使用LC3免疫荧光评估两种不同胰腺细胞模型中的自噬水平

LC3免疫荧光能够测定胰腺细胞中的自噬水平。它允许研究不同药物对胰腺细胞自噬的潜在影响。免疫荧光是一种用于检测内源性LC3蛋白的技术，可避免过度表达LC3引起的问题，例如形成与自噬无关的蛋白质聚集体。

演示该程序的将是博士毕业生Felipe Renna和Maria Ines Vaccaro实验室的博士生Malena Herrera Lopez。要开始细胞制备，将12毫米圆形盖玻片浸泡在无水乙醇中。取下盖子后，将浸泡过的盖玻片垂直放入 24 孔板中。

将多孔板暴露在紫外线辐射下 15 分钟。然后将盖玻片水平放置并用DMEM清洗。现在看到胰腺细胞的低传代数，重新悬浮在DMEM中，含有10%FBS，青霉素和链霉素，并将细胞孵育两天。

细胞接种两天后，在DMEM中以每微升浓度一微克制备吉西他滨溶液。然后在单独的管中从每个孔中吸出一半体积，并加入适量的吉西他滨溶液。将对应于每个孔的一半体积放回处理过的孔中，并将细胞孵育24小时。

为了固定和透化细胞，将冷甲醇加入含有细胞的24孔板中。还要准备一个带有冷PBS的六孔板。使用注射器针头和镊子，取下每张盖玻片并在PBS中清洗两次。

然后在甲醇中孵育六分钟。用PBS洗涤两次后，将盖玻片在封闭溶液中孵育一小时。在封闭溶液中以1:1000的比例加入抗LC3，并保持在冰上。

在多孔盖上放置一块实验室密封膜，并在密封膜上每张盖玻片上加入 25 微升抗 LC3 溶液。使用注射器针头和镊子，将每个盖玻片放在一抗液滴上，确保细胞侧与溶液接触。将多孔板放入湿度室中。

用箔纸盖住，在冰箱中孵育过夜。第二天，从湿度室中取出多孔板。将盖玻片放回多孔板上，并用PBS洗涤三次。

在封闭溶液中以1:800的比例稀释荧光标记的抗兔，并在黑暗中保持冰上。密封多孔盖后，在密封膜上每张盖玻片上加入 25 微升抗兔溶液。并如前所述，用二抗处理盖玻片。

然后将板在室温下在湿度室中孵育两个小时，避光。在用抗体孵育结束时，用PBS洗涤多孔板上的盖玻片三次。将每个盖玻片与准备好的DAPI溶液孵育10分钟。

用PBS洗涤后，将多孔板保持在黑暗中。对于细胞蒙太奇，准备两个装有水和一张纸的烧杯。在载玻片上的每张盖玻片上加入 10 微升 PVA-DABCO 溶液。

用水清洗盖玻片，然后在纸上晾干。最后，将其放在PVA-DABCO下降上。并在黑暗中干燥过夜。

第二天，使用倒置共聚焦显微镜，可视化标记的细胞并捕获图像。捕获图像后，将包含捕获通道的每个图像文件拖放到斐济屏幕中。在对话框中，单击"确定"以打开图像。

然后关闭打开的控制台窗口。从"图像"选项卡中，选择"颜色"，然后选择"拆分通道"。关闭与LC3图像以外的通道对应的图像。

然后在"图像"选项卡中，选择"调整"，然后选择"色彩平衡"。将最大滑块向左移动，直到图像饱和以可视化单元格轮廓。使用手绘选择工具绘制单元格轮廓，然后单击重置以调整颜色。

要从"编辑"选项卡中剪切所选项目，请选择"剪切"，然后关闭图像而不保存它。然后从编辑选项卡中，选择粘贴。在分析菜单中，选择工具 3D 对象计数器。

将阈值设置为 2000，将大小筛选器设置为 50 到 500。确保标记对象和摘要框，然后单击日志窗口 OK.In，点数将被描述为检测到的对象。免疫荧光指示LC3蛋白的细胞分布，而DAPI显示胰腺细胞中的核定位。

吉西他滨处理下LC3点显著增加，表明自噬活性。在过度汇合的情况下，外分泌胰腺细胞往往会堆积并相互叠加生长。多聚甲醛细胞固定方法对保存LC3蛋白无效，因为它不能反映准确的分布。

当接种后无需等待两天即可进行固定或处理时，PANC1细胞呈圆形。这种形态降低了细胞质和细胞核之间的关系，使得难以理解LC3的细胞内分布。不完全甲醇固定可能会干扰LC3免疫标记的正确性，导致图像不清晰和定量欠佳。

在此过程中要记住的最重要的事情是，细胞必须在冷甲醇中固定六分钟，而不是多聚甲醛。按照此过程，可以分析LC3与其他蛋白质之间的共定位，从而可以研究与LC3功能相关的不同分子途径。