利用数字显微镜观察棉花叶片和苞片蜜腺以提高评分准确性和数据保存

本研究旨在建立一种能够准确评分蜜腺性状表达的方法。为了说明蜜腺性状的表达情况，本研究以棉花叶片和苞叶蜜腺作为模式组织。该方法克服了传统评分方法在蜜腺性状评分中不可靠且不准确的局限性。

首先，将一个冷藏箱和已标记的自封袋带至温室用于样品采集，从温室中生长两个月至三个月的棉花植株上采集幼嫩叶片组织，并将其放入已标记的样品袋中。每个植株样品至少采集两片叶子，放入相应标记的样品袋内，采集完成后将袋子密封牢固。将每个装有叶片组织并已密封的样品袋放入冷藏箱中。

在植物处于盛花期时，从顶端枝条采集健康的花朵。将至少两朵花放入已标记的样品袋中，并密封袋子。将装有花朵的密封样品袋转移至冷藏箱中，运送到实验室。

打开显微镜并完成初始启动步骤。将一张对折后裁剪至与显微镜载物台大小相匹配的A4白色纸片放置在载物台上。使用控制台控制器上的小灯光调节旋钮，将显微镜载物台的光照强度调节至最大。

然后将大亮度旋钮旋转至四分之三位置，将其设置为中高亮度。在计算机上，于显微镜软件中选择 10 × 放大倍数。将叶片组织放置在显微镜载物台上预先切割好的白色纸片上，使远轴面朝上，并将其居中放置于载物台上。

轻轻旋转粗调和微调旋钮，使叶片中脉对焦。持续调节直至图像清晰无模糊。将中脉下端蜜腺所在位置置于视野中央，同时确保分叉的侧脉清晰可见。

使用粗调和微调旋钮进一步优化焦距，以提高数字图像的清晰度。拍摄蜜腺图像。当软件提示时，将图像以样品编号保存至指定位置，然后根据观察到的叶片蜜腺表型赋予1至4的评分。

使用镊子或手从花朵上移除苞片。将花朵放置在干净的切割板上。使用无菌刀片切下花梗，然后沿去除苞片的边缘做一直线切口。

将准备好的花组织倒置放置在显微镜载物台上的预裁白纸上。使用粗调和微调旋钮改善屏幕上显示图像的清晰度。使用适当的样品编号保存图像。

对叶片中脉下方远轴面进行数字图像评分，结果显示两种表型：评分为1的表型在中脉处无蜜腺；评分为4的表型具有完全发育且分泌蜜汁的蜜腺。对花样品的苞片蜜腺进行分析时，也观察到两种表型：评分为1的表型无蜜腺，评分为4的表型具有完全形成的蜜腺并分泌蜜汁。

在10倍、20倍和40倍放大倍数下，蜜腺植物的数字图像清晰地显示了叶片和苞片上的蜜腺结构。与标准评分格式相对应的选定叶片数字图像显示：评分为1表示无蜜腺，评分为2表示蜜腺发育不全，评分为3表示蜜腺较小，评分为4表示蜜腺完全发育。对具有蜜腺和无蜜腺杂交后代分离群体中的无蜜腺植株进行准确评分，对于选育可减少植株虫害及降低产量损失的无蜜腺植株至关重要。

因此，选择该性状对于下游应用至关重要，例如与无蜜腺性状相关的DNA标记，这些标记是分子标记辅助选择的宝贵工具。