Name: 采用先进的3D荧光显微镜定量分析自噬 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: 学习使用先进3D荧光显微镜定量分析前列腺肿瘤细胞中的自噬过程。该方法通过可视化自噬体和溶酶体动态，帮助研究人员测量自噬程度并区分细胞死亡形态特征。

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基金支持：NIH CA165263、NIH CA150197、NIH CA150197S1（H.J. Kung）、NIH CA150197S1（C.A. Changou）、NSF PHY-0120999 生物光子学科学与技术中心（D.L. Wolfson, F.Y.S. Chuang）、DOD PC073420（R.J. Bold）、挪威研究理事会、Leiv Eiriksson 出国研修奖学金 209286/F11（B.S. Ahluwalia）。H.J. Kung 还感谢 Auburn 社区癌症捐赠基金的支持。R.J. Bold 还感谢 J. McDonald 捐赠基金的支持。
我们感谢 DesigneRx 的 Jenny Wei-Jen Kung 博士和 Bor-wen Wu 博士慷慨提供 ADI。

第一部分：细胞培养与免疫荧光标记
<ol>
	<li>将CWR22Rv1人前列腺肿瘤细胞培养于置于6孔板中的玻璃盖玻片（#1.5或170 μm厚度）上，使用含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素/谷氨酰胺的RPMI培养基（Mediatech，VA）。</li>
	<li>通过在磷酸盐缓冲液（PBS）中加入精氨酸脱亚酶（ADI，0.3 μg/ml）处理选定样本，以诱导自噬。</li>
	<li>用PBS稀释的4%多聚甲醛（PFA，Fisher Scientific，NH）固定细胞，每张盖玻片加100 μl，室温孵育10分钟。</li>
	<li>用1 ml HBS/BSA洗涤细胞3次。</li>
	<li>用含0.05%皂苷（Sigma，MO）的HEPES（HBS）/BSA溶液对细胞进行透化处理，每张盖玻片加100 μl，室温孵育15分钟。</li>
	<li>免疫标记前，用含2.5%酪蛋白（Sigma，MO）的HBS/BSA溶液封闭样本，每张盖玻片加100 μl，室温孵育1小时。</li>
	<li>将固定后的细胞与用2.5%酪蛋白/HBS/BSA稀释的一抗孵育，每张盖玻片加100 μl，4 °C过夜（O/N）。</li>
	<li>用1 ml HBS/BSA洗涤细胞3次。</li>
	<li>将固定后的细胞与用2.5%酪蛋白/HBS/BSA稀释的二抗孵育，每张盖玻片加100 μl，室温孵育1小时。</li>
	<li>用1 ml HBS/BSA洗涤细胞3次。</li>
	<li>使用含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的SlowFade Gold或Prolong Gold抗荧光淬灭试剂（Invitrogen，CA），将制备好的盖玻片封片于普通载玻片上。</li>
	<li>用指甲油密封盖玻片边缘。为获得最佳成像效果，应给予足够时间（理想情况下过夜）使抗荧光淬灭封片剂充分渗透细胞。</li>
	<li>用甲醇和/或氯仿清洁盖玻片表面。</li>
	<li>在60倍、数值孔径1.42的物镜（Olympus，日本）上滴加浸油（37 °C成像时折射率为1.520，室温成像时为1.516）。</li>
	<li>将载玻片置于显微镜载物台上，并对目标细胞进行调焦。</li>
</ol>
2. 第2部分：活体成像前的细胞准备
<ol>
	<li>在含有10% FBS和1%抗生素的RPMI培养基中，将表达绿色荧光蛋白标记的轻链3（LC3-GFP）的CWR22Rv1细胞接种于35 mm多聚-D-赖氨酸包被的玻璃底培养皿（MatTek，MA）中进行培养。细胞接种密度应足够高以促进快速增殖，但不可过高，以免在成像时细胞过度生长并聚集成团。</li>
	<li>用PBS中的ADI（0.3 μg/ml）处理选定的细胞样本。</li>
	<li>成像前约1小时，将1.5 μl LysoTracker Red DND-99（Invitrogen，CA）溶于20 ml含10% FBS和1%抗生素的RPMI培养基中。对于选定样本，使用含ADI的溶液。在加入培养皿前，将所有培养基预热至37 °C。</li>
	<li>将细胞在含LysoTracker Red DND-99的RPMI培养基中，于37 °C孵育15–45分钟。</li>
	<li>成像前约30分钟，开启WeatherStation环境控制箱，并使其内部环境平衡至37 °C、5% CO2（使用加湿空气）。</li>
	<li>用PBS洗涤细胞，更换为仅含10% FBS和1%抗生素的标准RPMI培养基。根据需要向样本中添加ADI。</li>
	<li>将35 mm玻璃底培养皿安装至定制适配器（Applied Precision, Inc.，WA）中，并置于显微镜载物台上。在60倍、数值孔径1.42的物镜上使用浸油（折射率1.520），并将安装好的培养皿放置于载物台指定位置。</li>
</ol>
3. 第三部分：去卷积显微镜与分析
本节方案假设使用 DeltaVision Personal DV 去卷积显微镜及配套的 SoftWorX 应用软件套装（Applied Precision, Inc., WA）。
<ol>
	<li>打开显微镜系统，包括采集工作站和仪器控制器。启动 Resolve3D 软件以初始化显微镜载物台，并开启氙灯光源。等待 10 min，使光源预热并达到稳定状态。</li>
	<li>在60倍1.42数值孔径物镜上滴加一滴浸油（活体样本在37 °C时折射率为1.520，固定样本在室温下为1.516），将载玻片标本（盖玻片朝下）置于物镜中央。</li>
	<li>使用明场或外部照明，并通过粗调焦旋钮缓慢升高物镜，直至浸油液滴接触到倒置的盖玻片。（此后，通过微调焦旋钮旋转几圈即可使细胞层清晰对焦）。在载玻片上观察固定样品时，建议避开气泡内部或附近的细胞区域。使用玻璃底培养皿观察活细胞样品时，应避免将物镜移出盖玻片边界的范围。</li>
	<li>自噬体可通过 eGFP 信号（绿色）进行鉴定。溶酶体通过 LysoTracker Red（活体样本）或抗 Lamp1 荧光抗体（固定样本）进行鉴定。细胞核通过 DAPI 染色（固定样本）进行鉴定。</li>
	<li>选择合适的视野。理想情况下，细胞应在所有相应的荧光通道中表现出良好的荧光信号，并且在盖玻片表面充分贴附和铺展，以便于观察细胞内结构。可通过计算机使用 Acquire3D 界面调节 x、y 和 z 轴方向的微小位移和焦距。根据所需的视野大小设置像素合并模式为 1x1 或 2x2（当设置为 2x2 时，视野中可观察到更多的细胞）。</li>
	<li>对于通过细胞中段的给定图像，设置曝光参数（例如 %透射功率和曝光时间，使最大像素强度不超过3,000计数。通常应将%透射设置为尽可能低，同时避免相应曝光时间超过1秒。对每种待成像的荧光颜色及每个独立的视野均重复此步骤，以获得最高质量的图像。</li>
	<li>通过调节焦距，分别略超出细胞样本的顶部和底部，以设定Z轴层叠的上限和下限。因此，给定Z轴层叠中的图像总数将由这两个限值以及层间间距（默认值：0.2 μm）共同决定。</li>
	<li>为尽量减少图像采集过程中的运动伪影，我们建议对固定样品采用“先波长后z轴堆叠”的图像采集模式，对活体样品采用“先z轴堆叠后波长”的图像采集模式。</li>
	<li>使用SoftWorX（Applied Precision，WA）对荧光图像进行去卷积处理，随后使用VoloCITY（Improvision，现为Perkin Elmer，MA）进行分析。</li>
</ol>
4. 第四部分：超分辨率结构照明显微镜（OMX）
本节中的方案适用于 OMX 结构照明显微镜（Applied Precision，WA）的操作。
<ol>
	<li>打开主电源及所需激光器（410 nm、488 nm 和/或 532 nm）。等待 20 分钟，使激光器达到热稳定状态。</li>
	<li>在 60X 1.42 N.A 物镜上滴加浸油（室温下固定样品用，折射率为 1.516）。若油滴中出现气泡，需清洁物镜后重新添加浸油。</li>
	<li>将样品载玻片放置于载物台上，如有需要，静置约 10 分钟，使细胞沉降并贴附于盖玻片上。</li>
	<li>启动图像采集程序。使用荧光照明调节焦距，直至观察到清晰的细胞轮廓。（在整个操作过程中应始终注意，尽量减少细胞在实际图像采集前暴露于荧光激发光下的时间。）</li>
	<li>可采用螺旋马赛克扫描方式预览样品较大区域，以选择目标细胞或感兴趣区域。建议在扫描样品或寻找目标时使用较短的曝光时间（1–10 毫秒）和较低的激发光强度（0.1–1% 透射率）。</li>
	<li>通过 GFP-LC3 荧光识别自噬体；利用 Alexa Fluor 555 标记的抗 LAMP 抗体（溶酶体相关膜蛋白）识别溶酶体，并使用 DAPI 标记细胞核（适用于固定样品）。</li>
	<li>选择实验条件，包括激发波长、成像区域（例如 512×512）、Z 轴层厚、曝光时间以及激光透射百分比。若需获取超分辨图像，请确保启用结构光照明显微选项；若在 OMX 系统上进行去卷积显微成像，则选择常规照明模式。</li>
	<li>为获得最佳重建效果，应选择实验参数，使采集过程中最大强度计数保持在 10,000 至 15,000 之间。若存在光漂白问题，可采用较低曝光条件（计数在 5,000 至 10,000 之间）。理想情况下，整个采集过程中计数下降不应超过两倍，应避免下降超过四倍的情况。如有必要，可减小 Z 轴层厚以维持稳定的强度计数。相机饱和值为 64,000 计数，因此最大强度绝不可超过此值。对于质量良好的样品，我们发现实验条件通常为 10–50 毫秒曝光时间，激光透射率为 1%。优先选择亮度高且光稳定性好的样品，以便重复成像。对于延时成像和超分辨成像，必须使用稳定的染色样品。</li>
	<li>为降低噪声，建议采用 95 MHz 读出速度（中速模式）并设置不少于 2 毫秒的采集时间。若样品在采集过程中发生移动，重建图像中将产生更多伪影。因此，对于非贴壁细胞或运动较快的细胞，建议采用较短的曝光时间。</li>
	<li>多通道成像可同时或顺序进行。顺序成像模式可减少串扰，因此推荐使用。</li>
	<li>为减少光漂白，通常建议优先使用较长激发波长进行成像（即 532 nm、488 nm，最后为 410 nm）。然而，对于 图 3 所示的实验结果，由于该特定样品具有较高的光稳定性，成像顺序被反转（即 488 nm、532 nm 和 410 nm）。</li>
	<li>通过移动显微镜载物台，使细胞顶部和底部刚好略微失焦，以此设定 Z 轴堆栈的上下限。对于超分辨成像，每幅图像之间的理想间距应恒定为 0.125 μm，因为重建软件默认采用该数值。</li>
	<li>使用 SoftWorX（Applied Precision, WA）对图像堆栈进行重建，并使用 VoloCITY 6.0（Perkin Elmer, MA）进行分析。</li>
</ol>

<ol><li>Kim, R. H., Coates, J. M., Bowles, T. L., McNerney, G. P., Sutcliffe, J., Jung, J. U., Gandour-Edwards, R., Chuang, F. Y., Bold, R. J., Kung, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine+deiminase+as+a+novel+therapy+for+prostate+cancer+induces+autophagy+and+caspase-independent+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Arginine deiminase as a novel therapy for prostate cancer induces autophagy and caspase-independent apoptosis.</a> Cancer Res. 69 (2), 700-708 (2009).</li>
<li>Miyazaki, K., Takaku, H., Umeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+growth+inhibition+of+human+tumor+cells+in+culture+by+arginine+deiminase+purified+from+a+culture+medium+of+a+Mycoplasma-infected+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Potent growth inhibition of human tumor cells in culture by arginine deiminase purified from a culture medium of a Mycoplasma-infected cell line.</a> Cancer Res. 50, 4522-4527 (1990).</li>
<li>Takaku, H., Matsumoto, M., Misawa, S., Miyazaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-tumor+activity+of+arginine+deiminase+from+Mycoplasma+argini+and+its+growth-inhibitory+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn.+J.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Anti-tumor activity of arginine deiminase from Mycoplasma argini and its growth-inhibitory mechanism.</a> Jpn. J. Cancer Res. 86, 840-846 (1995).</li>
<li>Levine, B., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+by+self-digestion%3A+molecular+mechanisms+and+biological+functions+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy.</a> Dev. Cell. 6, 463-477 (2004).</li>
<li>Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451, 1069-1075 (2008).</li>
<li>Kabeya, Y., Mizushima, N., Ueno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC3%2C+a+mammalian+homologue+of+yeast+Apg8p%2C+is+localized+in+autophagosome+membranes+after+processing%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing.</a> EMBO J. 19, 5720-5728 (2000).</li>
<li>Pattingre, S., Espert, L., Biard-Piechaczyk, M., Codogno, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+macroautophagy+by+mTOR+and+Beclin+1+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Regulation of macroautophagy by mTOR and Beclin 1 complexes.</a> Biochimie. 90, 313-323 (2008).</li>
<li>Maiuri, M. C., Criollo, A., Tasdemir, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BH3-only+proteins+and+BH3mimetics+induce+autophagy+by+competitively+disrupting+the+interaction+between+Beclin+1+and+Bcl-2%2FBcl-X%28L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">BH3-only proteins and BH3mimetics induce autophagy by competitively disrupting the interaction between Beclin 1 and Bcl-2/Bcl-X(L).</a> Autophagy. 3, 374-376 (2007).</li>
<li>Crighton, D., Wilkinson, S., O'Prey, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DRAM%2C+a+p53-induced+modulator+of+autophagy%2C+is+critical+for+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DRAM, a p53-induced modulator of autophagy, is critical for apoptosis.</a> Cell. 126, 121-134 (2008).</li>
<li>Dillon, B. J., Prieto, V. G., Curley, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+and+distribution+of+argininosuccinate+synthetase+deficiency+in+human+cancers%3A+a+method+for+identifying+cancers+sensitive+to+arginine+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Incidence and distribution of argininosuccinate synthetase deficiency in human cancers: a method for identifying cancers sensitive to arginine deprivation.</a> Cancer. 100, 826-833 (2004).</li>
<li>Dale, B. M., McNerney, G. P., Thompson, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+transfer+of+HIV-1+via+virological+synapses+leads+to+endosomal+virion+maturation+that+activates+viral+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion.</a> Cell Host & Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).</li>
<li>Cogger, V. C., McNerney, G. P., Nyunt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structured+illumination+microscopy+of+liver+sinusoidal+endothelial+cell+fenestrations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations.</a> J. Struct. Biol. 171 (3), 382-388 (2010).</li>
<li>York, A. G., Parekh, S. H., Nogare, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+doubling+in+live%2C+multicellular+organisms+via+multifocal+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy.</a> Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198, 82-87 (2000).</li>
<li>Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustaffson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+3D+microscopy+of+live+whole+cells+using+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Method%22%5BJournal%5D)">Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination.</a> Nat. Method. 8 (12), 1044-1046 (2011).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

尽管使用针对LC3的荧光探针标记细胞并进行直接观察已被广泛接受为确认自噬反应的标准方法6，但对同一系统进行定量三维成像（正如我们所做的）能够提供前所未有的信息和细节，揭示细胞自噬过程的复杂性。特别是我们观察到，在自噬诱导后的80分钟内，活细胞中会形成数百个（甚至可能数千个）自噬体。同样，我们还观察到在自噬诱导过程中溶酶体区室分布发生了非常有趣的形态学变化。在单个细胞内，随着时间推移，自噬体数量减少，同时其平均尺寸相应增大，这表明自噬体通过彼此融合而增大体积，随后再与溶酶体融合形成自溶体。对活细胞进行高分辨率三维荧光成像使我们能够探究：自噬体是否必须达到某一临界尺寸才能与溶酶体融合，或者自噬过程是否也可在较小的物理尺寸下直接进行。事实上，考虑到在自噬早期激活阶段出现的大量极小自噬体，其尺寸仅接近去卷积显微镜的分辨极限，而在OMX结构光照明显微镜13上则能更清晰地分辨，很可能大部分自噬活动实际上正是在这一尺度上发生的。
在自噬过程中监测活细胞的能力至关重要，因为在特定细胞中自噬体的数量和大小变化可能较小，而不同细胞间这些参数的差异却相对较大...

<table><tbody><tr><td>精氨酸脱亚氨酶（ADI）</td><td>DesigneRx</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>酪蛋白</td><td>Sigma</td><td>C5890</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Fisher</td><td>4042</td><td></td></tr><tr><td>皂苷</td><td>Sigma</td><td>S4521</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 抗小鼠 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21422</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 抗兔 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21244</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Red DND-99</td><td>Invitrogen</td><td>L7528</td><td></td></tr><tr><td>抗-Lamp1</td><td>DSHB</td><td>H4A3</td><td></td></tr><tr><td>抗-Cadherin</td><td>Cell Signaling</td><td>#3195</td><td></td></tr><tr><td>SlowFade Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S36936</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 聚-D-赖氨酸包被的玻璃底培养皿</td><td>MatTek</td><td>P35GC-1.5-1.4-C</td><td></td></tr><tr><td>No.1, 22 mm 盖玻片</td><td>Corning</td><td>#2865-22</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Globe Scientific</td><td>1324G</td><td></td></tr></tbody></table>

利用先进的三维荧光显微镜对自噬进行定量分析

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

前列腺癌是美国男性中最常见的恶性肿瘤。尽管手术治疗存在导致阳痿和尿失禁的重大风险，传统的化学治疗手段也大多未能取得显著疗效。激素治疗在早期阶段有效，但随着激素难治性肿瘤的出现，往往最终失败。我们一直致力于开发针对肿瘤细胞特定代谢缺陷的治疗策略。我们近期发现，前列腺肿瘤细胞特异性缺乏一种参与氨基酸精氨酸合成的酶——精氨琥珀酸合成酶（argininosuccinate synthase，简称 ASS）1。这一缺陷使肿瘤细胞依赖外源性精氨酸，当精氨酸脱亚胺酶（ADI）耗尽游离精氨酸时，细胞将经历代谢应激1,10。事实上，我们已证实人类前列腺癌细胞 CWR22Rv1 在 ADI 作用下可通过非胱天蛋白酶依赖性凋亡以及强烈的自噬（或称巨自噬）被有效杀灭1,2,3。自噬是一种在进化上保守的过程，可使细胞在营养缺乏期间通过溶酶体降解代谢不需要的蛋白质4,5。尽管该通路的关键组分已被充分表征6,7,8,9，其分子机制的许多方面仍不明确——特别是，自噬在 ADI 治疗后前列腺癌细胞死亡反应中扮演何种角色？为回答这一问题，我们需要一种实验方法来定量检测细胞中自噬反应的程度和范围；由于目前尚无已知的分子标志物能够准确追踪这一过程，我们选择建立一种基于成像的方法，采用定量三维荧光显微镜技术11,12。
利用特异性标记了自噬体和溶酶体荧光探针的CWR22Rv1细胞，我们证明了通过宽场去卷积显微镜（后续还使用了超分辨率结构光照明显微镜）获取的三维图像堆栈能够清晰地捕捉自噬诱导的早期阶段。借助 commercially available 数字图像分析软件，我们可以轻松获得任意成像细胞中自噬体和溶酶体的数量、大小、分布及其共定位程度的统计信息。这些信息使我们能够精确追踪活细胞中自噬的进程，并推动我们进一步研究自噬在癌症化疗中的作用。

所示图像序列 图1 展示了CWR22细胞在自噬诱导前80分钟内发生的物理变化。在此研究及其他未展示的研究中，我们 consistently 观察到：（1）细胞核从细胞中心位置发生位移；（2）黏着斑数量减少；（3）自噬体和溶酶体整体向细胞中心区域转运。此外，我们还观察到在较晚时间点，自噬体（绿色）与溶酶体（红色）之间的共定位（以黄色表示）有轻微增加。
为了演示基于图像的细胞计数技术，我们使用了 VoloCITY 数字成像应用套件（版本 6.0，Improvision/Perkin-Elmer）来识别、计数并统计 图1 所示 CWR22 细胞图像中标记的自噬体和溶酶体，并收集相关统计数据。如 图2 中的图表所示，自噬体在初始形成并出现后，其数量和大小随时间发生变化：在诱导自噬 80 分钟后，自噬体的数量逐渐但总体呈下降趋势（图2A），同时其平均尺寸相应增加（图2B）。此外，根据皮尔逊相关系数分析，自噬体与溶酶体之间的共...

自噬是一种普遍存在的过程，使细胞能够降解并回收蛋白质和细胞器。我们采用先进的荧光显微技术，对自噬诱导过程中发生的微小但关键的物理变化进行可视化和定量分析，包括自噬体和溶酶体的形成与分布，以及它们融合形成自噬溶酶体的过程。

前列腺癌是美国男性中最常见的恶性肿瘤。尽管手术治疗存在较高的阳痿和尿失禁风险，……

本实验的总体目标是获取经处理的前列腺肿瘤细胞的定量图像，以测量不同时间点自噬的程度和范围。首先，使用精氨酸、酶或其他实验试剂处理细胞，以诱导自噬和/或细胞死亡。第二步是确定对活细胞或固定细胞进行成像，并相应地准备样品。接下来，使用宽场、去卷积或结构照明显微镜技术，获取活细胞或固定细胞的三维荧光图像。最后一步是收集关于自噬体大小分布及其与其他细胞内结构共定位的统计学数据。通过使用数字三维图像分析软件，该方法不仅能够获得精氨酸酶诱导自噬导致前列腺肿瘤细胞死亡的结果，还能显示这些细胞发生的结构改变，其形态学特征明显区别于凋亡和坏死相关的改变。该技术相较于其他现有方法的主要优势在于，定量三维成像能够显示特定分子事件在活细胞内的发生时间和位置，并以三维形式呈现。首先，按照文本方案所述，在35毫米多聚赖氨酸包被的玻璃底培养皿中培养表达绿色荧光蛋白（GFP）融合轻链3（LC3）的人前列腺癌细胞。细胞接种密度应足够高以促进快速增殖，但不可过高，以免成像时细胞过度生长并聚集成团。在成像前约一小时，用含精氨酸酶或DI的PBS处理选定的细胞样本，以耗尽细胞内的游离精氨酸，从而诱导癌细胞产生代谢应激。将1.5 µL LysoTracker Red溶于20 mL含有10% FPS和1%抗生素的RPMI培养基中并混匀。在将所有培养基预热至37°C后，为经DI处理的选定样本制备相应的溶液。向每个培养皿中加入适量的培养基，在成像前约30分钟，于37摄氏度条件下用含有LYO Tracker Red的RPMI培养基孵育细胞15至45分钟。打开气象站环境培养箱，使其平衡至37摄氏度和5%二氧化碳环境，用PBS洗涤细胞，并将培养基更换为仅含10%FBS和1%抗生素的标准RPMI培养基。根据需要向样品中加入DI。将35毫米盖玻片底培养皿安装至定制适配器中。在60倍DX放大、数值孔径为1.42的物镜上使用浸油，并将安装好的培养皿置于显微镜载物台上。本视频中，采用Delta Vision Personal DV显微系统及其应用定位、去卷积显微镜和Associated Soft Works软件套件演示三维显微成像技术。首先，开启显微镜系统，包括采集工作站和仪器控制器。打开 Resolve 3D 计算机控制应用程序，以初始化显微镜载物台并启动氙灯光源。等待 10 分钟，使光源预热并达到稳定状态。在6倍DX物镜（数值孔径1.42）上滴加一滴浸油，使用明场或外部照明以及粗调焦旋钮，将带有盖玻片的载玻片标本翻转朝下对准物镜中心。缓慢调节旋钮，使物镜上升，直至浸油与倒置的盖玻片接触。此后，通过微调焦旋钮旋转几圈，即可使细胞层进入焦点。处理载玻片上的固定样品时，建议避开气泡内部或附近的细胞区域。使用玻璃底培养皿观察活细胞样品时，应避免将物镜移出玻璃盖片边界之外。选择所需的视野区域。理想情况下，细胞应在所有相应的通道中表现出良好的荧光信号，并且在盖玻片表面充分贴附和铺展，以便于观察细胞内成分。可通过计算机使用采集3D界面来控制X、Y和Z轴方向的微小对焦调整。根据所需视野，将分 bin 设为1×1或2×2，以获取细胞中段的图像；设置曝光参数，使最大像素强度不超过3000计数。通常应将透光率设置为尽可能低，同时不增加相应的曝光时间，曝光时间应超过一秒。对每种需要成像的荧光颜色以及每个不同的视野均需重复此操作步骤。为了获得最高质量的图像，应通过调整焦距，使Z轴上限和下限分别略微超过细胞样本的顶部和底部。因此，特定Z轴层叠图像的总层数将由这些限值以及各层之间的间距决定。为在图像采集过程中尽量减少运动伪影，可将图像采集模式设置为按波长采集。然后对固定样品进行ZS层扫描，对活体样品则先进行ZS层扫描再进行波长扫描。所有参数设置完成后，即可采集荧光图像。随后使用SoftWorks软件对荧光图像进行去卷积处理，并利用Velocity软件进行后续分析。此处显示的图像序列展示了在自噬诱导的前80分钟内，cwr 22细胞中发生的物理变化。在这些图像中，白色虚线代表细胞的轮廓，浅色阴影区域代表细胞核的位置。在80分钟的过程中，图像显示细胞核从细胞中心发生位移，黏着斑点减少，常染色体和溶酶体总体向细胞中心移动，在后期时间点分别以绿色和红色显示。在常染色体与溶酶体之间也观察到共定位略有增加，表现为黄色区域。随后使用 velocity 数字成像应用套件对 CWR 22 细胞图像中标记的常染色体和溶酶体进行识别、计数并收集统计学数据。此处显示的是常染色体在初始形成并出现后，其数量和大小随时间而变化的情况。经过80分钟的自噬诱导后，自体染色体的数量逐渐减少，同时其平均尺寸相应增加。此外，根据皮尔逊相关系数分析，自体染色体与溶酶体的共定位显著增加。这些结果共同表明，在自噬被激活后，大量较小的自体染色体会随时间融合形成更大的自体染色体。此处展示的是在DV模式下采集和重建的图像、模拟的宽场去卷积图像与结构照明显微成像模式之间的并列比较。使用OMX显微镜，横向分辨率提高至最高120纳米，达到传统衍射极限显微镜分辨率的两倍。通过超分辨率显微技术，常染色体与溶酶体之间的微小共定位清晰可见，而在传统荧光成像中则几乎无法分辨。使用去卷积显微镜的一个优势在于，可将所有图像重建为三维模型，从而揭示不同分子之间更精确的空间信息。图中展示的是Cwr 22 RV1细胞在较晚时间点发生自噬的整体图像，此时自噬体与溶酶体之间开始出现大量共定位现象。本视频中以白色显示的连续染色信号，揭示了目标细胞的轮廓。三维重建模型提供了有关常染色体与溶酶体融合的更多空间细节。如黄色所示，绿色轻链三信号与红色溶酶体信号之间的相互作用在合并信号产生黄色时尤为明显。因此，该方法将解决研究人员在自噬研究中的两个主要挑战。首先，我们希望利用微流控液体和灌注腔室，在显微镜载物台上维持细胞原本的生理状态，从而营造一个无应激的环境。第二个挑战是收集具有统计学意义的定量图像数据；对于固定细胞，我们通常需要从大量不同的细胞中获取图像，并将其整合为有用的信息。然而，对于活细胞，则是通过长时间追踪单个细胞来获得等效信息。因此，我们认为该技术将使其他研究人员能够研究自噬在不同器官和不同疾病中的功能与作用。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

采用先进的3D荧光显微镜定量分析自噬

本文描述了一种用于监测细胞器向酵母液泡酸性腔内递送以进行降解和回收的稳健方法。该方法依赖于利用基因编码的双发射荧光pH生物传感器对目标细胞器进行特异性标记，并通过荧光显微镜观察单个细胞。...

一种用于监测酵母Saccharomyces cerevisiae中线粒体自噬的荧光显微镜检测方法

在本视频中，我们展示了基于精氨酸脱亚氨酶的自噬诱导在前列腺癌细胞中的应用。此外，可利用先进的荧光显微镜技术观察自噬诱导相关的细胞变化，包括自噬体和溶酶体的形成、分布及其融合为自噬溶酶体的过程。...

基于 ADI 的前列腺癌细胞自噬诱导：一种用于检测细胞自噬反应的酶学技术

通过荧光标记的自噬标志物进行延时显微成像，可实现对动态自噬反应的高时间分辨率监测。结合三种不同颜色的特异性自噬和细胞器标志物，我们能够在稳定的空间和时间背景下追踪某蛋白质在自噬体形成过程中的作用。...

活细胞成像观察早期自噬事件：omegasome 及其相关过程

一种研究自噬的便捷而强大的方法 Penicillium chrysogenum...

自噬分析 Penicillium chrysogenum 通过使用饥饿垫结合荧光显微镜技术

本研究采用多光谱成像流式细胞术，结合分析功能，对3种自噬标志物的明场细节图像进行比较，并定量分析其共定位情况，同时进行LC3斑点计数，从而以客观、定量且具有统计学稳健性的方式检测自噬水平。...

利用多光谱成像流式细胞术通过检测LC3、p62和LAMP1共定位评估自噬流

我们开发了一种简单且可适应的工作流程，用于从基于荧光成像的细胞生物学研究中提取定量数据，以分析神经退行性 Drosophila...

神经退行性变的定量细胞生物学研究 果蝇 使用 ImageJ 对荧光标记蛋白进行无偏分析

我们描述了通过自噬和蛋白酶体在小鼠肝脏中测量蛋白质分解代谢生物节律的实验方案。...

测量自噬和蛋白酶体流的昼夜节律

本实验方案的目的是通过LC3免疫荧光染色及LC3点状结构定量分析，检测胰腺癌细胞和胰腺腺泡细胞中的自噬水平。...

利用LC3免疫荧光评估两种不同胰腺细胞模型中的自噬水平

本文介绍了一种基于内源性荧光标记的优化切片上相关光镜-电镜联用技术方案，用于研究稀有蛋白质相对于细胞超微结构的定位。该方法的优势通过在未使用巴佛洛霉素处理的饥饿细胞中实现内源性LC3蛋白的超微结构定位得以展示。...

通过切片上相关联的光学-电子显微镜对内源性LC3进行超微结构定位

本文介绍了通过免疫印迹法简洁评估细胞外囊泡（EVs）中自噬体标志物LC3-II水平的方法。对EVs中LC3-II水平、自噬溶酶体形成以及omegasome形成的分析表明，当自噬体与溶酶体融合受阻时，STX6在释放LC3-II阳性EVs中具有新的作用。...

通过细胞外囊泡评估LC3-II的释放及其与细胞内LC3阳性囊泡积聚的关系

学习使用先进3D荧光显微镜定量分析前列腺肿瘤细胞中的自噬过程。该方法通过可视化自噬体和溶酶体动态，帮助研究人员测量自噬程度并区分细胞死亡形态特征。

利用先进的三维荧光显微镜对自噬进行定量分析

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