石蜡包埋细胞块免疫细胞化学法检测培养细胞中蛋白质表达水平

本实验的总体目标是通过免疫细胞化学和组织学方法，分析凝血活酶-血浆细胞块包埋组织团块中增殖标志物的表达情况。该方法有助于解答有关组织样本细胞块在临床病理学中的关键问题。这种用于石蜡包埋细胞块免疫细胞化学分析的替代方法，其主要优势在于实验操作的技术简便性。

当100毫米培养皿中的HeLa细胞培养达到汇合状态时，将上清液更换为10毫升不含FBS的HeLa细胞培养基，并将培养皿放回细胞培养箱中。48小时后，用2毫升PBS洗涤细胞，随后在37摄氏度、5%二氧化碳条件下，加入2毫升0.25%EDTA与胰蛋白酶混合液孵育2至3分钟。当细胞脱落时，加入5毫升完全培养基终止反应，并将细胞悬液转移至15毫升锥形管中。

通过离心收集细胞，随后用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次，每次使用两毫升。第二次洗涤后，弃去上清液，加入一毫升95%乙醇，涡旋混匀细胞沉淀。然后将固定后的细胞置于冰上。

为了制备石蜡包埋细胞块，首先从健康供体血液中采集EDTA抗凝血浆，离心样品后，将200至400微升上清血浆分装至各微量离心管中。接着，向固定后的HeLa细胞中加入约200微升血浆、约200微升组织凝血活酶以及约200微升0.25摩尔的氯化钙。混合物在室温下静置10分钟，使其形成细胞凝块，然后用1毫升PBS洗涤凝块两次，第二次洗涤后，将凝块完全倾倒至若干张经甲醛润湿的滤纸上。

将凝块包裹在滤纸中，并使用镊子将其放入组织包埋盒中，置于另外四层经福尔马林润湿的滤纸中央。然后将组织包埋盒放入盛有50毫升缓冲福尔马林的玻璃瓶中，在4°C条件下过夜固定。次日早晨，将包埋盒放入组织处理机中，进行过夜脱水和固定细胞的预处理。

在处理程序结束前至少一小时，打开加热包埋台以熔化石蜡。当包埋台和凝块准备就绪后，确认金属模具中存在熔融石蜡，然后将已形成的细胞凝块转移至石蜡中。将一个无盖的新组织盒放入金属模具内，并用更多熔融石蜡覆盖该组织盒。

将石蜡在冷台上静置 30 至 60 秒，使其凝固。随后将组织包埋盒与金属模具分离。为进行免疫细胞化学分析制备切片时，需在一块石蜡包埋的细胞块中定位细胞凝块，并使用切片机将该细胞块切成三至四微米厚的切片。

将石蜡切片置于经盐水包被的玻片上，随后将玻片放入37°C烘箱中孵育30分钟。待切片牢固附着于玻片后，用15毫升二甲苯脱蜡4分钟，接着依次用递减浓度的乙醇溶液进行2分钟梯度脱水。80%乙醇孵育后，用流水冲洗切片10分钟，然后将玻片放入含有40毫升Tris-EDTA修复缓冲液的容器中煮沸30分钟。

孵育结束后，将回收抗原的载玻片在流水下冲洗，随后在4°C条件下于95%乙醇中孵育10分钟。空气干燥后，使用疏水性笔在每张载玻片上圈出细胞染色区域。将载玻片在TBS-T中洗涤，然后在室温下用过氧化物酶阻断液孵育15分钟，以去除任何残留的过氧化物酶活性。

用 TBS-T 缓冲液洗涤载玻片，每次两分钟，共洗涤三次，然后每张切片加入 100 微升目标免疫细胞化学染色试剂盒中的初级抗体混合液，室温孵育 1 小时，随后用 TBS-T 缓冲液洗涤五次，每次两分钟。最后一次洗涤后，在避光条件下，室温下用试剂盒中的初级抗体增强剂孵育 15 分钟。孵育结束后，用 TBS-T 缓冲液洗涤切片四次，最后一次洗涤后加入约 200 微升辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育 30 分钟。

用新鲜的TBS-T缓冲液将增强的切片洗涤五次，然后每张切片加入100 µL二氨基联苯胺溶液，孵育三分钟。将载玻片在TBS-T缓冲液中洗涤两次，每张切片加入100 µL苏木精溶液染色一分钟。随后将载玻片再用TBS-T缓冲液洗涤一次，放入95%乙醇中孵育两分钟，接着在新鲜的95%乙醇中浸洗一次，再在100%乙醇中浸洗两次。

将经乙醇脱水的切片放入盛有40毫升二甲苯的玻璃瓶中，孵育5分钟，然后让载玻片自然晾干。随后将盖玻片封片于每张载玻片上，在光学显微镜下观察样品。如上所述，对石蜡包埋组织进行苏木精和伊红染色后，可见大部分细胞核与细胞质结构完整，表明该方法对细胞样品具有良好的形态学保存效果。

然而，制备不良的细胞块即使染色得当，也会表现出形态学差和标记不规则的现象。细胞骨架相关蛋白2通常存在于凝集的染色质、有丝分裂纺锤体以及细胞质中。只有那些在凝集染色质中显示细胞骨架相关蛋白2染色的细胞才是有丝分裂细胞，而在血清饥饿处理的HeLa细胞培养群体中，仅有少数细胞呈细胞骨架相关蛋白2阳性。

大多数高有丝分裂活性的 HeLa 细胞也呈 Ki-67 阳性，且 Ki-67 染色可见于细胞核内。仅有约一半的血清饥饿处理的 HeLa 细胞表达此增殖标志物。一旦掌握该技术，若操作得当，可在六小时内完成。

进行该操作时，重要的是要记住将细胞稀释至适当的密度，以形成良好的凝块。完成该步骤后，可进一步采用其他方法，如对固定后的细胞进行流式细胞术分析，以探究细胞周期各时相在同步化过程中的相关问题。该技术建立后，为肝脏病理学领域未来的研究开辟了道路，可在保留培养细胞形态学信息的同时，开展细胞系的表达谱分析。

观看本视频后，您应能够充分掌握如何进行免疫细胞化学染色，以及如何从培养的细胞中制备血浆凝血活酶块。请务必注意，使用二甲苯等有害试剂可能具有极高危险性，在执行该操作时，应始终采取佩戴手套和实验服等防护措施。