一种改良的QuEChERS-HPLC方法用于检测暴露于细颗粒物的斑马鱼胚胎中多环芳烃
2025年6月13日
我们开发了一种改进的QuEChERS-HPLC方法，用于检测斑马鱼胚胎内16种多环芳烃的含量水平。
本研究旨在开发一种改进的QuEChERS-HPLC方法，用于定量分析暴露于EOM的斑马鱼胚胎中的多环芳烃（PAHs），以解决当前因胚胎质量微小及其生物基质复杂所导致的内源性PAHs水平检测技术难题。获得可靠结果需要每组200枚胚胎，这在实际操作中构成一定挑战。将HPLC与荧光检测器联用可进一步提高该方法的灵敏度。与其他技术相比，这种改进的QuEChERS-HPLC方法显著缩短了样品处理时间，为分析暴露于EOM的斑马鱼胚胎中16种PAHs的含量提供了一种快速高效的解决方案。
[旁白] 首先，准备QuEChERS样品：在受精后72小时，从培养箱中取出含有胚胎的培养皿。用纯水清洗胚胎三次。将胚胎转移至1.5毫升离心管中，并去除多余水分。将离心管置于–80°C冰箱中冷冻30分钟，以冻干胚胎。冻干后，使用玻璃棒研磨胚胎。向DMSO对照组中加入25微升16种多环芳烃（PAH）混合标准溶液，用于测试加标回收率。然后加入1毫升正己烷，涡旋振荡30秒。在35°C条件下超声萃取30分钟。随后，以7,000×g离心5分钟。将上清液转移至新的离心管中。在35°C水浴中，用氮气流将收集的上清液吹干。加入1毫升乙腈，涡旋振荡30秒。向样品中加入10毫克伯仲胺（PSA）、45毫克硫酸镁和15毫克C18填料，再涡旋振荡30秒。以7,000×g离心5分钟，将上清液转移至新的离心管中。用氮气将上清液浓缩至0.5毫升，并通过0.22微米微孔滤膜过滤样品。使用乙腈配制一系列浓度范围为1至500纳克/毫升的16种PAH混合标准工作溶液。取20微升样品溶液注入液相色谱仪，采用乙腈或水作为流动相，按照屏幕上显示的洗脱程序进行分析。以标准工作溶液的质量浓度为横坐标（x轴），相应峰面积为纵坐标（y轴），绘制标准曲线，浓度范围覆盖5至500纳克/毫升。将纯化后的样品注入配备荧光检测器（FLD）和二极管阵列检测器（DAD）的液相色谱仪中。通过比较保留时间鉴定PAH的存在，并测量峰面积以确定其浓度。最后，根据测得的质量浓度计算16种PAH在胚胎内的含量。该表格列出了受精后72小时斑马鱼胚胎中多环芳烃（PAH）的浓度。在暴露于可提取有机质（EOM）的斑马鱼胚胎中，成功检出6种PAH。相比之下，在DMSO对照样品中仅检出2种PAH，且其含量显著低于EOM样品中的水平。
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概述
本研究提出了一种改进的QuEChERS-HPLC方法，用于定量斑马鱼胚胎中的多环芳烃（PAHs）。该方法解决了由于胚胎体积微小且生物基质复杂，导致内部PAH含量难以测定的技术难题。
关键研究组成部分
科学领域
- 环境毒理学
- 分析化学
- 发育生物学
背景
- 多环芳烃（PAHs）是环境污染物。
- 斑马鱼胚胎是研究毒素对发育影响的模型。
- 在小型生物样本中测定PAH含量存在技术挑战。
- 现有方法可能无法提供准确定量所需的灵敏度。
研究目的
- 建立一种可靠的斑马鱼胚胎中多环芳烃（PAHs）定量方法。
- 提高检测灵敏度，并相较于现有技术减少样品处理时间。
- 促进在发育研究中对多环芳烃暴露的分析。
使用的方法
- 改进的QuEChERS提取方法结合高效液相色谱法。
- 使用荧光检测器以提高灵敏度。
- 分析前对胚胎进行制备和冻干处理。
- 建立标准曲线以定量多环芳烃（PAHs）。
主要结果
- 在暴露于可提取有机物（EOM）的斑马鱼胚胎中检测到六种多环芳烃。
- 在DMSO对照样品中仅鉴定出两种多环芳烃。
- 改进后的方法显著缩短了样品处理时间。
- 利用新方法实现了对多环芳烃的可靠定量。
结论
- 改进的QuEChERS-HPLC方法可有效分析斑马鱼胚胎中的多环芳烃（PAHs）。
- 该方法克服了以往多环芳烃检测中的技术局限性。
- 研究结果有助于深入理解环境污染物对发育过程的影响。
常见问题
行业重要性概述
在小型且复杂的生物基质中对多环芳烃（PAHs）进行定量检测，是早期毒理学和环境风险评估工作流程中的关键挑战。改进的QuEChERS-HPLC方法可实现对斑马鱼胚胎内源性PAH水平的高灵敏度、可重复测量，有助于阐明发育毒性研究中的作用机制并提高预测可信度。该技术能力加强了从环境暴露模型到生物制药管线中临床前安全性评价的转化连续性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 利用定量多环芳烃（PAH）测量，可探究毒物诱导的发育通路。
- 通过阐明模型系统中体内暴露与生物学响应之间的关系，支持生物学风险消减。
- 有助于提高将环境暴露与机制性效应关联起来的预测可信度。
筛选与检测方法开发
- 提供经过验证的样品制备和检测工作流程，用于高通量毒性物质筛选。
- 提供标准化的定量输出结果，便于不同条件间的比较以及检测方法的可重复性。
- 实现对化合物在胚胎中多环芳烃（PAH）吸收和代谢影响的可靠评估。
转化与临床前研究
- 与疾病相关模型相一致，用于评估环境污染物的发育毒性。
- 支持从发现阶段的暴露模型延续至临床前安全性评估。
- 通过量化体内毒物负荷，改进基于风险的推进决策。
流程与工作流整合
该方法通过实现对斑马鱼胚胎中多环芳烃（PAHs）的可靠定量，将其整合到从发现到临床前研究的连续流程中，为机制研究和转化毒理学工作流程提供支持。
- 发现生物学：支持对毒物作用机制及通路参与的假设验证。
- 筛选：为检测方法开发和化合物评价提供可重复、定量的读数结果。
- 分析：实现对不同实验组中多环芳烃（PAH）水平的高灵敏度检测与统计学比较。
- 转化研究：将环境暴露模型与临床前安全性终点相衔接。
- 企业级复用：建立可扩展、标准化的工作流程，用于毒理学和暴露研究中的重复使用。
运营与企业影响
- 科学价值：提高发育毒性研究的预测可信度，降低机制上的不确定性。
- 操作价值：增强多环芳烃（PAH）定量工作流程的标准化性、可重复性和通量。
- 战略价值：基于定量暴露数据，支持科学的立项/终止决策，实现资本高效的投资组合筛选。
- 组合影响：支持根据风险调整，优先推进具有优良安全性特征的化合物。
实施注意事项
- 需要具备样品制备、高效液相色谱操作和分析化学方面的专业知识。
- 需要配备带有荧光检测器和二极管阵列检测器的高效液相色谱系统。
- 要求跨团队在样品处理和数据分析方面实现标准化。
- 针对不同模式生物或生物基质可能需要进行方法调整。
- 由于每组需要大量胚胎，样品通量受到限制。
