天然细胞中的功能性定点荧光测定法，用于研究骨骼肌兴奋性

功能性定点荧光测定法是一种实时研究蛋白质结构域运动的方法。该技术在天然细胞中的应用修改现在允许检测和跟踪来自小鼠分离骨骼肌纤维中电压门控Ca²⁺ 通道的单电压传感器运动。

CaV1.1是电压门控离子通道的成员，具有四个不同的电压传感器。有证据表明，一些电压传感器对Ryanodine受体激活或钙电流的贡献更大。我们的目标是能够识别每个电压传感器在激励-收缩耦合和钙通道激活中的精确作用。

自50年代初以来，人们一直在研究激发-收缩耦合，但该过程如何发生的分子细节仍然未知。通道的圆柱电子微观结构的最新进展，新型CaV1.1辅助蛋白的表征，通道替代剪接变体的发现以及致病突变的鉴定重新点燃了对该领域的兴趣。我们的领域使用了许多技术，从经典的电生理学和分子生物学到更新颖的技术，如冷冻电子显微镜、分子动力学模拟、靶向蛋白质降解和功能性定点荧光测定以及工程细胞或动物模型。

目前，这种燃料面临着几个实验挑战。在骨骼肌中，CaV1.1和RyR1之间的适当运输和通讯以及许多调节蛋白对于支持激发-收缩耦合至关重要。直接研究CaV1.1和RyR1之间这些蛋白质 - 蛋白质相互作用的方法缺失或不完整。

Martin Schneider博士的实验室几十年来一直致力于激励-收缩耦合，表征CaV1.1中的电压传感机制，钙释放和局部钙释放事件，称为钙火花。最近，我们的实验室一直在实施新的光学技术，以研究功能性成人肌肉细胞中激发 - 收缩耦合和电压传感器运动的各个步骤。虽然这以前已经在异源表达系统中完成，但我们的协议现在允许在其原生环境中传播动作电位期间跟踪CaV1.1电压传感器的构象变化。

我们的新技术将使我们能够研究激励-收缩耦合所需的电压传感器的精确运动。我们想知道每个S4中的哪些电荷残基对其功能至关重要，或者每个S4转位，并且所有易位都与CaV1.1开放或Ryanodine受体激活有关。