体外和体内检测人类细胞中的 Mitophagy,线虫和小鼠

这些实验的总体目标是评估人类细胞、秀丽隐杆线虫和小鼠的线粒体自噬水平。线粒体自噬已成为神经退化、代谢疾病和衰老十字路口的一个非常重要的概念，深入了解此处介绍的方法和未来使用这些方法可能有助于在这一重要领域取得进展。该技术的主要优点是它以稳健有效的方式检测线粒体自噬，并能够在体外和体内检测线粒体自噬。

这里介绍的这项技术将帮助研究人员开发新的见解并开发针对神经生成性疾病的治疗策略，包括我们知道存在线粒体功能障碍的阿尔茨海默病和帕金森病。除了提供对线粒体自噬分子机制的见解外，这些方法还可能通过筛选线粒体诱导剂来发现新的候选药物。这些方法的视觉演示至关重要，因为线粒体自噬水平对秀丽隐杆线虫和小鼠实验条件的变化非常敏感。

将 300， 000 至 100 万个细胞接种在 35 毫米玻璃底微孔培养皿中，10 毫米微孔，使细胞在第二天达到 70% 汇合。将细胞保存在完全细胞培养基中，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的培养箱中孵育。第二天，根据制造商的方案，用 150 μL 无血清培养基稀释 15 μL DNA 转染试剂。

此外，用 150 μL 无血清培养基稀释 2 至 5 μg mito-Keima 质粒 DNA。将稀释的 mito-Keima 质粒添加到稀释的 DNA 转染试剂中，涡旋混合物 10 秒。然后将混合物在室温下孵育 10 分钟。

接下来，将 DNA 转染试剂混合物逐滴加入细胞中，轻轻摇动板 5 至 10 秒以混合溶液。此时，将细胞放回培养箱中并孵育 24 小时。第二天，将培养基更换为新鲜的完全细胞培养基，然后将转染的细胞再孵育 24 小时。

使用共聚焦显微镜对转染的细胞进行成像。在 40 倍放大倍率下随机对 20 个区域进行成像，以便记录每个孔中总共 100 至 200 个细胞。第一天，在体壁肌肉细胞中挑选表达 DCT-1 GFP 和 DSRed LGG-1 的转基因动物的 L4 幼虫，并将它们放在 OP50 接种的线虫生长培养基板上。

使用至少 3 块板将 5 到 10 条蠕虫放在每个 3.5 厘米的板上。完成后，在 20 摄氏度下孵育线虫。接下来，在第 5 天，通过选择 15 至 20 只 L4 转基因幼虫并将它们转移到新鲜的 OP50 接种板上来同步线虫。

每个实验条件至少使用五个板。第 7 天，准备一些用于影响目标药物的线粒体自噬的载体板，一些用作阳性对照。接下来，将大肠杆菌接种板以每平方厘米 222 微瓦的强度暴露在紫外线下 15 分钟，以确保接种板上的线粒体自噬诱导化合物不会被细菌代谢。

现在，将 10 微升的目标化合物添加到种子板的顶部，并向载体板中加入等量的化合物载体作为阴性对照。对于线粒体自噬诱导的阳性对照，添加线粒体毒物百草枯。轻轻旋转板，直到溶液覆盖整个表面，并在室温下关闭盖子让板干燥至少 1 小时。

干燥后，将 10 至 20 只 2 日龄的成年转基因动物转移到平板中。将它们在 20 摄氏度下孵育两天。第 9 天，准备 2% 琼脂糖垫，并在 M9 中加入一滴 20 毫摩尔左旋咪唑。

通过将转基因动物置于 M9 左旋咪唑滴中来固定它们以进行成像。然后，轻轻地将盖玻片放在液滴的顶部。将样品放在共聚焦显微镜载物台上，通过在 63 倍放大倍率下拍摄 Z 堆栈图像对单体壁肌肉细胞进行成像。

将新鲜的分离的 mito-Keima 小鼠肝脏放在冰上的冷却金属板上，以快速冷却组织。在尽快处理组织时将其留在那里，因为来自 mito-Keima 蛋白的信号在冰上保持稳定长达一小时。接下来，使用一对弯曲的镊子提起肝脏样本，并用 5 毫升冰冷的 PBS 冲洗。

最后，使用具有两个连续激发的共聚焦显微镜对组织切片进行成像。使用此处介绍的程序，用 mito-Keima 质粒转染人 HeLa 细胞。健康细胞表现出组织良好的线粒体网络，线粒体自噬的发生率低。

然而，用线粒体解偶联剂 FCCP 预处理的细胞表现出线粒体自噬发生率的显著增加。还使用 LAMP2 和 COXII 的共定位测量线粒体自噬。为了在体内检测秀丽隐杆线虫中的线粒体自噬，用 8 毫摩尔的百草枯处理在体壁肌肉细胞中表达 MT rosella 的转基因线虫。

研究发现，在用百草枯处理的线虫中，由 pH 敏感荧光比降低所指示的线粒体自噬诱导水平显著降低。此外，DCT-1 融合 GPF 和 DSRed 融合 LGG-1 之间共定位事件的数量增加，表明氧化应激响应线粒体自噬刺激。最后，这些图像代表了来自 mito-Keima 小鼠肝脏和小脑的 mito-Keima 信号。

组织需要保持低温并尽快成像，但如果准备得当，可用于深入了解正常和病理生理条件下的线粒体自噬。该技术的使用为神经退行性和线粒体生物学广泛领域的研究人员铺平了道路，以探索不同模型系统中的线粒体功能，包括培养细胞、蠕虫或秀丽隐杆线虫和小鼠模型。观看此视频后，您应该掌握了用于定量评估秀丽隐杆线虫和小鼠线粒体自噬水平的多种方法。