Name: 将呼吸同步嗅觉计与大脑模拟相结合，研究气味对皮质脊髓兴奋性和有效连接性的影响 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T13:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: 探索呼吸同步嗅觉计结合双线圈经颅磁刺激技术，研究愉悦与不愉悦气味如何调节皮质脊髓兴奋性和有效连接性。该方法为理解嗅觉-运动系统相互作用及精神疾病相关机制提供了新途径。

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本工作由法国基金会资助，项目编号 N&#176;：00123049/WB-2021-35902（J.B. 和 N.M. 获得的资助）。作者感谢Fondation Pierre Deniker的支持（C.N. 获得的资助）以及Neuro-Immersion平台工作人员在实验装置设计过程中提供的宝贵帮助。

以下各节所述的所有实验程序均已获得伦理委员会（CPP Ile de France VII，法国巴黎，方案编号 2022-A01967-36）批准，符合《赫尔辛基宣言》的规定。所有受试者在参与研究前均签署了书面知情同意书。
1. 受试者招募
<ol>
	<li>纳入/排除标准。
	<ol>
		<li>纳入成年（> 18 岁）受试者。根据国际专家指南23，对所有受试者筛查经颅磁刺激（TMS）的任何禁忌证。</li>
		<li>排除体内植入医疗设备（如人工耳蜗、心脏起搏器等）、有个人或家族癫痫史、头痛、脑外伤史或正在使用神经活性药物的受试者。根据欧洲嗅觉功能测试24判定为“失嗅”的受试者亦应排除。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>利手性：采用爱丁堡利手问卷25评估受试者是否为右利手。 
	&#8203;注意：在评估运动系统皮质脊髓兴奋性与有效连接性的研究中，强烈建议仅招募右利手受试者26,27。</li>
	<li>信息告知与知情同意：向所有受试者提供伦理委员会批准的研究目的、流程及潜在风险等基本信息，并要求其签署书面知情同意书。</li>
</ol>
2. 实验步骤
<ol>
	<li>受试者安置：让受试者坐在舒适的椅子（牙科椅类型）上，双手自然放松并呈旋前位。将受试者的头部置于下颌托架上，以在刺激过程中尽量减少头部移动。</li>
	<li>肌电图记录
	<ol>
		<li>在电极贴附区域，使用去角质磨砂膏轻轻摩擦以轻度磨损皮肤，再用酒精棉片清洁电极贴附部位。</li>
		<li>采用银/氯化银一次性记录电极，以腹肌-肌腱布局置于第一 dorsal 间骨肌（FDI）肌肉。将接地电极置于尺骨茎突处图1).</li>
		<li>使用导线将电极连接至放大器和数据采集系统。</li>
		<li>使用模数转换（AD）系统记录肌电（EMG）信号。通过带宽频率为10 Hz至1 kHz的滤波器对EMG信号进行放大和滤波（增益 = 1000）。以2,000 Hz的采样频率进行数字化，并将每个EMG文件存储以供离线分析。</li>
		<li>检查连接到数据采集系统的计算机屏幕上显示的信号质量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>TMS 线圈M1 位置。
	<ol>
		<li>将该线圈连接至A型刺激器（图1).</li>
		<li>在受试者头部戴上贴合的帽具。使用卷尺，根据标准颅骨解剖标志，测量鼻根-枕外隆凸、耳前切迹-耳前切迹以及头围。用笔标出矢状中线（鼻根-枕外隆凸线）与双耳间线（耳前切迹-耳前切迹线）相交处的头皮顶点位置28.</li>
		<li>将第一个小的8字形线圈（内径：40 mm） tangentially 置于头皮上，位于左侧M1区手部代表区的预定位置（线圈M1），位于头顶外侧5 cm处，手柄向后外侧方向 45&#176; 与中矢状线成一定角度，产生从后向前的电流流向（单相电流波形）。该方向对应于M1内最大感应电流的流动29.</li>
		<li>确保线圈的放置位置M1 符合最新的国际推荐标准，是最佳选择30首先，以最大刺激器输出（%MSO）的30%给予数个单脉冲刺激，检查刺激是否在肌电图系统中诱发出运动诱发电位（MEP），并在连接至数据采集系统的计算机屏幕上显示。
		<ol>
			<li>若无可见反应，则逐步增加刺激强度（以5% MSO为增量），直至观察到运动诱发电位（MEP）。随后，在首个位点周围选取四个位点，通过施加多个脉冲进行测试。分别测定每个位点的MEP峰-峰平均振幅。</li>
			<li>选择平均峰峰值MEP幅值最高的位置。该位置即为该受试者的运动热点位置。30. 标记线圈M1 确保线圈在整个实验过程中放置在帽具的指定位置。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>静息运动阈值（rMT）与经颅磁刺激强度
	<ol>
		<li>确定静息运动阈值（rMT），即经颅磁刺激强度达到可诱发运动诱发电位（MEP）概率为50%的水平23,30.
		<ol>
			<li>使用现有的在线免费软件（TMS Motor Threshold Assessment Tool，MTAT 2.1），该软件基于最大似然参数估计，采用序贯测试策略29刺激序列始终从37 %MSO的强度开始。</li>
			<li>让一名实验人员手持线圈M1 而另一个则指示MEP波幅是否 &#62; 0.05 mV。随后，预测算法确定下一次给予的刺激强度，并在完成20次刺激后停止，根据先前的研究，此过程已足以准确估算静息运动阈值（rMT）。31-34.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>设置条件刺激和测试脉冲刺激的%MSO。使用先前确定的受试者rMT值。 
		注意：此处，第一次条件刺激的强度（线圈DLPFC设定为静息运动阈值（rMT）的110%19,20. 测试刺激的强度（线圈M1设定为rMT的120%，该强度与先前研究略有不同，此前研究采用的TS强度是在所有受试者中诱发约1 mV MEP的刺激强度19,20 该固定的峰-峰值强度由于运动输出存在较大的个体间差异，在输入-输出募集曲线上出现在非常不同的位置35因此，可以在个体间使用120% RMT强度来优化刺激强度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>TMS 线圈DLPFC 定位
	<ol>
		<li>将此线圈连接至B刺激器（图1).</li>
		<li>使用最近更新的头皮定位启发法来确定对应于左侧背外侧前额叶皮层（DLPFC）的头皮区域36,37 估算第二个“8”字形线圈（内径：40 mm）在DLPFC上的位置（线圈DLPFC）。下载在线 Excel 电子表格计算工具36 输入鼻根点-枕外隆凸距离、耳前点-耳前点距离以及头围（单位：厘米）。报告 XLA 和 Y洛杉矶 直接在受试者头部测量距离。</li>
		<li>将线圈平行于头皮放置DLPFC 位于假定的左侧DLPFC位置，手柄朝下并向外侧倾斜-45&#176; 中矢状线的夹角。标记线圈DLPFC 将线圈准确放置在帽具上，以确保整个实验过程中线圈位置的正确性。 
		注意：本头皮定位法适用于线圈的定位M1 和线圈DLPFC 定位效果并不理想。事实上，已知其准确性低于基于个体T1解剖磁共振成像（MRI）来定位目标脑区所使用的神经导航方法。38.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>调节条件脉冲与测试脉冲之间的时间间隔：在脉冲发生器设备上将此间隔设置为 10 ms。 
	注意：此处的延迟时间固定为10 ms，依据先前研究结果，该时间间隔下左侧DLPFC对左侧M1具有抑制性影响19,20. 在10 ms时观察到的这种抑制效应可能是由于DLPFC投射至pre-SMA从而激活了基底神经节，进而对M1产生间接影响39延迟可根据用户需求在代码中进行调整。例如，可采用较长的刺激间间隔（即 25 ms）来研究连接 DLPFC 与 M1 的多突触间接皮质-皮质下-皮质环路19此外，通过在多个皮层区域之间应用双位点配对脉冲经颅磁刺激（ppTMS），时间间隔范围从1 ms到150 ms，已证实存在差异性的易化或抑制性影响。40,41因此，该时间间隔可调节的特性为未来研究提供了广泛的可能性。</li>
	<li>嗅觉仪设置
	<ol>
		<li>选择具有愉悦和不愉悦情感价值的气味物质。将各气味物质预先用矿物油单独稀释，以获得等强度的感知。 
		注意：此处气味物质的选择及其浓度（即乙酸异戊酯和丁酸分别稀释至0.6%和0.11% vol/vol浓度）基于本课题组先前使用相同嗅觉仪装置及气味物质的研究结果42,43一项初步研究证实，正性气味与负性气味在强度上无差异，但在愉悦度上相反。在对照条件（即无气味刺激）下，仅向受试者输送气流。</li>
		<li>编写程序以递送气味剂。对于每次试验，需设定试验的总持续时间、待递送的气味剂、气味控制器的流速（单位：毫升/分钟）、载气空气调节器的流速（单位：毫升/分钟）以及抽吸调节器的流速。 
		注意：气味刺激的呈现顺序可在正性、负性和无气味之间进行随机化。此处，每次试验持续12秒，气味呈现顺序采用伪随机化设计。此外，根据预实验结果，设定气味控制器的流速为200 mL/min，载气空气调节器的流速为500 mL/min，抽吸调节器的流速为100 mL/min。</li>
		<li>将鼻导管置于受试者鼻孔附近，以测量鼻部呼吸。指导受试者通过鼻子正常呼吸。</li>
		<li>打开便携式空气压缩机、嗅觉仪机箱以及安装有软件的计算机。检查所有电缆连接图1). 
		注意：本研究中使用的嗅觉仪已在先前发表的文章中进行了详细描述44 但在此处进行了修改，以允许在检测到吸气开始后以可变延迟触发经颅磁刺激（TMS）。简要而言，该设备由多个模块组成，包括：1）来自便携式空气压缩机的气源及空气处理系统；2）包含电子与气动装置的刺激系统；3）与递送系统耦合的自制混合头，用于将气味分子扩散至受试者鼻腔；4）呼吸传感系统，通过鼻导管测量鼻腔呼吸信号，从而触发嗅觉刺激装置；5）软件控制系统。44.</li>
		<li>校准：进入校准阶段（约20秒），用于校准受试者的呼吸信号，并调整呼气相和吸气相的检测阈值。在该软件中，呼气相为正，吸气相为负。</li>
		<li>气味愉悦度和强度评分：以随机顺序递送两种气味物质，要求受试者在视觉模拟量表上对每种气味物质的愉悦度和强度进行评分，量表范围为1 &#34;一点也不愉快&#34; 至 9 &#34;极其愉快&#34; 以及从1 &#34;完全不强烈&#34; 至 &#34;极其强烈。&#34;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>结合嗅觉仪与经颅磁刺激：将吸气相检测与触发经颅磁刺激之间的延迟设置为 600 ms。 
	注意：延迟时间的设置非常重要，需根据文献及使用者的具体需求来确定。在本实验方案中，延迟时间设定为 600 ms，该参数已被证明可实现气味的最大意识感知表征。45对于单脉冲TMS条件，该触发信号立即激活A刺激器，并通过置于左侧M1区的线圈传递一个脉冲，以诱发未受调节的MEP。对于双线圈TMS条件，该触发信号通过一个T型连接的两条同轴电缆发送至两个不同设备：第一个信号立即激活B刺激器，由置于左侧DLPFC的线圈传递一个调节脉冲；第二个信号被脉冲发生器接收，可在激活A刺激器前引入一个固定延迟，从而通过置于左侧M1区的线圈传递测试刺激，以诱发受调节的MEP。图1).</li>
</ol>
<img alt="图 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65714/65714fig01.jpg" /> 
图 1：实验装置示意图。 粗线表示气动连接。空气压缩机连接至嗅觉仪，以产生不同的气流。一个调节器控制压力，输入的气流被导向三个通道（通过三个质量流量控制器）：一个用于气流输送（蓝线），一个用于抽吸系统（棕线），以清洁并帮助控制刺激时间，最后一个用于气味物质44。两个U形管分别装有气味物质（绿色：愉悦气味；红色：不愉悦气味），在压力条件下使其处于饱和蒸汽状态，从而确保随时间推移具有稳定强度的加味气流。混合头用于混合洁净气流与加味气流。气流（加味或纯净）通过两个管子（灰色线）输送至鼻孔，管子连接至鼻导管，同时也用于记录鼻腔呼吸（紫色线）。根据呼吸信号，一旦检测到吸气相，在spTMS条件下，触发信号将发送至脉冲发生器设备，用于设定延迟（此处为10 ms），然后传送至连接至CoilM1的TMS刺激器A，该线圈置于左侧M1手部肌肉代表区，同时TMS刺激器B处于关闭状态。在dsTMS条件下，触发信号立即发送至连接至CoilDLPFC的TMS刺激器B，该线圈置于左侧DLPFC，同时使用脉冲发生器设备设定延迟（此处为10 ms），随后触发连接至CoilM1的TMS刺激器A。由EMG系统采集的呼吸信号和MEP振幅通过安装在PC上的软件进行记录。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65714/65714fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
3. 测量
<ol>
	<li>在嗅觉仪软件中运行定制的编码脚本（参见步骤 2.7.2），以随机顺序呈现 spTMS 和 dsTMS 与愉悦气味、不愉悦气味及无气味的所有组合。 
	&#8203;注意：本实验中，每种条件记录 20 次试验（共 120 次试验），实验分为 6 个区块，每个区块包含 20 次试验。可根据用户需求调整每种条件的试验次数。</li>
</ol>
4. 数据分析
<ol>
	<li>针对每位参与者、每种条件和每次试验，提取峰-峰MEP幅值。此步骤可借助在线提供的开源工具箱之一完成46,47。</li>
	<li>通过计算MEP比值对数据进行归一化处理，该比值表示在dsTMS试验中测试刺激诱发的MEP相对于spTMS试验中测试刺激诱发的MEP的大小12。对每位参与者以及每种气味条件（即无气味、正性气味和负性气味）分别进行此计算。完成该处理后，按以下方式解释结果：MEP比值大于1表明DLPFC对M1具有易化作用，而MEP比值小于1表明DLPFC对M1具有抑制作用。</li>
</ol>

Effect of Odor on Brain Excitability Assessed by a Breath-Synchronized Olfactometer

JB 是法国生物精神病学与神经精神药理学协会（AFPBN）脑刺激分会（STEP）以及欧洲脑刺激学会（ESBS）的董事会成员，并报告获得了来自加拿大卫生研究院（CIHR）、法国国家研究署（ANR）和法国医院临床研究计划（PHRC）的脑刺激领域学术研究资助。其他作者无任何利益冲突需要披露。

上述方案描述了一种新颖的方法，结合使用呼吸同步&#160;嗅觉仪与单线圈和双线圈经颅磁刺激（TMS），以研究根据气味剂的享乐价值所引起的皮质脊髓兴奋性及有效连接性的变化。该实验设置可客观区分特定受试者对某种气味剂的愉悦程度，从而反映该气味剂对大脑有效连接性和反应性的生物学影响。本方案中的关键步骤包括经颅磁刺激参数（线圈定位、刺激强度）和嗅觉仪参数（气味剂选择、与呼吸时相的相对时间控制）。
这种将spTMS和dsTMS与嗅觉仪结合的方法可根据用户需求进行多种调整，具有明显的方法学优势。如引言中所述，有两个方法学方面的因素对于深入探究嗅觉系统与运动系统之间相互作用的机制基础至关重要。第一点是在同一实验阶段内呈现不同气味条件（愉悦/不愉悦/无气味）的可能性。现在这一目标已可实现，因为&#160;可以在每一次试验中指定向受试者输送何种气味物质，并保持气味强度恒定。这一点至关重要，因为它使我们能够消除以往研究中观察到的在刺激区块内及区块间运动诱发电位（MEP）振幅存在的系统性个体内变化，即使在相对较长的刺激间间隔下也是如此48,49。
事实上，对M1施加TMS脉冲能够以无可争议的时间精确性量化皮质脊髓兴奋性的变化。然而，大量因素均可调节皮质脊髓兴奋性，这些因素需要尽可能加以控制。例如，单纯的自主吸气或呼气（一种运动行为）即可改变非呼吸性手指肌肉的皮质脊髓兴奋性50。
第二个优势是能够控制并同步多个与呼吸时相相关的因素，包括气味向受试者扩散的精确持续时间与时机，以及经颅磁刺激（TMS）脉冲的施加时机。更重要的是，这些不同参数可根据用户需求进行调整，为未来的研究提供了可能。
本文所提出的方法为嗅觉领域的广泛未来研究和更深层次的科学问题开辟了道路。首先，目前尚无研究探讨嗅觉刺激引起皮质脊髓兴奋性调节的时间精确性。这种调节是否发生得非常早（即在气味感知表征出现之前，据估计为气味呈现后300毫秒至500毫秒之间）45）或更晚阶段（即当气味表征扩展到与情绪、语义和记忆处理相关的大范围脑区时）45）？皮质脊髓兴奋性的变化时序是否取决于气味的享乐价值？不愉快的气味与疼痛类似，通常预示潜在危险，会引发更快的反应，以迅速回避或逃离负面情境51,52，因此相比愉悦气味能更早地调节皮质脊髓兴奋性。然而，这一观点仍属推测。通过在正性与负性气味呈现后的不同时间点施加经颅磁刺激脉冲，并比较皮质脊髓兴奋性的变化，本实验方案可探讨此问题。此外，尽管&#160;本方案的重点是通过靶向M1来调节皮质脊髓兴奋性，经颅磁刺激（TMS）技术因其具有高时间分辨率，也可用于探究嗅觉过程中其他脑区的因果性脑-行为关系及其时间动态。53同样，在本实验方案中，我们评估了DLPFC与M1之间的有效连接，因为已有文献表明，这种连接性在嗅觉感知过程中可能发生调节。然而，在嗅觉或运动控制过程中，其他皮质-皮质或皮质-皮质下-皮质网络也可能被调节，而这些网络内部的连接性可借助本新方法轻松评估。此时唯一需要调整的是将线圈定位至目标皮质区域。例如，已有研究显示眶额皮层参与气味愉悦度编码及气味感知54，最近一项双位点经颅磁刺激（TMS）研究表明，该区域在静息状态下对M1具有抑制性影响12探究在感知正性和负性气味期间，眶额皮层与M1之间有效连接性的变化，是深入理解嗅觉系统与运动系统相互作用机制的一个有趣研究方向。
此外，该方法提出了一种以非语言或无意识方式可靠评估气味愉悦感知的新途径。这可能为临床研究铺平道路，以深入理解嗅觉系统与运动系统之间异常相互作用的机制。例如，当前方法可用于患有神经精神疾病（如重度抑郁症（MDD））的患者，因为已有研究发现MDD与嗅觉功能改变相关，包括对气味的愉悦感知异常以及适应不良的趋近与回避行为55。此外，由于&#160;左侧DLPFC在MDD患者中表现出活动减低56，且DLPFC-M1连接性在趋近-回避行为过程中受到调节19，因此经颅磁刺激（TMS）与嗅觉仪的结合可能成为一种有前景的工具，用于揭示MDD患者中DLPFC与M1之间功能失调连接的神经生理学指标。随后，可将这些神经生理学发现与临床症状学相关联，例如抑郁严重程度或嗅觉快感缺失评分——后者定义为MDD患者中体验愉悦能力的下降57。最后，若通过本研究所述方法发现这些患者存在有效连接异常，并且该异常与临床症状相关，则可反复使用双位点TMS对DLPFC-M1连接性进行神经调控，从而改善临床症状，这一方案称为配对关联皮质-皮质刺激58,59。
尽管本方法和结果为未来研究嗅觉系统与运动系统之间相互作用的神经机制提供了概念验证，但仍需指出一些局限性和注意事项。首先，为了提高测量的可靠性和可重复性，所针对的脑区应精确定位于解剖和功能区域（这一点对于DLPFC靶点尤其重要）。其次，如上所述，并通过电场计算建模所证实，基于头皮定位的线圈放置方法相较于MRI引导存在不足60。为最大限度地提高经颅磁刺激（TMS）定位的准确性和精确性，应使用神经导航系统，该系统可将患者头部与结构性磁共振成像（MRI）扫描进行共配准，并实时反馈线圈位置38。此外，计算电场剂量学已被证明可通过确定使电场传递至特定脑区最大化所需的个体化线圈位置，实现更高效、更集中的刺激61。第三，在解释与运动诱发电位（MEP）幅值相关的结果时也需注意：已知MEP幅值反映&#160;皮质脊髓细胞所接收的多种内在神经输入，包括跨皮质成分以及脊髓运动神经元池的活动62,63,64。因此，在暴露于愉悦气味期间观察到的皮质脊髓兴奋性及有效连接性的调制，仅反映了可能参与MEP幅值调节的更为复杂的脊上和脊髓网络的一部分。结果应谨慎解读。

普遍认为，嗅觉刺激会引发自动反应和运动行为。例如，在人类中，最近已证明在负面气味出现后500毫秒内即会产生回避性运动反应（远离气味源的倾斜动作）。1通过记录自由活动的人类受试者探索从烧瓶中散发出的气味时的行为，Chalençon 等（2022）发现，运动行为（即接近气味源的速度以及将含有气味物质的烧瓶从鼻前移开的动作）与气味的享乐度密切相关。2此外，最近通过脑电图研究在人类中证实了嗅觉系统的信息处理与运动皮层活动之间存在密切关联。1具体而言，在负面气味出现后约350毫秒，初级运动皮层（M1）区域出现了特定的μ节律去同步化，该现象被认为反映了动作准备过程，随后迅速伴随有行为上的后退动作。1进一步支持嗅觉系统与运动系统之间存在关联的观点，另一项近期研究表明，与无气味条件相比，接触令人愉悦的气味可增加皮质脊髓兴奋性。3在本研究中，单脉冲经颅磁刺激（spTMS）被施加于M1区，以在气味感知期间诱发目标手部肌肉的运动诱发电位（MEP），并通过外周肌电图（EMG）记录。受试者被动暴露于令人愉悦的气味刺激。&#160;用浸透纯佛手柑精油的纸条置于金属支架上，放在鼻下3在此背景下，尚不明确皮质脊髓兴奋性的增强是源于令人愉悦的气味刺激，还是源于嗅闻、咬牙等非特异性的行为效应。4,5此外，尚不清楚令人不悦的气味如何通过经颅磁刺激（TMS）探测到的M1兴奋性进行调节。
总之，这凸显了有必要开发一种方法，以在以下方面优于以往研究中使用的技术3,6：（1）在同一实验阶段内随机呈现不同气味条件（愉悦/不愉悦/无气味）；（2）在研究运动系统时，根据人类鼻腔呼吸周期（吸气和呼气阶段）精确同步气味呈现与经颅磁刺激（TMS）的时间。
经颅磁刺激（TMS）也可作为一种研究多个皮质区域与初级运动皮质（M1）之间皮质-皮质相互作用（也称为有效连接性）的工具，具有较高的时间分辨率7,8,9,10,11,12。本文采用双位点TMS（dsTMS）范式，其中首次的条件刺激（CS）激活目标皮质区域，随后使用另一线圈在M1上施加第二次的测试刺激（TS）以诱发运动诱发电位（MEP）。通过将条件化MEP（dsTMS条件）的振幅归一化至非条件化MEP（spTMS条件）的振幅，来评估CS的影响13。随后，负的比值表示&#160;皮质-皮质间的抑制性相互作用，而正的比值则表示两个刺激区域之间的易化性皮质-皮质相互作用。因此，dsTMS范式提供了一个独特的机会，可用于识别预激活区域与M1之间有效连接的性质（即易化性或抑制性）、强度及其调节机制。重要的是，皮质-皮质相互作用反映了易化与抑制之间复杂的平衡，这种平衡可能在不同的时间、心理状态或任务中被调节7,14。
据我们所知，这一相对较新的双脉冲经颅磁刺激（dsTMS）范式尚未被用于研究不同愉悦度气味感知过程中的皮质-皮质间相互作用。然而，神经影像学研究表明，暴露于令人愉悦或不愉快的气味物质会引发参与情绪、决策和行为控制的大脑区域之间的连接性变化，这些区域包括辅助运动区、前扣带皮层以及背外侧前额叶皮层（DLPFC）15,16。事实上，DLPFC 是调节情绪控制、感觉信息处理以及运动控制高级功能（如准备性过程）的关键脑区17,18,19。此外，人类与动物研究均证实，DLPFC 存在多种向初级运动皮层（M1）投射的神经通路17,18,20,21,22。根据情境不同，这些 DLPFC 投射可增强或抑制 M1 的活动7,19,20。因此，DLPFC 与 M1 之间的有效连接可能在气味呈现过程中受到调节，且令人愉悦与不愉快的气味物质可能分别激活不同的皮质网络，从而对 DLPFC-M1 连接性产生差异性影响。
本文提出一种新方法，适用于在人类鼻呼吸同步呈现愉悦与不愉悦气味时，对皮质脊髓兴奋性及有效连接性的调节进行方法学上严谨的研究。

<table><tbody><tr><td>采集板（8通道）&amp;nbsp;</td><td>National Instrument</td><td>NI USB-6009&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>空气压缩机</td><td>Jun-Air&amp;nbsp;</td><td>Model6-15</td><td></td></tr><tr><td>酒精消毒片</td><td>任意品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>丁酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B103500</td><td>阴性气味刺激物</td></tr><tr><td>台式计算机</td><td>Dell</td><td>Latitude 3520</td><td></td></tr><tr><td>肌电图系统</td><td>Biopac System</td><td>MP150</td><td></td></tr><tr><td>乙酸异戊酯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W205508</td><td>阳性气味刺激物</td></tr><tr><td>鼻导管</td><td>SEBAC France</td><td>O1320</td><td></td></tr><tr><td>可编程脉冲发生器</td><td>A.M.P.I</td><td>&amp;nbsp;Master-8</td><td></td></tr><tr><td>表面电极</td><td>Kendall Medi-trace</td><td>FS327</td><td></td></tr><tr><td>经颅磁刺激线圈（X2）</td><td>MagStim</td><td>D40 Alpha B.I. coil&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>经颅磁刺激仪</td><td>MagStim</td><td>Bistim2</td><td></td></tr><tr><td>6 mm × 20 m 管道</td><td>Radiospare</td><td>686-2671</td><td>气动连接</td></tr><tr><td>USB-RS232 转换器</td><td>Radiospare</td><td>687-7806</td><td></td></tr><tr><td>U型管</td><td>VS technologies</td><td>VS110115</td><td></td></tr></tbody></table>

结合呼吸同步嗅觉仪与脑刺激技术研究气味对皮质脊髓兴奋性及有效连接的影响

Combining a Breath-Synchronized Olfactometer with Brain Simulation to Study the Impact of Odors on Corticospinal Excitability and Effective Connectivity

普遍认为，嗅觉刺激会引发动物和人类的运动行为，例如趋向令人愉悦的气味物质并回避令人不悦的气味。近年来，利用脑电图和经颅磁刺激（TMS）的研究已证实，人类嗅觉系统的信息处理与运动皮层活动之间存在密切关联。为了更深入地理解嗅觉系统与运动系统之间的相互作用，并克服以往方法学上的一些局限，我们开发了一种新方法，该方法结合了嗅觉刺激仪，可随机呈现不同享乐度值的气味物质，并与经颅磁刺激（单线圈和双线圈）同步触发，且与鼻腔呼吸时相精确同步。该方法可用于探测在感知愉悦与不愉悦气味过程中，皮质脊髓兴奋性以及背外侧前额叶皮层与初级运动皮层之间同侧有效连接性的潜在调制情况。应用此方法可客观地区分特定受试者对某种气味物质的愉悦度评价，揭示该气味物质对大脑有效连接性和兴奋性的生物学影响。此外，该方法还可能为存在嗅觉感知或运动调控异常的神经科或神经精神疾病患者的临床研究提供新的途径&#160;气味愉悦度改变及适应不良的趋近-回避行为

此处展示的代表性数据反映了参与者完成上述逐步操作流程后的记录结果，旨在为我们可能预期的结果提供初步见解。
图2&#160;展示了使用嗅觉测定软件记录的代表性受试者呼吸信号示例。当达到设定阈值时，呼气和吸气阶段均被准确检测。气味刺激在呼气相阈值过后立即触发，并持续扩散5秒。经颅磁刺激（TMS）脉冲在吸气相阈值过后延迟600毫秒触发。
该结果表明，本文开发的方法能够根据人类鼻腔呼吸周期精确同步气味扩散与经颅磁刺激（TMS）的时间。
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65714/65714fig02.jpg" /> 
图2代表性受试者呼吸记录的原始数据示例。 当跨越阈值（以红线表示）时，检测到呼气相；当跨越另一阈值（以蓝线表示）时，检测到吸气相。气味刺激在呼气相阈值过后立即触发，并持续扩散5秒，如绿线所示。经颅磁刺激（TMS）脉冲在吸气相阈值过后延迟600毫秒触发。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65714/65714fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
图3展示了在不同条件（spTMS 和 dsTMS）以及不同气味效价（无气味、正性气味和负性气味）下，一位代表性受试者右侧第一骨间背侧肌（FDI）的肌电图（EMG）记录结果（MEP记录）。由spTMS诱发的MEP峰-峰振幅（图3A）和由dsTMS诱发的MEP峰-峰振幅（图3B）随气味的效价而变化。当结果进行归一化处理后（图3C），所有MEP比值均低于1，表明左侧DLPFC对左侧M1具有抑制作用。该结果表明，本研究建立的方法可用于探究在愉悦与不愉悦气味感知过程中，伴随人类鼻呼吸同步呈现所引发的皮质脊髓兴奋性及有效连接性的调制变化。这些结果尚属初步，需进一步研究以明确气味效价对皮质脊髓兴奋性和有效连接性的具体影响。
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65714/65714fig03.jpg" /> 
图3：一名参与者右第一背侧骨间肌的典型原始记录示例。 (AspTMS条件下，正性气味剂（绿色）、负性气味剂（橙色）及无气味剂条件（灰色）。&#160;(B)&#160;dsTMS 条件，含正性气味刺激（绿色）、负性气味刺激（橙色）及无气味刺激条件（灰色）。C)&#160;对一名代表性受试者经归一化处理后得到的MEP比值。三个MEP比值均小于1，表明DLPFC对M1具有抑制性影响。原始MEP波形显示单次试验的记录结果。柱状图展示了每种条件下20次试验的平均值、标准差及各个个体MEP值。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65714/65714fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本文介绍了使用与呼吸同步的嗅觉仪，在与人类鼻呼吸同步的气味呈现期间，触发单线圈和双线圈经颅磁刺激（TMS）的方法。该组合技术使我们能够客观地研究愉快和不愉快气味对个体皮质脊髓兴奋性及脑区间有效连接的影响。

普遍认为，嗅觉刺激会引发动物的运动行为，例如趋向令人愉悦的气味物而回避令人不悦的气味物……

本研究旨在探讨大脑中嗅觉系统与运动系统之间的关系。我们特别关注愉快和不愉快的气味在正常和病理条件下对皮质脊髓可及性及有效连接性的影响。探索嗅觉-运动相互作用的机制基础需要仔细考虑两个方法学方面。首先，在同一实验阶段内必须提供不同的嗅觉条件。其次，需要精确控制嗅觉刺激和经颅磁刺激（TMS）与呼吸时相的同步。本文介绍了一种新方法，专为严格研究愉快与不愉快气味感知过程中可能发生的皮质脊髓兴奋性及有效连接性的调制而设计。所有刺激均与人类鼻呼吸同步呈现。该方法为临床研究奠定了基础，可用于探索嗅觉系统与运动系统之间的异常相互作用。目前，我们正在将这些方法应用于患有精神障碍的患者，这些患者通常伴有对气味的愉悦感知改变以及适应不良的趋近或回避行为。首先，请受试者坐在舒适的椅子上，双手放松并呈掌心向下位。在安放电极前，使用去角质磨砂膏轻轻摩擦待贴电极部位的皮肤以进行准备。随后，用酒精棉片清洁将要安放电极的区域。然后使用腹肌-肌腱组合方式，将一次性银/氯化银记录电极应用于第一背侧骨间肌。将接地电极置于尺骨茎突处。通过导线将电极连接至放大器。将系统与数据采集系统集成。记录肌电图（EMG）信号，并评估显示在连接至数据采集系统的屏幕上的信号质量。接下来，将TMS线圈M1连接至A刺激器。然后在受试者头部戴上一个贴合紧密的帽具。使用卷尺根据标准颅骨解剖标志测量鼻根点-枕外隆凸、耳前点-耳前点以及头围。在矢状中线与口间线的交点处确定头皮顶点，并用笔标记该位置。接下来，将第一个小型8字形线圈切向放置于头皮上，位置为左脑M1区手部区域的估计位置，即位于头顶中点向外侧5厘米处。然后将TMS线圈DLPFC连接至B刺激器。使用更新后的头皮定位方法，确定对应左侧背外侧前额叶皮层（DLPFC）的头皮区域。估算第二个小型双八线圈在DLPFC上的放置位置。下载在线Excel电子表格计算工具。输入鼻根-枕外隆凸和耳前点-耳前点的距离以及头围（单位：厘米）。将XLA和YLA距离直接标记在受试者的头部。将经颅磁刺激（TMS）线圈置于假定的左侧背外侧前额叶皮层（DLPFC）位置，与头皮呈切线方向放置。将手柄朝下并向外侧倾斜，与正中矢状线呈负45度角。在帽上标记经颅磁刺激（TMS）线圈在背外侧前额叶皮层（DLPFC）的放置位置，以确保整个实验过程中线圈位置正确。接下来，将嗅觉仪的鼻导管置于受试者鼻孔附近，以测量鼻腔呼吸。指导受试者通过鼻子正常呼吸。打开便携式空气压缩机、嗅觉计表箱以及安装有软件的电脑。检查所有电缆连接。进入校准阶段，持续20秒，以调整呼气相和吸气相的检测阈值。在嗅觉测量仪软件中运行自制的涂层脚本。以随机顺序递送spTMS和dsTMS与愉悦气味、不愉悦气味以及无气味的所有组合。呼吸信号的代表性图谱显示，呼气相和吸气相在越过阈值时被检测到。气味刺激在呼气相阈值过后立即触发，而经颅磁刺激（TMS）脉冲则在吸气相阈值过后延迟触发。表明该方法能够根据人类鼻呼吸周期精确同步气味扩散与TMS刺激时机。来自右侧第一背侧骨间肌（FDI）的肌电图（EMG）和运动诱发电位（MEP）记录显示，由单脉冲经颅磁刺激（spTMS）和双脉冲经颅磁刺激（dsTMS）诱发的MEP峰值振幅随气味物质的享乐价值而变化。当结果进行归一化处理后，所有MEP比值均低于1，表明左侧背外侧前额叶皮层（DLPFC）对左侧初级运动皮层（M1）具有抑制作用。

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JoVE Journal

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