel</td><td>Thermo Scientific</td><td>#R904012</td><td></td></tr><tr><td>Leica 自动旋转切片机</td><td>Leica</td><td>RM2255</td><td></td></tr><tr><td>微型刮勺，两端圆润且呈锥形</td><td>Tedd Pella</td><td>#13510</td><td></td></tr><tr><td>NanoZoomer 2.0 HT 全片图像扫描仪</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraplast 组织浸润/包埋石蜡</td><td>Surgipath</td><td>39601006</td><td></td></tr><tr><td>移液管控制器</td><td>CAPP</td><td>PA-100</td><td></td></tr><tr><td>试剂级乙醇</td><td>Epredia</td><td>9111</td><td></td></tr><tr><td>Sterling Probe 5&amp;rdquo; 2 mm 带孔尖端探针</td><td>Roboz Surgical Instrument Co., Inc</td><td>#RS-9522</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus 带正电荷显微镜载玻片</td><td>Thermo Scientific</td><td>6776214</td><td></td></tr><tr><td>组织包埋盒；PrintMate 带槽包埋盒</td><td>Epredia</td><td>B851120WH</td><td></td></tr><tr><td>TMA 组织阵列制备仪 Grand Master</td><td>3DHistech LTD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>VWR</td><td>89370-088</td><td></td></tr></tbody></table>

福尔马林固定、石蜡包埋细胞沉淀免疫组织化学对照的标准化处理

Standardized Processing for Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Cell Pellet Immunohistochemistry Controls

已知靶蛋白表达情况的阳性与阴性对照对于免疫组织化学（IHC）检测方法的建立至关重要。虽然组织对照适用于具有明确组织和细胞表达模式的已知蛋白，但对于新发现、特征尚不明确或广泛表达的蛋白，其在IHC检测方法初期开发中的适用性较低。相比之下，由于细胞沉淀具有标准化优势，例如蛋白或转录本表达水平明确的肿瘤细胞系（如高、中、低表达）、经转染过表达特定蛋白的细胞系，或通过CRISPR等细胞工程技术实现基因敲除的细胞系，可作为有价值的对照，尤其适用于抗体的初步表征与筛选。为了使这些细胞沉淀能够用于福尔马林固定、石蜡包埋组织的IHC检测方法开发，必须采用与组织处理流程一致的方式对其进行处理和包埋。本方案描述了一种制备和处理福尔马林固定、石蜡包埋细胞沉淀对照的方法，可用于IHC检测方法的开发。

加入琼脂糖凝胶后，细胞沉淀应形成一块坚实的凝胶状物质，便于操作处理（图1B）。一旦包埋完成，沉淀物的质地将类似于固体组织，可在切片机上常规切片。细胞沉淀包埋后，可像福尔马林固定、石蜡包埋的组织一样用于组织学和免疫组化（IHC）实验。这包括使用热诱导表位修复或酶法抗原修复，结合间接显色检测方法（例如，使用辣根过氧化物酶标记的二抗和二氨基联苯胺显色，如图2和图3所示），并可兼容商用IHC检测平台9。从组织学角度看，细胞应在切片中均匀分布，细胞团块极少，尽管贴壁细胞可能在沉淀中保持其细胞间相互作用。这种分散状态有助于区分单个细胞，但该分辨效果会显著受到细胞大小及凝胶沉淀内细胞相对密度的影响。细胞核、细胞质和细胞膜在分散良好的情况下更为清晰，易于观察（图2）。在图2中，三种细胞系经TEAD转录因子免疫标记，显色采用棕色的二氨基联苯胺（DAB）发色剂。这些细胞系中TEAD转录因子的表达水平各不相同，从无表达（图2A）、弱表达（图2B）到强表达（图2C）。在此示例中，免疫标记出现在细胞核中，符合转录因子的预期定位，而细胞质和细胞膜虽可见但无标记信号（图2）。细胞沉淀可被制成细胞沉淀微阵列（图3），使用标准尺寸为23 mm × 75 mm × 1 mm的载玻片。将细胞沉淀整合为微阵列，可在同一张切片上同时评估不同表达水平的对照样本。在此示例中，PEG10缺陷的小鼠胚胎干细胞（左侧）作为阴性对照，而过表达PEG10的293T细胞（右侧，呈棕色免疫标记）作为阳性对照（图3）。用于微阵列的细胞沉淀在组织处理和包埋流程上与常规组织无异，微阵列的制备方法也与组织微阵列类似19。
<img alt="实验室中组织包埋过程；离心管、包埋模具、切片方法。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64276/64276fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：细胞沉淀处理。（A）细胞在50 mL锥形管中离心成沉淀，并与凝胶混合。（B）凝固后，将沉淀连续切片以适配26 mm x 26 mm x 5 mm的组织包埋盒。（C）在放入组织处理仪前，细胞沉淀需用活检包埋纸包裹。（D）单张25 mm x 75 mm的玻璃组织学载玻片上可连续收集最多三个细胞沉淀。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64276/64276fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞染色显微图像显示蛋白质表达分析；图A、B、C显示出不同的信号强度。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64276/64276fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 2"> 
图2：具有不同蛋白质或转录本表达水平的细胞沉淀可用于评估检测方法的动态范围。 对细胞沉淀进行TEAD转录因子的免疫标记，显示出TEAD表达水平的差异。(A) DAUDI细胞不表达TEAD，在细胞质或细胞核中均无免疫标记信号。蓝色染色为细胞核的苏木精复染。(B) 293T细胞显示TEAD转录因子微弱的细胞核标记（棕色为二氨基联苯胺（DAB）显色）。(C) Detroit 562细胞强烈表达TEAD，表现为细胞核内明显的棕色标记。标记局限于细胞核内，而细胞质（棕色细胞核周围呈灰白色区域）无标记，表明免疫组织化学检测具有特异性。请注意，在这三种细胞系中，细胞均呈分散状态，便于观察单个细胞及其细胞核和细胞质的形态结构。比例尺 = 25 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64276/64276fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="组织学染色示意图；左侧为蓝色染色，右侧为棕色。用于分析细胞存在情况及密度比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64276/64276fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：利用多个具有不同蛋白表达水平的细胞沉淀制作的细胞沉淀微阵列，可在单张切片上同时评估对照样本。 对PEG10缺陷型小鼠胚胎干细胞（左侧）和过表达PEG10的293T细胞（右侧）进行PEG10免疫标记。在过表达PEG10的293T细胞中可观察到强烈的标记信号（棕色DAB显色），而在PEG10缺陷型细胞中则无明显标记信号。蓝色为苏木精复染。比例尺 = 200 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64276/64276fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种用于免疫组织化学的福尔马林固定、石蜡包埋细胞沉淀块对照品的制备方案。

已知目标蛋白表达的阳性与阴性对照对于免疫组织化学（IHC）检测方法的开发至关重要。虽然……

具有明确蛋白质或转录本表达水平的、经过充分表征的阳性和阴性细胞沉淀对照对于开发免疫组织化学检测方法至关重要。本方案描述了制备和处理福尔马林固定、石蜡包埋细胞沉淀对照的过程。此类对照可用于在开发新的免疫组织化学检测方法时鉴定结合特异性。免疫组化（IHC）检测对于我们在各个治疗领域的发现和生物标志物开发工作至关重要，而开发经过验证的对照是建立这些检测方法的关键。在将基于羟乙基琼脂糖的凝胶加入细胞沉淀之前，必须将其加热至至少40摄氏度。在凝胶凝固之前，必须将其与细胞充分混匀。通过向3毫升细胞沉淀中加入30毫升10%中性缓冲福尔马林溶液，使固定液与细胞的比例达到10:1，开始对293T细胞沉淀进行固定。将50毫升离心管盖紧后反复倒置，使细胞充分重悬，并于室温下静置过夜使其沉淀。为提高固定效果，次日再次倒置离心游戏副本并重悬细胞，以增大表面积与体积的比率。固定24小时后，在5°C条件下以930 × g离心10至15分钟。确保可见细胞沉淀，通过倾倒或使用无菌移液管小心吸除固定液。将40至60°C的熔融羟乙基琼脂糖凝胶以1:4的凝胶与细胞沉淀比例加入沉淀中。使用一根洁净的5英寸、2毫米尖端的纯银探针，探针前端用自来水冲洗，轻轻搅拌50毫升锥形管中的内容物，使固定后的细胞在底部熔融凝胶中均匀悬浮。待固定细胞在熔融凝胶中均匀悬浮后，盖紧锥形管，置于湿冰上5至10分钟。待凝胶沉淀物完全凝固后，将一把洁净的微型刮勺沿管壁小心插入，轻轻撬动沉淀物，注意不要刺穿。将凝固的沉淀物置于活检纸上。使用洁净的微型刮勺，将细胞沉淀切成四到五毫米厚的片状，以适配26毫米×26毫米×5毫米的组织包埋盒。将单个凝胶沉淀片置于一片活检纸的中央。将相对的两侧折叠，并在将切片放入26 × 26 × 5毫米的组织包埋盒前用纸包裹。盖上盖子。将修整好的细胞沉淀包埋盒放入盛有10%中性缓冲福尔马林的组织处理仪反应罐中，并按短程序运行处理。包埋细胞沉淀时，将处理好的包埋盒放入包埋中心的放置区。打开组织包埋盒盖，小心展开活检纸，将细胞沉淀放入一个15 mm × 15 mm的一次性包埋模具中，切面朝下。用镊子轻轻固定模具底部的细胞沉淀，将62摄氏度的组织浸润或包埋石蜡加入模具中，完全覆盖细胞沉淀。将模具移至冷台以使石蜡凝固。在石蜡凝固过程中调整细胞沉淀的位置，并将其固定在模具底部的适当位置。打开包埋盒盖子，将包埋盒底部朝下放置在包埋模具上，并加入额外的熔融石蜡以覆盖包埋盒。当石蜡完全填充组织包埋盒后，将模具放回冷台进行凝固。使用旋转式切片机将石蜡切片从漂浮浴中拾取，并转移至带正电荷的载玻片上。将第一张切片置于盖玻片和染色边界范围内的载玻片顶部位置，随后将后续切片依次自上而下排列放置。完成后，先于23°C条件下干燥24小时，再于60°C条件下干燥30分钟。采用此方法制备的包埋细胞团块在切片中显示出均匀的细胞分布，团块内细胞聚集和相互作用极少。当使用棕色二氨基联苯胺显色剂进行免疫染色时，可在细胞核内观察到三种细胞系中TEAD转录因子表达水平的差异，从无表达、弱表达到强表达不等。将细胞团块整合到微阵列中，可在同一张载玻片上对不同表达水平的对照样本进行评估，且实验操作条件保持一致。如本示例所示，可观察到PEG10缺陷型小鼠胚胎干细胞的阴性对照以及过表达PEG10的293T细胞的阳性对照。确保细胞充分固定并在凝胶沉淀物中均匀分布，可建立均一且标准化的检测对照。这些细胞沉淀物可用作后续免疫组织化学和NC2杂交实验的对照，结合标准的抗原修复和标记方法进行操作。细胞沉淀对照已推动了许多免疫组织化学检测方法的发展，特别是针对新发现或研究较少的蛋白质。它们可作为明确定义的对照，有助于表征抗体的特异性。

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