利用先进的三维荧光显微镜对自噬进行定量分析

本实验的总体目标是获取经处理的前列腺肿瘤细胞的定量图像，以测量不同时间点自噬的程度和范围。首先，使用精氨酸、酶或其他实验试剂处理细胞，以诱导自噬和/或细胞死亡。第二步是确定对活细胞或固定细胞进行成像，并相应地准备样品。

接下来，使用宽场、去卷积或结构光照明显微镜对活细胞或固定细胞获取三维荧光图像。最后一步是收集有关自噬体大小分布及其与其他细胞内结构共定位的统计学数据。通过使用数字化三维图像分析软件，该方法能够获得结果，不仅表明精氨酸酶诱导的自噬可导致前列腺肿瘤细胞死亡，还显示这些细胞发生的结构改变在形态学上明显区别于凋亡和坏死相关的改变。

该技术相较于其他现有方法的主要优势在于，定量三维成像能够显示特定分子事件在活细胞内的发生时间和位置，并以三维形式呈现。首先，按照文本方案所述，在35毫米多聚赖氨酸包被的玻璃底培养皿中培养表达绿色荧光蛋白（GFP）融合轻链3（LC3）的人前列腺癌细胞。细胞接种密度应足够高以促进快速增殖，但不可过高，以免成像时细胞过度生长并聚集成团。在成像前约一小时，用含精氨酸酶或DI的PBS处理选定的细胞样本，以耗尽细胞内的游离精氨酸，从而诱导癌细胞产生代谢应激。将1.5 µL LysoTracker Red溶于20 mL含10% FPS和1%抗生素的RPMI培养基中。在将所有培养基预热至37°C后，为经DI处理的选定样本配制相应的溶液。

向每个培养皿中加入适量的培养基，在37摄氏度条件下，用含有LYO Tracker Red的RPMI培养基孵育细胞15至45分钟，成像前约30分钟开始孵育。打开气象站环境培养箱，使其平衡至37摄氏度和5%二氧化碳环境，用PBS洗涤细胞，并将培养基更换为仅含10%FBS和1%抗生素的标准RPMI培养基。根据需要向样品中加入DI。

使用定制适配器安装35毫米盖玻片底培养皿。在60倍DX放大、1.42数值孔径的物镜上使用浸油，并将安装好的培养皿置于显微镜载物台上。本视频中，采用Delta Vision个人IDV定位系统、反卷积显微镜及Associated Soft Works应用套件演示三维显微成像技术。

首先，开启显微镜系统，包括采集工作站和仪器控制器。打开 Resolve 3D 计算机控制应用程序，以初始化显微镜载物台并开启氙灯光源。等待 10 分钟，使光源预热并达到稳定状态。

在六倍DX放大倍数、数值孔径为1.42的物镜上滴加一滴浸油，使用明场或外部照明以及粗调焦旋钮，将带有盖玻片的载玻片标本翻转朝下对准物镜中心。缓慢调节旋钮，使物镜上升，直至浸油与倒置的盖玻片接触。此后，调节细调焦旋钮数圈内，细胞层应进入焦点范围。

处理载玻片上的固定样品时，建议避免选择气泡内部或附近的细胞。使用玻璃底培养皿观察活体样品时，应避免将物镜移出玻璃盖片边界之外。选择所需的视野。

理想情况下，细胞应在所有相应的通道中表现出良好的荧光信号，并且在盖玻片表面充分贴附和铺展，以便于观察细胞内组分。可通过计算机使用采集 3D 界面来控制 X、Y 和 Z 轴方向上的微小调整。根据所需视野大小，设置分 bin 为 1×1 或 2×2，以获取细胞中段的图像，并设定曝光参数，使最大像素强度不超过 3000 计数。

通常应将透光率设置为尽可能低，同时不增加相应的曝光时间。曝光时间超过一秒。对每一种待成像的荧光颜色以及每一个不同的视野，均需重复此操作步骤。

为了获得最高质量的图像，通过分别轻微调整细胞样本顶部和底部的焦距，来设定Z轴的上限和下限。因此，特定Z层叠图像的总数将由这些限值以及各层之间的间距决定。为在图像采集过程中尽量减少运动伪影，可将图像采集模式设置为按波长进行。

然后对固定样品进行ZS层扫，对活体样品则先进行ZS层扫再进行波长扫描。所有参数设置完毕后，即可采集荧光图像。随后使用SoftWorks软件对荧光图像进行去卷积处理，并利用Velocity软件进行后续分析。

此处显示的图像序列展示了在自噬诱导的前80分钟内，cwr 22细胞发生的物理变化。在这些图像中，白色虚线代表细胞的轮廓，浅色阴影区域代表细胞核的位置。在80分钟的过程中，图像显示细胞核从细胞中心向外移位，黏着斑点减少，以及常染色体和溶酶体总体向细胞中心迁移，分别在后期时间点以绿色和红色显示。

在常染色体与溶酶体之间也观察到共定位略有增加，表现为黄色区域。随后使用 Velocity 数字成像应用套件对 CWR 22 细胞图像中标记的常染色体和溶酶体进行识别、计数并收集统计学数据。此处显示的是常染色体在初始形成并出现后，其数量和大小随时间而变化的情况。

自噬诱导80分钟后，常染色体数量逐渐减少，同时其平均尺寸相应增加。此外，基于Pearson相关系数分析，常染色体与溶酶体的共定位显著增强。这些结果共同表明，在自噬被激活后，大量较小的常染色体会随时间融合形成更大的常染色体。

此处展示的是在DV模式下采集和重建的图像、模拟的宽场去卷积图像与结构光照明显微图像的并列比较。使用OMX显微镜，横向分辨率提高至最高120纳米，达到传统衍射极限显微镜分辨率的两倍。通过超分辨率显微技术，常染色体与溶酶体之间的微小共定位关系清晰可见，而在传统荧光成像中则几乎无法分辨。

使用去卷积显微镜的一个优势在于能够将所有图像重建为三维模型，从而揭示不同分子之间更精确的空间信息。此处展示的是一张 Cwr22RV1 细胞在较晚时间点发生自噬的整体图像，其中自噬体与溶酶体之间开始出现大量共定位现象。本视频中以白色显示的连续染色信号，揭示了目标细胞的轮廓。

三维重建模型提供了关于常染色体与溶酶体融合更丰富的空间细节。如黄色所示，绿色轻链三信号与红色溶酶体信号之间的相互作用在出现合并信号从而产生黄色时尤为明显。因此，该方法将解决自噬研究中研究人员面临的两大主要挑战。

首先，我们希望通过使用微流体技术，在显微镜载物台上利用灌流腔室维持细胞原有的生理状态，从而营造一个无应激的环境。第二个挑战是收集具有统计学意义的定量图像数据：对于固定细胞，我们通常会从大量不同的细胞中采集图像，并将这些图像整合为有用的信息；而对于活细胞，则是通过随时间追踪单个细胞来获取相应的信息。

因此，我们认为该技术将使其他研究人员能够研究自噬在不同器官和不同疾病中的功能与作用。