嗅觉系统作为模型来研究轴突生长的模式和形态在体内

我们描述了一种通过电穿孔和随后的共聚焦激光扫描或多光子显微镜对嗅觉感觉神经元进行体内标记的方案，以可视化神经元形态及其随时间的发展。

该程序的总体目标是在体内标记嗅觉感觉神经元，以可视化轴突形态和发育。这是通过首先将氟 4 偶联葡聚糖钻入单个嗅觉感觉神经元来实现的。第二步是等待 24 小时，让染料扩散到感觉神经元的轴突过程中。

接下来，麻醉蝌蚪并使用多光子显微镜获取嗅球的三维图像堆栈。最后一步是在指定的时间间隔后重复检查同一只动物中标记的神经元。最终，细胞形态的重建允许轴突形态变化的可视化。

这种方法可以帮助回答神经科学领域的关键问题，例如轴突如何向前脑中的目标区域生长以及突触是如何形成的。实验前。确保电穿孔装置由具有大工作距离的立体显微镜组成，并配备荧光照明和染料滤光片组。

用于电穿孔，使用专用的单细胞电穿孔或连接到示波器的通用方波发生器。将电穿孔输出连接到移液器支架和浴电极。确保移液器支架和浴电极都包含涂有一层薄薄的氯化银的银丝。

接下来，将移液器支架安装在微型纵器上，以实现精确定位。之后，用带有内部细丝的硅酸盐玻璃毛细管制造用于电穿孔的微量移液器。设置微量移液器 polar 的参数，以产生更长的柄和更小的吸头开口微量移液器，具有高移液器电阻，用于单细胞电穿孔。

然后直接使用专用的单池电穿孔测量移液器电阻。在此过程中，将氟四偶联葡聚糖以 3 毫摩尔的浓度溶解在青蛙林格中。将此储备溶液分成小等分试样，并将一份存放在冰箱中以备将来使用。

接下来，用 1 至 5 微升葡聚糖溶液回填微量移液器。小心地轻弹微量移液器，去除移液器吸头上残留的气泡。然后将微量移液器安装在移液器支架中。

确保移液器内的银线与染料溶液接触。现在，将一小块组织放入培养皿中，并用少量含有 0.02% trica 的水覆盖。接下来，在含有 0.02% trica 的水中麻醉前的蝌蚪。

通过触摸它并确保它没有反应来确认适当的麻醉。然后小心地将蝌蚪转移到覆盖有组织的培养皿中。确保电极与湿组织接触，并使用微型纵器将微量移液器吸头放置在靠近蝌蚪嗅觉器官的位置。

之后，穿透覆盖嗅觉器官的皮肤。用移液器吸头小心地将吸头推进到位于主嗅上皮或 MRO 鼻上皮的中央感觉神经元层。现在触发正方电压脉冲，以便通过施加单个电压极或多个脉冲序列将染料转移到感觉神经元中。

然后使用荧光立体显微镜观察成功的染料挤出和电穿孔。电穿孔成功后，染料迅速扩散到细胞体和树突中。对蝌蚪的第二个嗅觉器官重复程序后，将蝌蚪转移到装满淡水的烧杯中进行回收，并让电穿孔染料扩散到感觉神经元和嗅球。

电穿孔后至少 24 小时，在含有 0.02% trica 的水中麻醉蝌蚪。接下来，小心地将蝌蚪转移到成像室中。从一条 param 中剪出一个小矩形。

然后用参数覆盖蝌蚪，将前尾头骨穿过切口窗口。用针将参数固定在培养皿上，不要伤害蝌蚪，并确保将蝌蚪浸入含有 0.02% Trica 的足水中。随后将成像室安装在正置多光子显微镜或共聚焦显微镜的载物台上。

获取嗅球的三维图像堆栈，并确保成像过程不超过 10 到 15 分钟。之后，将蝌蚪放回单独水箱中的正常水中，并防止其暴露在光线下。在这张图片中，在嗅觉器官的四个远处对偶联在不同氟 4 的四层链进行电穿孔，横向用绿色表示，中间用黄色表示，内侧用红色表示，犁骨鼻器官用橙色表示。

这允许可视化副嗅球和主嗅球的三个主要投影场。这张图片显示了叠加在嗅球结构上的单个嗅觉感觉神经元的不同轴突生长模式的三维重建，这是一个单个嗅觉感觉神经元轴突投射到嗅球并在球形肾小球中形成簇状树枝化的例子。正如在 Opus Levu 中看到的那样，这些轴突在连接到一个、两个或多个 gmer 之前有规律地分叉。

这是通过体内延时成像反复研究的单个嗅觉感觉神经元的代表性例子，显示轴突形态的连续变化。观看此视频后，您应该对如何通过电穿孔标记嗅觉感觉神经元以及如何使用体内 TimeLapse 成像监测其发育有很好的了解。