一种改良的 QuEChERS-HPLC 方法检测暴露于细颗粒物的斑马鱼胚胎中多环芳烃
2025年6月13日
我们开发了一种改良的 QuEChERS-HPLC 方法来评估斑马鱼胚胎中 16 种 PAHs 的内部水平。
本研究旨在开发一种改进的QuEChERS-HPLC方法来量化暴露于EOM的斑马鱼胚胎中的PAH，解决目前由于胚胎质量大小和生物基质复杂性而导致的内部PAHs水平测量技术挑战造成的差距。获得可靠的结果需要每组 200 个胚胎，这是一个实际挑战。HPLC与荧光检测器相结合可以进一步提高该方法的灵敏度。与其他技术相比，这种改进的QuEChERS-HPLC方法显著缩短了样品悬挂时间，并为分析暴露于EOM的斑马鱼胚胎中16种PAHs的水平提供了一种快速有效的方法。
[旁白]首先，在受精后72小时从培养箱中取出含有胚胎的培养皿来制备QuEChERS样品。用纯净水清洗胚胎三次。将胚胎转移到 1.5 毫升管中并去除多余的水。将试管放入零下 80 摄氏度的冰箱中 30 分钟以冻干胚胎。冻干后，使用玻璃棒研磨胚胎。向DMSO对照组中加入25微升16种多环芳烃或PAH混合标准溶液，以测试加标回收率。然后，加入一毫升正己烷并涡旋 30 秒。将混合物在 35 摄氏度下超声处理 30 分钟。现在，将样品以 7,000g 离心五分钟。将上清液转移到新鲜的管中。在35摄氏度的水浴中，在氮气流下蒸发收集的上清液至干燥。加入一毫升乙腈，涡旋30秒。向样品中加入10毫克伯仲胺、45毫克硫酸镁和15毫克C18填料，然后涡旋30秒。以 7,000g 离心五分钟，然后将上清液转移到新鲜管中。在氮气下将上清液蒸发至0.5毫升，并通过0.22微米微孔膜过滤样品。使用乙腈为 16 PAH 混合标准品制备一系列工作溶液，范围从每毫升 1 到 500 纳克不等。使用乙腈或水流动相将 20 微升样品溶液注入液相色谱仪中，并按照屏幕上显示的洗脱程序进行作。绘制一条标准曲线，其中标准工作溶液的质量浓度在x轴上，在y轴上相应的峰面积，涵盖从5纳克/毫升到500纳克/毫升的范围。将纯化的样品注入装有荧光检测器（FLD）和二极管阵列检测器（DAD）的液相色谱仪中。通过比较保留时间来识别多环芳烃的存在。测量峰面积以确定浓度。最后，根据测量的质量浓度计算16种PAH的内部浓度。本表给出了受精后 72 小时斑马鱼胚胎中多环芳烃 （PAH） 的浓度。在可提取有机物（EOM）暴露的斑马鱼胚胎中成功检测到六种多环芳烃。相比之下，在DSMO对照样品中仅鉴定出两种PAH，其水平明显低于EOM样品中的PAH。
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概览
本研究提出了一种改进的QuEChERS-HPLC方法，用于定量分析斑马鱼胚胎中的多环芳烃（PAHs）。该方法解决了由于胚胎体积小和生物基质复杂而导致的内部PAH水平测量挑战。
关键研究组成部分
科学领域
- 环境毒理学
- 分析化学
- 发育生物学
背景
- 多环芳烃（PAHs）是环境污染物。
- 斑马鱼胚胎作为研究毒素发育影响的模型。
- 在小型生物样本中测量PAH水平存在技术挑战。
- 现有方法可能无法提供准确定量所需的灵敏度。
研究目的
- 开发一种可靠的方法来定量分析斑马鱼胚胎中的PAHs。
- 与现有技术相比，提高灵敏度并减少样品悬挂时间。
- 促进发育研究中PAH暴露的分析。
使用的方法
- 改进的QuEChERS提取方法结合HPLC。
- 使用荧光检测器来增强灵敏度。
- 分析前胚胎的准备和冻干。
- 生成PAHs定量的标准曲线。
主要结果
- 在暴露于可提取有机物（EOM）的斑马鱼胚胎中检测到六种PAHs。
- 在DMSO对照样品中仅鉴定出两种PAHs。
- 改进的方法显著减少了样品处理时间。
- 使用新方法实现了PAHs的可靠定量。
结论
- 改进的QuEChERS-HPLC方法对于分析斑马鱼胚胎中的PAHs是有效的。
- 这种方法解决了PAHs测量中之前的技术限制。
- 研究结果有助于理解环境污染物对发育的影响。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative detection of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in small, complex biological matrices is a critical challenge in early toxicology and environmental risk assessment workflows. The modified QuEChERS-HPLC method enables sensitive, reproducible measurement of internal PAH levels in zebrafish embryos, supporting mechanistic de-risking and predictive confidence in developmental toxicity studies. This capability strengthens translational continuity from environmental exposure models to preclinical safety evaluation in biopharma pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of toxicant-induced developmental pathways using quantitative PAH measurements.
- Supports biological de-risking by clarifying internal exposure-response relationships in model systems.
- Facilitates predictive confidence in linking environmental exposures to mechanistic outcomes.
Screening & Assay Development
- Provides validated sample preparation and detection workflows for high-throughput toxicant screening.
- Delivers standardized, quantitative outputs for cross-condition comparison and assay reproducibility.
- Enables reliable evaluation of compound effects on PAH uptake and metabolism in embryos.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for assessing developmental toxicity of environmental contaminants.
- Supports continuity from discovery-stage exposure models to preclinical safety assessment.
- Improves risk-adjusted advancement decisions by quantifying internal toxicant burden.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust quantification of PAHs in zebrafish embryos, informing both mechanistic studies and translational toxicology workflows.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on toxicant mechanisms and pathway involvement.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Delivers sensitive detection and statistical comparison of PAH levels across experimental groups.
- Translational Research: Bridges environmental exposure models to preclinical safety endpoints.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized workflow for repeated use in toxicology and exposure studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in developmental toxicity studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput in PAH quantification workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio triage based on quantitative exposure data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of compounds with favorable safety profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sample preparation, HPLC operation, and analytical chemistry.
- Needs access to HPLC systems with fluorescence and diode array detectors.
- Demands cross-team standardization for sample handling and data analysis.
- Adaptation may be needed for different model organisms or biological matrices.
- Sample throughput is limited by the requirement for large embryo numbers per group.
