Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

该程序的总体目标是通过凝血活酶浆细胞块包埋的组织团块的免疫细胞化学和组织学分析分析感兴趣的增殖标志物的表达。这种方法可以帮助回答有关组织阻断细胞的临床病理学的关键问题。这种用于石蜡包埋细胞块免疫细胞化学分析的替代方法的主要优点是程序的技术简单性。

当 100 mm 的 HeLa 细胞培养培养皿达到汇合时，用 10 mL 不含 FBS 的 HeLa 细胞培养基替换上清液，并将培养皿放回细胞培养箱中。48 小时后，用 2 毫升 PBS 洗涤细胞，然后在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下用 2 毫升 0.25% EDTA 加胰蛋白酶孵育 2 到 3 分钟。当细胞分离后，用 5 mL 完全培养基终止反应，并将细胞溶液转移到 15 mL 锥形管中。

通过离心收集细胞，然后在每次洗涤的 2 毫升冷 PBS 中洗涤两次。第二次洗涤后，用 1 毫升 95% 乙醇替换上清液，并通过涡旋混合沉淀。然后将固定的细胞放在冰上。

为了制备石蜡细胞块，从健康供体血液中收集 EDTA 血浆后，离心样品并将 200 至 400 微升上清血浆等分试样转移到单独的微量离心管中。接下来，向固定的 HeLa 细胞中加入约 200 微升血浆、约 200 微升凝血活酶和约 200 微升 025 摩尔氯化钙。让混合物在室温下形成细胞凝块 10 分钟，然后用 1 毫升 PBS 洗涤凝块两次，第二次洗涤后将凝块完全倾析到单块福尔马林湿润的滤纸上。

凝块包裹在滤纸中，并使用针组将布放入其他四张福尔马林湿纸中央的单个纸巾盒中。然后将组织盒放入装有 50 毫升缓冲福尔马林的玻璃罐中，在 4 摄氏度下固定福尔马林过夜。第二天早上，将透析盒装入组织脱水机中，进行过夜除水和固定细胞调节。

至少在处理程序结束前一小时，打开加热的包埋站以熔化石蜡。包埋站和凝块准备就绪后，确认金属模具中存在熔融石蜡，并将形成的细胞凝块转移到石蜡中。将不带盖的新组织盒放入金属模具中，并用更多的熔融石蜡覆盖组织盒。

让石蜡在冷板中凝固 30 到 60 秒。然后将组织盒与金属模具分开。为了准备用于免疫细胞化学分析的切片，将细胞凝块定位在一个石蜡细胞块中，并使用切片机将细胞块切成 3 到 4 微米厚的切片。

将石蜡切片放在盐水涂层的载玻片上，然后将载玻片放入 37 摄氏度的烘箱中 30 分钟。当切片粘附在载玻片上时，将切片在 15 毫升二甲苯中脱蜡 4 分钟，然后用连续 2 分钟的下降乙醇孵育对切片进行脱水。80% 乙醇孵育后，用流水冲洗切片 10 分钟，然后将玻片放入装有 40 毫升 tris-EDTA 修复缓冲液的罐子中煮沸 30 分钟。

孵育结束时，在流水下洗涤抗原回收的玻片，然后在 4 摄氏度下在 95% 乙醇中孵育 10 分钟。风干后，使用疏水笔圈住每张载玻片上的细胞染色区域。在 TBS-T 中洗涤玻片，然后在室温下在过氧化氢块中孵育 15 分钟，以去除任何残留的过氧化物酶活性。

在 TBS-T 中洗涤载玻片 3 次，每次洗涤 2 分钟，然后用 100 微升来自目标免疫细胞化学染色试剂盒的一抗混合物标记切片 1 小时，然后进行 5 次 2 分钟的 TBS-T 洗涤。最后一次洗涤后，将玻片在试剂盒中的一抗增强剂中在室温下避光孵育 15 分钟。孵育结束时，在 TBS-T 中洗涤切片 4 次，最后一次洗涤后加入约 200 μL 辣根过氧化物酶标记的二抗，在室温下孵育 30 分钟。

在新鲜的 TBS-T 中洗涤增强的切片 5 次，然后每个切片加入 100 μL 二氨基联苯胺溶液，持续 3 分钟。在 TBS-T 中洗涤载玻片两次，并用 100 微升苏木精溶液标记切片 1 分钟。然后在 TBS-T 中再次洗涤载玻片，并在 95% 乙醇中孵育玻片 2 分钟，然后在新鲜的 95% 乙醇中浸入 1 次，在 100% 乙醇中浸入 2 次。

乙醇脱水切片放入玻璃瓶中的 40 毫升二甲苯中孵育 5 分钟，然后让载玻片风干。然后将盖玻片安装到每个载玻片上，并在光学显微镜下观察样品。正如刚才所示，石蜡包埋组织的苏木精和伊红染色主要在触觉细胞核和细胞质中显示，表明该方法对细胞样品进行了出色的形态保存。

然而，即使样品染色正确，制备不当的细胞块也会表现出较差的形态和不规则的标记。细胞骨架相关蛋白 2 通常观察到在浓缩的染色质、有丝分裂纺锤体和细胞质中。只有浓缩染色质中细胞骨架相关蛋白 2 染色的细胞是有丝分裂细胞，而在血清饥饿的 HeLa 细胞培养群体中发现很少的细胞骨架相关蛋白 2 阳性细胞。

大多数高度有丝分裂的 HeLa 细胞也是 Ki-67 阳性，并且在细胞核中可以看到 Ki-67 染色。只有大约一半的血清饥饿 HeLa 细胞表达这种增殖标志物。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 6 小时内完成。

在尝试此程序时，重要的是要记住将细胞稀释到适当的密度以形成良好的凝块。按照此程序，可以执行其他方法，例如固定细胞的流式细胞术分析，以回答同步期间有关细胞周期阶段的其他问题。开发后，该技术为肝脏病理学领域的未来铺平了道路，以探索细胞系中的表达谱，同时保留培养细胞中的形态学信息。

观看此视频后，您应该对如何进行免疫细胞化学和从培养细胞制备血浆凝血活酶块有很好的了解。不要忘记，使用二甲苯等有害试剂可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如戴手套和穿实验服。