Name: 使用LC3免疫荧光评估两种不同胰腺细胞模型中的自噬水平 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-28T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: 学习使用LC3免疫荧光技术评估胰腺癌细胞和胰腺腺泡细胞中的自噬水平。该方法通过定量分析LC3点状结构，帮助研究者检测吉西他滨对细胞自噬活性的影响，为胰腺癌分子机制研究提供可靠的实验方案。

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本工作得到了布宜诺斯艾利斯大学（UBACyT 2018-2020 20020170100082BA）、国家科学与技术研究委员会（CONICET）（PIP 2021-2023 GI− 11220200101549CO；和 PUE 22920170100033）以及国家科学技术促进局（PICT 2019-01664）的资助。

1. 细胞准备
<ol>
	<li>将直径12 mm的圆形盖玻片浸入无水乙醇中，然后垂直放入24孔板的孔内。</li>
	<li>打开盖子，将多孔板暴露于紫外线下照射15分钟。</li>
	<li>将盖玻片水平放置，并用杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）洗涤。</li>
	<li>接种低代次的胰腺细胞。接种量应根据固定当天达到50%–75%融合度进行调整16。 
	注意：建议每孔接种2.5 × 104个PANC-1细胞或4 × 104个AR42J细胞，以在接种后第3天进行细胞固定。</li>
	<li>将细胞在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的DMEM培养基中，于37 °C、5%二氧化碳（CO2）的湿润环境中培养。 
	​注意：对于PANC-1细胞，建议在细胞接种后培养2天再进行后续操作。在此之后，可对细胞进行转染、处理或固定。本方案以未转染的PANC-1细胞经吉西他滨处理，以及未转染的AR42J细胞进行分化和PP242处理为例进行说明。</li>
</ol>
2. 细胞处理
<ol>
	<li>吉西他滨处理 PANC-1 细胞
	<ol>
		<li>在接种后第 2 天，配制浓度为 1 µg/µL 的吉西他滨 DMEM 溶液。每孔加入 2.6 µL 该 1 µg/µL 吉西他滨溶液，使终浓度稀释至 20 µM。</li>
		<li>将细胞在培养箱中孵育 24 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>AR42J 细胞分化及 PP242 处理
	<ol>
		<li>配制浓度为 4 µg/mL 的地塞米松 DMEM 溶液。</li>
		<li>每孔加入 4.9 µL 的 4 µg/mL 地塞米松溶液，使终浓度稀释至 100 nM。</li>
		<li>将细胞在培养箱中孵育 48 小时。</li>
		<li>移除培养基，每孔加入 0.5 µL 的 1 mM PP242 溶液，使终浓度稀释至 1 µM。</li>
		<li>将细胞在培养箱中孵育 2 小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 细胞的固定与通透处理
<ol>
	<li>准备一个含有冷甲醇的24孔板和一个含有冷磷酸盐缓冲液（PBS；137 mM NaCl，2.7 mM KCl，8 mM Na2HPO4，2 mM KH2PO4）的6孔板。将两块板置于冰上保存。</li>
	<li>用镊子夹取每个盖玻片，用PBS洗涤两次，然后在甲醇中孵育6分钟。</li>
</ol>
4. 封闭细胞
<ol>
	<li>用 PBS 清洗每个盖玻片两次，然后在含 10% 胎牛血清的 PBS（封闭液）中孵育 1 小时。 
	​注意：此步骤中可暂停实验流程。盖玻片可在封闭液中于冰箱内保存过夜，次日继续后续操作。</li>
</ol>
5. 用一抗孵育盖玻片
<ol>
	<li>在封闭液中配制1:1,000的抗LC3抗体溶液，并置于冰上保存。</li>
	<li>将一块实验室封口膜覆盖在多孔板盖子上。</li>
	<li>在封口膜上每张盖玻片对应位置滴加一滴（25 µL）抗LC3抗体溶液。</li>
	<li>用镊子取每张盖玻片，将其细胞面朝下覆盖在抗体液滴上，注意使细胞面与溶液充分接触。</li>
	<li>将一张湿润的滤纸放入平底塑料盒中，制备一个湿盒。</li>
	<li>将多孔板放入湿盒中，用铝箔包裹后，于冰箱中孵育过夜。</li>
</ol>
6. 用二抗孵育盖玻片
<ol>
	<li>从湿化室中取出多孔板，并将盖玻片放回多孔板中。</li>
	<li>用 PBS 洗涤三次。</li>
	<li>在封闭液中按 1:800 的比例稀释荧光标记的抗兔抗体，置于冰上并避光保存。</li>
	<li>在多孔板盖上覆盖一片密封膜。</li>
	<li>在密封膜上每片盖玻片对应位置滴加一滴（25 µL）抗兔抗体溶液。</li>
	<li>用镊子夹取每片盖玻片，将其细胞面朝下覆盖在抗体液滴上，注意确保细胞面与溶液充分接触。</li>
	<li>将多孔板置于湿化室中，在室温（RT）避光条件下孵育 2 小时。</li>
</ol>
7. 使用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对细胞进行染色
<ol>
	<li>从湿度培养箱中取出多孔板，并将盖玻片放回多孔板中。</li>
	<li>用 PBS 洗涤三次。</li>
	<li>在 PBS 中配制 300 nM 的 DAPI 溶液（避光）。</li>
	<li>每张盖玻片加入 DAPI 溶液，避光孵育 10 分钟。</li>
	<li>用 PBS 洗涤三次。孵育过程中保持多孔板避光。</li>
</ol>
8. 镶嵌
<ol>
	<li>准备两个盛有水的烧杯和一张纸。</li>
	<li>用移液器在载玻片上每张盖玻片滴加一滴（10 µL）聚乙烯醇-对苯二甲酸双(三甲基铝)-1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷加合物（PVA-DABCO）溶液。 
	注意：PVA-DABCO 溶液的制备方法是将 0.25 M DABCO、10% W/V PVA、20% 甘油和 50% Tris HCl（1.5 M，pH 8.8）溶于超纯水中混合而成。</li>
	<li>用镊子夹取每张盖玻片，依次在两个水烧杯中清洗，然后在纸上吸干，并将其盖在 PVA-DABCO 液滴上（使细胞面与溶液接触）。</li>
	<li>避光过夜干燥。</li>
</ol>
9. 共聚焦显微镜观察与图像采集
<ol>
	<li>使用约 63 倍的物镜，在倒置共聚焦显微镜下观察盖玻片17。</li>
	<li>采集标记细胞的代表性图像。</li>
</ol>
10. LC3 斑点的定量分析
<ol>
	<li>将包含捕获通道的每个图像文件（例如“.czi”）拖放到 ImageJ（FIJI）界面中以打开。在弹出的对话框中点击 确定，然后关闭 控制台 窗口。</li>
	<li>从 图像 选项卡中，选择 颜色 &gt; 拆分通道。</li>
	<li>关闭除 LC3 图像以外的其他通道对应的图像。</li>
	<li>从 图像 选项卡中，选择 调整 &gt; 色彩平衡。</li>
	<li>向左移动 最大值 滑块，直至图像饱和，以便观察细胞轮廓。</li>
	<li>使用 自由手选区 工具绘制细胞轮廓。</li>
	<li>点击 重置 按钮以恢复颜色调整设置。</li>
	<li>从 编辑 选项卡中，选择 剪切 以剪切所选区域。</li>
	<li>关闭图像且不保存。</li>
	<li>从 编辑 选项卡中，选择 粘贴。</li>
	<li>在 分析 菜单中，选择 3D 对象计数器 工具。</li>
	<li>设置阈值。本研究示例中，阈值设为 2,000。</li>
	<li>设置大小滤波器。本研究中，设定范围为 50 至 500。</li>
	<li>确保勾选 对象 和 摘要 复选框。</li>
	<li>点击 确定。检测到的斑点数量将在 摘要 中显示为 检测对象数。</li>
</ol>
<img alt="抗体标记与分析的免疫荧光检测流程图，包含步骤和试剂。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65005/65005fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：LC3 免疫荧光实验流程示意图。 本图展示了LC3免疫荧光检测的通用实验流程。图片由BioRender.com制作。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65005/65005fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

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</ol>

未声明任何利益冲突。

本方案中描述的方法可用于观察细胞内源性LC3的分布，并在不同条件下定量自噬水平。另一种用于分析LC3分布并确定自噬激活状态的类似方法是转染荧光标记的LC3（例如RFP-LC3）19。RFP-LC3转染的优势在于无需固定细胞（因此可用于活细胞成像20），成本较低，且不依赖于LC3抗体的反应性。另一方面，LC3免疫荧光的优势在于能够呈现内源性LC3的图像，从而避免因LC3过表达可能引起的问题，例如形成与自噬无关的蛋白质聚集体21。此外，该方法不受细胞转染难易程度的影响，因此适用于多种细胞系。然而，该方法的效果取决于所使用的LC3抗体及其反应性，某些细胞系中可能无法有效工作。某些抗体可能对特定物种效果良好，但对其他物种无效，即使理论上这些抗体应能兼容不同物种。以本方案中使用的抗体（LC3B&#160;D11）为例，我们发现其在人源细胞（PANC-1、HEK293T、HeLa）和大鼠细胞（AR42J）中效果良好，但在小鼠细胞（MEF细胞）中不适用，因其出现非特异性的细胞核染色。值得注意的是，无论针对内源...

巨自噬（通常称为自噬）是一种特异性的分解代谢过程，可选择性地降解细胞质成分，包括蛋白质和受损的细胞器1,2。自噬使细胞能够对各种应激刺激产生生理反应，从而维持细胞内的稳态3。在自噬过程中，会形成一个双层膜囊泡：即自噬体。自噬体包裹待降解的货物分子，并将其运送至溶酶体进行降解1,4。
自噬体上装饰有自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3（LC3）5。当自噬未被诱导时，LC3以LC3-I构象弥散分布在细胞质和细胞核中。相反，当自噬被诱导时，LC3会与自噬结构膜上的磷脂酰乙醇胺发生共价结合6。这种新的LC3构象被称为LC3-II1。LC3构象的转变会引起其细胞定位以及十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）迁移行为的改变，这些变化可通过免疫荧光和蛋白质印迹等技术检测到5,7。因此，LC3的共价修饰是自噬过程中的一个关键事件，可用于评估自噬活性。
胰腺腺泡细胞是一种高度分化的细胞，在健康状态下自噬水平较低。然而，在不同的生理条件或药物刺激下，这类细胞可激活自噬。因此，检测该细胞系中的自噬水平有助于研究不同药理学或生物学试剂对自噬的潜在直接或间接影响8,9。
导管腺样胰腺癌是致死率最高的癌症类型之一，因其诊断时间较晚且对化疗具有高度耐药性10。由于自噬相关蛋白的转录水平上调以及翻译后激活，胰腺癌细胞表现出高水平的自噬活性11。在缺氧、营养缺乏或化疗引起的损伤等不利条件下，胰腺癌细胞可能调节其自噬水平以适应环境11。因此，分析胰腺癌细胞中的自噬水平有助于理解其对不同环境的适应机制，并评估调节自噬治疗策略的有效性。
本研究展示了一种在两种不同的胰腺细胞模型中进行LC3免疫荧光检测的方法。第一种模型PANC-1细胞，作为胰腺导管腺癌的模型。这些细胞经吉西他滨处理，吉西他滨是一种化疗药物，先前已被证明可诱导携带致癌性Kirsten大鼠肉瘤病毒基因（KRAS）的胰腺癌细胞发生自噬12,13。第二种模型AR42J细胞，则作为外分泌胰腺细胞的更接近生理状态的模型。这些细胞通过地塞米松诱导分化，使其更类似于胰腺腺泡细胞14。在该细胞模型中，使用PP242这一强效mTOR抑制剂，药理学诱导自噬15。本研究中，我们证明了所述实验方案在两种不同胰腺细胞模型中的适用性，及其区分低水平与高水平自噬状态的能力。

<table><tbody><tr><td>10x 磷酸盐缓冲液 (PBS)</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>12 mm 圆形盖玻片</td><td>HDA</td><td>CBR_OBJ_6467</td><td></td></tr><tr><td>24 孔细胞培养板</td><td>Sorfa</td><td>220300</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>Biopack</td><td>2207.10.00</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 驴抗兔 IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>R37119</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜</td><td>Zeiss</td><td>LSM 800</td><td></td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>DMEN</td><td>Sartorius</td><td>01-052-1A</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>NATOCOR&amp;nbsp;</td><td>Lintc-634</td><td></td></tr><tr><td>吉西他滨</td><td>Eli Lilly</td><td>VL7502</td><td></td></tr><tr><td>LC3B (D11) XP 兔单克隆抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3868S</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Anedra</td><td>6197</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm &quot;M&quot;（实验室封口膜）</td><td>Bemis/Curwood</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液</td><td>Sartorius</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>PP242</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-301606</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶 EDTA</td><td>Gibco</td><td>11570626</td><td></td></tr></tbody></table>

利用lc3免疫荧光评估两种不同胰腺细胞模型中的自噬水平

Evaluating Autophagy Levels in Two Different Pancreatic Cell Models Using LC3 Immunofluorescence

自噬是一种特异性的分解代谢过程，可选择性降解细胞质成分，包括蛋白质和受损的细胞器。自噬使细胞能够对各种应激刺激产生生理反应，从而维持细胞内稳态。癌细胞可能通过调节其自噬水平，以适应缺氧、营养缺乏或化疗引起的损伤等不利条件。导管型胰腺腺癌是最致命的癌症类型之一。由于自噬相关蛋白的转录水平上调以及翻译后激活，胰腺癌细胞表现出高水平的自噬活性。
本研究采用 PANC-1 细胞系作为人胰腺癌细胞的模型，AR42J 胰腺腺泡细胞系作为高度分化的哺乳动物细胞的生理模型。研究利用微管相关蛋白轻链 3（LC3）的免疫荧光作为自噬激活状态的指标。LC3 是一种自噬相关蛋白，在基础状态下于细胞质中呈弥散性分布（此状态下的 LC3 称为 LC3-I）。自噬诱导会触发 LC3 与新形成的自噬体膜表面的磷脂酰乙醇胺发生共价结合，形成 LC3-II，这是一种膜结合蛋白，有助于自噬体的形成与扩展。为了定量标记的自噬结构数量，使用了开源软件 FIJI，并借助 &#34;3D Objects Counter&#34; 工具进行分析。
在生理条件和癌细胞中检测自噬水平，可使我们研究在缺氧、化疗处理或某些蛋白质敲低等不同条件下自噬的调控情况。

本方案通过在不同条件下对胰腺细胞系中的LC3进行免疫荧光染色，以测定自噬水平。该实验的结果获得了来自红色和蓝色通道的细胞图像，分别对应LC3和DAPI。LC3图像显示了该蛋白在细胞内的分布情况，而DAPI则显示细胞核的定位。图2A展示了在基础条件或吉西他滨处理条件下PANC-1细胞中LC3免疫荧光及其与DAPI染色合并的代表性图像。一组LC3染色图像使用FIJI软件中的3D Objects Counter工具进行分析。利用该软件，定量了每个细胞中LC3斑点的数量。图2B中的柱状图显示了PANC-1细胞在基础条件与吉西他滨处理条件下LC3斑点数量的定量结果。该图显示，在吉西他滨处理下LC3斑点数量显著增加，LC3斑点数直接反映了自噬活性。我们此前也已证实，吉西他滨可诱导胰腺癌细胞发生自噬12。总体而言，本文所介绍的方法可用于检测吉西他滨在这些细胞中诱导的自噬活化水平的升高程度。
尽管本...

本实验方案的目的是通过LC3免疫荧光染色及LC3点状结构定量分析，检测胰腺癌细胞和胰腺腺泡细胞中的自噬水平。

利用LC3免疫荧光评估两种不同胰腺细胞模型中的自噬水平

自噬是一种特化的分解代谢过程，可选择性降解细胞质成分，包括蛋白质和受损细胞器。自噬能够……

LC3免疫荧光技术可用于测定胰腺细胞中的自噬水平，能够研究不同干预因素对胰腺细胞自噬的潜在影响。该技术用于检测内源性LC3蛋白，避免了过表达LC3所导致的问题，例如形成与自噬无关的蛋白聚集体。进行实验操作的是来自玛丽亚·伊内斯·瓦卡罗实验室的博士毕业生费利佩·伦纳（Felipe Renna）和博士生马伦娜·埃雷拉·洛佩斯（Malena Herrera Lopez）。开始细胞准备时，将12毫米圆形盖玻片浸入无水乙醇中。取出盖玻片后，将其垂直放入24孔板中。将多孔板暴露于紫外辐射下15分钟。然后将盖玻片水平放置，并用DMEM洗涤。现在加入低代次的胰腺细胞，该细胞重悬于含有10% FBS、青霉素和链霉素的DMEM中，孵育细胞两天。细胞接种后两天，在DMEM中配制浓度为每微升1微克的吉西他滨溶液。随后，将每个孔中的培养基吸取一半至单独的离心管中，加入适量的吉西他滨溶液。再将对应孔的半量培养基重新加回处理孔中，继续培养细胞24小时。为了固定和通透细胞，将冷甲醇加入含有细胞的24孔板中。同时准备一个含有冷PBS的6孔板。使用注射器针头和镊子取出每一张盖玻片，并在PBS中清洗两次。然后在甲醇中孵育6分钟。用PBS洗涤两次后，将盖玻片在封闭液中孵育1小时。在封闭液中加入抗LC3抗体，稀释比例为1:1000，并置于冰上保存。在多孔板盖上覆盖一层实验室密封膜，然后在密封膜上每张盖玻片处加入 25 µL 抗 LC3 溶液。使用注射器针头和镊子，将每张盖玻片放置于一抗液滴上方，确保细胞面与溶液接触。将多孔板放入湿化孵育盒中。用锡箔纸覆盖，并在冰箱中孵育过夜。第二天，从湿盒中取出多孔板。将盖玻片重新放回多孔板上，用 PBS 洗涤三次。将荧光标记的抗兔抗体用封闭液按1:800的比例稀释，并在避光条件下冰上保存。密封多孔板盖后，通过密封膜向每张盖玻片上各加入25 µL抗兔抗体溶液。随后按照之前所示方法，用二抗处理盖玻片。然后将培养板置于湿盒中，室温避光孵育2小时。抗体孵育结束后，用PBS洗涤多孔板上的盖玻片3次。每张盖玻片加入配制好的DAPI溶液，孵育10分钟。用 PBS 洗涤后，将多孔板置于避光环境中。进行细胞拼接时，准备两个盛有水的烧杯和一张纸。在载玻片上的每张盖玻片上各加入 10 µL PVA-DABCO 溶液。用水清洗盖玻片，然后在纸巾上晾干。最后将其覆盖在 PVA-DABCO 液滴上，并在避光条件下过夜干燥。第二天，使用倒置共聚焦显微镜观察标记的细胞并采集图像。采集图像后，将包含各通道图像的文件逐个拖放到 Fiji 界面中。在弹出的对话框中，单击“确定”以打开图像。然后关闭已打开的控制台窗口。在“图像”选项卡中，选择“颜色”，然后选择“拆分通道”。关闭除LC3图像以外的其他通道对应的图像。然后在“图像”选项卡中，选择“调整”，接着选择“色彩平衡”。向左移动最大滑块，直到图像达到饱和，以显示细胞轮廓。使用手绘选择工具绘制细胞轮廓，然后单击“重置”以调整颜色。在“编辑”选项卡中，选择“剪切”以剪切选定的项目，然后在不保存的情况下关闭图像。接着在“编辑”选项卡中选择“粘贴”。在“分析”菜单中，选择工具“3D对象计数器”。将阈值设为2000，大小过滤范围设为50至500。确保勾选“对象”和“摘要”框，然后点击“确定”。在日志窗口中，检测到的点状结构数量将显示为“检测到的对象”。免疫荧光显示LC3蛋白在细胞内的分布情况，而DAPI则显示胰腺细胞中细胞核的定位。吉西他滨处理后，LC3 斑点显著增加，表明自噬活性增强。当细胞过度汇合时，外分泌胰腺细胞容易堆积并相互重叠生长。多聚甲醛细胞固定法在保存 LC3 蛋白方面效果不佳，因其无法准确反映 LC3 蛋白的真实分布情况。若在接种后未等待两天即进行固定或处理，PANC1细胞会呈现圆形。这种形态会降低细胞质与细胞核之间的比例，从而难以判断LC3在细胞内的分布情况。甲醇固定不充分可能干扰LC3的免疫标记，导致图像不清晰和定量结果不理想。此操作过程中最重要的是，细胞必须用冷甲醇固定六分钟，而不是用多聚甲醛。按照此步骤操作后，可分析LC3与其他蛋白之间的共定位，从而研究与LC3功能相关的不同分子通路。

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科研

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Biology

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使用LC3免疫荧光评估两种不同胰腺细胞模型中的自噬水平

自噬是一种普遍存在的过程，使细胞能够降解并回收蛋白质和细胞器。我们采用先进的荧光显微技术，对自噬诱导过程中发生的微小但关键的物理变化进行可视化和定量分析，包括自噬体和溶酶体的形成与分布，以及它们融合形成自噬溶酶体的过程。...

利用先进的三维荧光显微镜对自噬进行定量分析

通过荧光标记的自噬标志物进行延时显微成像，可实现对动态自噬反应的高时间分辨率监测。结合三种不同颜色的特异性自噬和细胞器标志物，我们能够在稳定的空间和时间背景下追踪某蛋白质在自噬体形成过程中的作用。...

活细胞成像观察早期自噬事件：omegasome 及其相关过程

本研究采用多光谱成像流式细胞术，结合分析功能，对3种自噬标志物的明场细节图像进行比较，并定量分析其共定位情况，同时进行LC3斑点计数，从而以客观、定量且具有统计学稳健性的方式检测自噬水平。...

利用多光谱成像流式细胞术通过检测LC3、p62和LAMP1共定位评估自噬流

本文介绍了两种基于抗体的蛋白质-蛋白质相互作用研究技术：免疫荧光和免疫沉淀。这些技术适用于研究蛋白质之间的物理相互作用，可用于发现细胞信号通路中的新组分，并有助于理解蛋白质的动态行为。<br...

自噬研究中蛋白质-蛋白质相互作用的研究

活跃的自噬作用与有效的肌肉再生密切相关，而肌肉再生对于肌肉干细胞（MuSC）的活化至关重要。本文提供了一种 原位 检测对照组和损伤小鼠肌肉组织切片中 MyoD 阳性肌卫星细胞（MuSCs）内自噬标志物...

原位 肌肉干细胞自噬的免疫荧光染色

线粒体自噬是清除受损线粒体的过程，对于维持线粒体稳态和健康至关重要。本文介绍了一些在人类细胞、秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

体外 与 体内 检测人细胞、C. elegans 及小鼠中的线粒体自噬

本文介绍了一种基于内源性荧光标记的优化切片上相关光镜-电镜联用技术方案，用于研究稀有蛋白质相对于细胞超微结构的定位。该方法的优势通过在未使用巴佛洛霉素处理的饥饿细胞中实现内源性LC3蛋白的超微结构定位得以展示。...

通过切片上相关联的光学-电子显微镜对内源性LC3进行超微结构定位

本方案概述了两种用于定量分析胰腺β细胞有丝分裂的实验方法：第一种是结合使用可穿透细胞的线粒体特异性染料，第二种是利用基因编码的有丝分裂报告系统。这两种技术互为补充，可根据具体需求灵活选用，从而在定量研究线粒体质量控制方面实现灵活性与精确性。...

探究胰岛β细胞中线粒体自噬流的互补方法

本文介绍了通过免疫印迹法简洁评估细胞外囊泡（EVs）中自噬体标志物LC3-II水平的方法。对EVs中LC3-II水平、自噬溶酶体形成以及omegasome形成的分析表明，当自噬体与溶酶体融合受阻时，STX6在释放LC3-II阳性EVs中具有新的作用。...

通过细胞外囊泡评估LC3-II的释放及其与细胞内LC3阳性囊泡积聚的关系

多光子显微镜能够调控低能量光子，实现深层光学穿透并降低光毒性。我们介绍了该技术在斑马鱼胚胎活细胞标记中的应用。该方案可轻松适用于多种光响应分子的光诱导实验。...

活体斑马鱼胚胎中的双光子诱导光激活

学习使用LC3免疫荧光技术评估胰腺癌细胞和胰腺腺泡细胞中的自噬水平。该方法通过定量分析LC3点状结构，帮助研究者检测吉西他滨对细胞自噬活性的影响，为胰腺癌分子机制研究提供可靠的实验方案。

利用LC3免疫荧光评估两种不同胰腺细胞模型中的自噬水平

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