采用先进的3D荧光显微镜定量分析自噬

该程序的总体目标是获得处理过的前列腺肿瘤细胞的定量图像，以测量不同时间点自噬的程度和程度。这是通过首先用精氨酸、dase 或其他实验试剂处理细胞以诱导自噬和/或细胞死亡来实现的。第二步是决定是活细胞成像还是固定细胞，并相应地制备样品。

接下来，使用宽场、反卷积或结构照明荧光显微镜获得活细胞或固定细胞的 3D 荧光图像。最后一步是收集有关自噬体大小分布和与其他细胞内结构共定位的统计数据。使用数字 3D 图像分析软件，这种方法可以获得结果，显示精氨酸 dase 诱导的自噬细胞不仅会导致前列腺肿瘤细胞死亡，而且这些细胞表现出的结构变化在形态上与细胞凋亡和坏死相关的变化不同。

与目前存在的其他方法相比，该技术的主要优点是定量 3D 成像可以显示活细胞内发生的特定分子事件的时间和位置，然后以 3D 格式呈现它 为了开始生长表达绿色荧光蛋白的人前列腺癌细胞，应按照文本方案中的说明，将三对 35 毫米聚乙烯 de lycine 涂层玻璃底培养皿耦合轻链以足够的密度促进快速增殖，但又不能太大以至于细胞在成像时过度生长和聚集。在成像前大约一小时，用 PBS 中的精氨酸 dase 或 DI 处理选定的细胞样品，以消耗细胞中的游离精氨酸并诱导癌细胞中的代谢应激，用 20 毫升含有 10%FPS 和 1% 抗生素的 RPMI 稀释 1.5 微升 Lyo 追踪器红。用 DI 为选定的样品制备溶液，这些样品是在将所有培养基加热至 37 摄氏度后处理的。

向每个培养皿中加入适当的培养基，将细胞与含有 LYO Tracker red 的 RPMI 一起在 37 摄氏度下孵育 15 至 45 分钟，大约在成像前 30 分钟。打开气象站环境围栏，让平衡至 37 摄氏度和 5% 二氧化碳，用 PBS 洗涤细胞，并用仅含 10% FBS 和 1% 抗生素的标准 RPMI 替换培养基。如图所示，将 DI 添加到样品中。

将 35 毫米盖玻片底培养皿安装在定制的适配器中。在六个 DX 放大倍率、1.42 数值孔径物镜上使用浸油，并将安装的培养皿放在显微镜载物台上。在本视频中，演示了使用 Delta vision 个人 IDV 应用位置、反卷积显微镜和 Associated Soft Works 应用程序套件进行 3D 显微镜检查。

首先打开显微镜系统，包括采集工作站和仪器控制器。打开 resolve 3D 计算机控制应用程序以初始化显微镜载物台并打开氙气光源。等待 10 分钟，让光源预热并达到稳定的条件。

在六个 DX 放大倍率、1.42 数值孔径物镜上加入一滴浸油，并使用明场或外部照明以及粗焦将载玻片标本面朝下置于物镜的中心。调节旋钮慢慢抬起物镜，直到浸油的跳动接触到倒置的盖玻片。从这一点开始，单元格层应在微调焦距调节旋钮的几圈内成为焦点。

载玻片上处理固定样品时，建议避免任何有气泡的区域内或附近有细胞。在玻璃底培养皿上观察活体样品时，请避免将物镜移动到玻璃盖玻片边界之外。选择所需的视野。

理想情况下，细胞应在所有适当的通道中表现出良好的荧光信号，并充分附着和分布在盖玻片表面上，以便细胞内内容物易于观察。横向 X、Y 和 Z 焦距的微小调整可由计算机使用采集 3D 界面进行控制。根据给定图像通过单元格中段的所需视野，将 benning 设置为 1 by one 或 2 x 2，设置曝光参数，使最大像素强度不超过 3000 个计数。

通常，透射百分比应设置得尽可能低，而不会增加相应的曝光。时间超过 1 秒。对要成像的每种荧光颜色和每个单独的视场重复此过程。

为了获得最高质量的图像，请分别通过调整细胞样品顶部和底部的焦点来设置 Zack 的上限和下限。因此，给定 Z 堆栈中的图像总数将由这些限制和层之间的间距决定。为了最大限度地减少图像采集过程中的运动伪影，可以将图像采集模式设置为波长。

然后是固定样品的 ZS 堆栈，然后是 ZS 堆栈，然后是活样品的波长。设置完所有参数后，即可获取荧光图像。然后使用软作品下放荧光图像，然后使用速度进行分析。

此处显示的图像序列显示了 cwr 22 细胞在自噬诱导的前 80 分钟内发生的物理变化。在这些图像中，白色虚线代表细胞的轮廓，浅色阴影区域代表细胞核的位置。在 80 分钟的过程中，图像揭示了细胞核从细胞中心移位、粘附焦点减少以及常染色体和溶酶体向细胞中心的一般易位，在稍后的时间点分别以绿色和红色显示。

黄色所示，常染色体和溶酶体之间的共定位也略有增加。然后使用 speed Digital 成像应用程序套件来识别、计数和收集 CWR 22 细胞图像中标记的常染色体和溶酶体的统计数据。此处显示的常染色体在最初形成后的数量和大小确实会随时间变化。

噬诱导 80 分钟后，常染色体数量逐渐减少，常染色体的平均大小相应增加。此外，根据 Pearson 的相关系数分析，常染色体和溶酶体的共定位有明显的增加。总之，这些发现表明，在刺激自噬后，随着时间的推移，许多小常染色体会形成较大的常染色体。

这里显示的是在 DV 模式下采集和重建的图像的并排比较，模拟宽场反卷积与结构照明模式。使用 OMX 显微镜，横向分辨率提高到高达 120 纳米，是传统衍射极限显微镜分辨率的两倍。常染色体和溶酶体的小规模共定位在超分辨率显微镜下清晰可见，而在常规荧光成像中几乎不明显。

使用反卷积显微镜的优势之一是将所有图像重建为 3D 模型，从而揭示不同分子之间更准确的空间信息。此处显示的是 Cwr 22 RV 单细胞在稍后时间点发生自噬的整体图片，此时常染色体和溶酶体之间开始发生大量共定位。以白色表示的 e 相干染色揭示了该电影中靶细胞的轮廓。

3D 重建模型提供了常染色体和溶酶体之间融合的更多空间细节。如黄色所示，绿色轻链 3 信号和红色溶酶体信号之间的相互作用在合并信号产生黄色的情况下很明显。因此，这种方法将解决研究自噬研究人员面临的两个主要挑战。

首先，我们希望通过使用微流体（即 profusion 室）来维持其在显微镜载物台上的原始生理状态，从而保持无压力的环境。第二个挑战是收集统计相关的定量图像数据，对于固定细胞，我们通常从不同的细胞中获取大量图像并将它们编译成有用的信息。然而，对于生命细胞，我们只随时间跟随一个细胞来获取等效信息。

因此，我们相信这项技术将使其他研究人员能够研究自噬在不同器官和不同疾病中的功能和作用。