Name: 扫描电子显微镜（SEM）协议有问题的工厂，卵菌和真菌样本 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: 学习扫描电子显微镜样本制备方法，用于植物、卵菌和真菌的精细组织观察。该改进方案解决了细胞塌陷和样本损伤问题，帮助研究人员清晰观察感染过程的关键细节。

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本项目获得了欧盟“地平线2020”研究与创新计划的资助，资助协议编号为634429。本出版物仅反映作者的观点，欧盟委员会对其中所含信息的任何使用均不承担责任。我们还感谢西班牙高等科研理事会皇家植物园提供的资金支持。SR感谢欧盟[ITN-SAPRO-238550]对其在Saprolegnia研究方面的支持。我们还要感谢Francisco Calonge慷慨提供Phellorinia herculanea的图像，以及B. Pueyo对样品的处理（图5）。所有图像均由位于马德里的西班牙高等科研理事会皇家植物园扫描电镜服务中心拍摄。

注意：本方案包含六个主要部分，其中三个部分专门针对特定生物体（第1-3部分），另外三个部分描述适用于所有生物体的通用步骤（第4-6部分）。星号（*）表示由实验人员修改的步骤。
1. 植物发育中及完全形成结构的研究
<ol>
	<li>样本采集与固定
	<ol>
		<li>若植物材料采集地无法使用通风橱，则将材料放入离心管中，并加入70%乙醇进行固定和浸润。理想情况下，应在材料经FAA固定48小时后（步骤1.1.1–1.1.3）再浸入乙醇，以避免乙醇造成过度脱水。若采集地可使用通风橱，则忽略此步骤，直接进行步骤1.1.1。</li>
		<li>在配备醛类过滤装置的通风橱中配制福尔马林-乙酸-酒精（FAA）固定液。加入85份70%变性乙醇、10份60%甲醛溶液和5份冰醋酸。应在固定材料前现配FAA，因其不建议长期储存。40.</li>
		<li>在通风橱下，将FAA固定液倒入若干个广口且防漏的塑料瓶中。塑料瓶的数量应与待处理样本数量一致，并制作标签用于样本标识。</li>
		<li>选择待固定的花芽或营养分生组织，确保其未受到昆虫、真菌或极端天气条件的损伤。剪取枝条，去除不需要的组织，并将样品置于 立即 在 FAA 溶液中。</li>
		<li>72–96 小时后，将 FAA 倒入塑料容器中用于化学废弃物处理。立即用新鲜的 70% 乙醇清洗样品三次，以去除残留的 FAA。固定后的材料可无限期保存在 70% 乙醇中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>解剖与脱水
	<ol>
		<li>在体视显微镜下，使用超细镊子、针、镊子、刷子和显微手术刀，在70%乙醇中解剖固定材料（组织最大尺寸应约为1 cm）3，或对于平面材料为2 cm）。将样品解剖至盛有乙醇的培养皿中，以防止组织干燥。使用底部铺有干燥黑色硅胶的培养皿，以便更清晰地观察呈对比色的白色组织。</li>
		<li>将解剖后的材料放入临界点干燥仪（CPD， 图 2a）。此时，将容器浸入含有70%乙醇的培养皿中，并放入样本标识标签（用纸和铅笔制作）。为便于后续操作时更有效地干燥，请避免在同一容器中混合幼嫩样本与成熟样本。*</li>
		<li>将容器盖上盖子后放入装有足量70%乙醇的塑料离心管中。若样品不能立即处理，可将离心管在室温下放置过夜。</li>
		<li>将解剖后的材料依次转移至密封罐或离心管中的以下乙醇梯度溶液：70%、90%、100% 和 100%。每种溶液中至少浸泡 1 小时。最后在 100% 乙醇溶液中过夜保存。</li>
		<li>将装有材料的容器转移至CPD（第4节）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于扫描电镜观察的植物组织制备与固定
	<ol>
		<li>在扫描电镜样品台下方写上样品编号即， 铝制样品台）。用双面胶带覆盖样品台顶部。将样品台放入样品 holder（图2b).</li>
		<li>在体视显微镜下，小心打开携带经临界点干燥（CPD）处理后已干燥的幼嫩样品的容器。需注意，经过CPD处理后，样品会变得轻盈且对静电敏感。取出样品后应立即关闭容器，以避免灰尘或杂质污染。</li>
		<li>将样品置于载片粘性表面时，需预先规划好理想位置（一旦样品接触表面，便很难再移除）。此时不要尝试进行复杂的解剖操作，仅需去除容易移除的多余组织即可。进行孢粉学研究时，应解剖花药并将其打开，使花粉暴露在载片表面。</li>
		<li>将较长的样本（例如， 2 cm）的样本（如花序）置于水平位置。若可能，应将相同结构的样本按极性、侧面和底部视图进行排列。样本在载物台上的摆放应留出足够的间距。</li>
		<li>如果样品无法立即处理，应将其置于含硅胶的密闭容器中过夜保存，避免重新吸水（图2c)*. 使用溅射镀膜仪对样品进行镀膜处理，并将其转移至扫描电镜进行观察（第5和第6节）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="实验陶瓷烧结；设备示意图、显微镜样品台、炉子、致密化测量仪。" src="/files/ftp_upload/55031/55031fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2：扫描电镜观察前样品处理与操作工具。（a）钢制样品容器，带孔洞侧壁，用于临界点干燥仪腔室中乙醇与CO2的置换。（b）置于塑料样品架内的钢制样品台。（c）用于保护样品免受湿气和灰尘影响的玻璃容器；底部设有硅胶干燥剂存放仓。（d）临界点干燥仪。前方从左至右分别为压力表、电源开关、温度控制系统和温度显示屏。CO2-乙醇置换的常规工作压力为60 bar（800 psi）。顶部有四个阀门（进气、排水、通风和排气控制），围绕中央样品腔室对称分布。照片由Y. Ruiz-León和M.A. Bello拍摄。<a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55031/55031fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
2. 包囊行为的研究 水霉菌 (卵菌)在不同表面的行为
<ol>
	<li>囊肿的培养与固定
	<ol>
		<li>制备蛋白胨葡萄糖（PG-l）培养基41 使用D-(+)-葡萄糖（6 g）和霉菌学蛋白胨（3 g）*，加入自来水至900 mL，121°C高压灭菌40分钟 121 °C. 倒入50 mL先前已高压灭菌的溶液A（NaH2PO4，0.13 M）和 50 mL 溶液 B（Na2HPO4，0.13 M。</li>
		<li>来自菌株的保藏培养物 Saprolegnia parasitica 在PGA培养基（即PG-l培养基，但在高压灭菌前向葡萄糖和蛋白胨中加入10 g欧洲细菌学琼脂）上培养，在0.5 mL PG-l液滴中于24–48 h内生长菌丝菌落 20 °C 在培养皿中。通过无菌自来水洗涤菌丝体三次，并在15小时内于 20 °C42,43.</li>
		<li>轻轻吹打悬浮液上层，收集释放出的次生游动孢子，并将其分装至每份1 mL。将游动孢子剧烈涡旋振荡30秒，以诱导形成次生孢囊44.</li>
		<li>为检测囊肿棘突的差异性生长，在不同的培养皿（p60）中，分别将0.5 mL次级囊肿悬液接种于不同表面即， 碳、金和铜制透射电镜载网；鲑鱼和无须鳕鱼鳞片（先前已漂白）；以及玻璃盖玻片）。将包囊在 20 °C 70分钟，这有利于包囊附着于表面。</li>
		<li>吸去液体，向每个表面加入0.5 mL的2%戊二醛以固定包囊。将样品置于通风橱内室温下孵育1小时。</li>
		<li>去除戊二醛，并通过乙醇系列（30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100% 和 100%）对样品进行脱水，每种乙醇溶液加入 5 mL，作用 15 分钟。当样品进入最后的 100% 乙醇溶液后，可在密封的培养皿中保存长达一个月。至此，样品已准备好进行临界点干燥（CPD）。</li>
		<li>小心地将培养皿中的载网和标尺转移至适用于CPD（第4节）的样品台。此步骤应使用CPD专用载网架或堆叠式样品架，以确保样品彼此分离。使用镊子夹取载网和标尺，并注意在整个过程中保持载网上的包囊始终朝上。*</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于扫描电镜观察的囊肿样品制备与载样
	<ol>
		<li>将载网和标尺固定在预先贴有双面导电胶带并从底部做好标记的铝 stub 上。</li>
		<li>将样品转移至溅射镀膜仪（第5节）。</li>
		<li>在扫描电镜下观察样品（第6节）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 在扫描电镜下研究Phellorinia herculanea的腊叶标本真菌孢子
<ol>
	<li>孢子的复水与脱水
	<ol>
		<li>用滤纸小心包裹每个样品，制成约0.5–1 cm2的铅笔标记信封，注意不要压碎样品。用回形针封好滤纸。将包装好的样品转移至培养皿中，加入10 mL水，使孢子周围的组织复水。</li>
		<li>立即将样品放入微波炉中（600 W，约20秒）。当水开始蒸发时取出样品，并在室温下冷却。</li>
		<li>将样品依次通过以下乙醇系列：30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%和100%。根据样品量，使用烧杯或离心管进行此步骤。每种溶液中均放置15分钟。</li>
		<li>将样品放入临界点干燥仪中（第4节）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>孢子的制片与扫描电镜观察前准备
	<ol>
		<li>打开信封。将孢子倒在预先贴有双面胶的样品台上。或者，也可用样品台的黏性表面直接收集孢子，注意避免压碎样品*。</li>
		<li>若样品中孢子数量较少，除前述步骤外，可剪取信封的一小片（约1 mm2），置于新的样品台上*。</li>
		<li>将组织放入溅射镀膜仪中（第5节）。</li>
		<li>在扫描电镜下观察（第6节）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 使用临界点干燥仪（CPD，图2d）对材料进行干燥
<ol>
	<li>在通风良好的区域使用CPD，并确认机器的所有阀门均已关闭。检查样品室是否为空且清洁。</li>
	<li>开启机器，确认温度控制系统会自动进行自检。如果CPD配有外部制冷浴系统，开启前应检查水位。</li>
	<li>按照所用CPD设备的制造商说明进行乙醇和CO2的置换操作。出于安全考虑，此步骤应在接受过设备操作培训的人员监督下进行。请注意，设备可能经历快速的压力变化，存在剧烈爆裂的风险。</li>
	<li>取出样品后，若处理植物组织，则继续进行步骤1.3；若处理卵菌孢囊，则进行步骤2.2；若处理真菌孢子，则进行步骤3.2。</li>
</ol>
5. 使用溅射镀膜仪在样品上镀金（图 3a）
<ol>
	<li>检查溅射镀膜仪，确认金阴极靶材状态良好。必要时，使用浸有90%乙醇的无尘布清洁真空腔室壁和腔室盖。</li>
	<li>在溅射样品台的每个样品 stub 孔旁边标记数字，以便在显微镜下进一步识别样品。小心地将载有样品的 stub 放置到位并固定。使用旋转行星式样品台，以确保对表面不规则的样品实现均匀镀膜。</li>
	<li>按照制造商的说明调整工作距离等设置（例如，30 mm），操作气体压力（例如， 5 × 10-1 - 7 × 10-1 毫巴），溅射时间（例如， 50 s），金层厚度（例如， 12 nm）时的电流（例如，15 mA）和电压供应（例如， 600 V45.</li>
	<li>移除样品台并将其送至扫描电镜（第6节）。或者，将样品台放入含有硅胶的密封容器中图2c).</li>
</ol>
<img alt="冷冻制样装置（a）和用于样品分析的电子显微镜设置（b）" src="/files/ftp_upload/55031/55031fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3：溅射镀膜仪（a）和扫描电子显微镜（b）。（a）真空腔室的正面视图（左侧）、气体阀门、计时器、真空和电流控制装置。（b）扫描电镜主要组件的侧视图（从左到右）：带有样品室的真空柱、带控制系统的计算机屏幕以及腔室监视器。照片由Y. Ruiz-León拍摄。<a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55031/55031fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
6. 扫描电子显微镜（SEM，图3b）下的观察
<ol>
	<li>SEM 启动
	<ol>
		<li>按照制造商的说明启动并设置扫描电子显微镜（SEM），调节样品高度和物镜光阑直径（例如， 用于植物 2 µm 以及针对真菌和卵菌 4 µm），工作电压（例如， 15 kV</li>
		<li>检查电子束系统的正确对准情况，并根据制造商的说明设置轴向对准和消像散器。调节工作距离以获得合适的工作景深。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>图像采集
	<ol>
		<li>获取样品的清晰图像，并将其作为起点。将放大倍数调至接近最高水平，再次聚焦图像。选择具有表面不规则特征（如孔洞）的区域。校正像散，并调节至最佳对比度和亮度。</li>
		<li>使用高分辨率拍摄SEM图像。如果图像显示样品带电，则使用BSE探测器；否则，设置SE探测器。根据制造商的说明更换探测器。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

与标准的扫描电镜（SEM）操作流程相比，本文所介绍的方法具有相对快速、易于操作且成本较低的特点。根据样本数量及处理难易程度，通常需要四到五天时间即可获得高质量的图像。只要在临界点干燥（CPD）和扫描电镜操作过程中采取适当的安全防护措施，整个流程易于掌控。需特别注意甲醛和戊二醛的使用（见实验方案步骤1.1.1至1.1.3及2.1.5）。在某些步骤中，如有必要，可在不损害样本或影响前期操作的前提下长时间暂停流程。例如， 步骤 1.1.5、1.2.3 和 1.3.5）。在成本方面，大部分设备可重复用于多次制备（例如， CPD 铝制容器和样品 stub 持架），且所用试剂均为商业供应商提供的非昂贵化学品。
这些方法的缺点包括需要妥善处理醛类和乙醇的化学废弃物，以及关键耗材的缺乏和技术本身的局限性。应提前充分检查材料，例如溅射镀膜仪用的金靶盘和临界点干燥仪用的CO2钢瓶。若持续使用，实验室需储备多个此类物品，最终将增加成本。由于个别研究人员往往难以承担此类耗材维护所产生的费用，或其本身并不需要持续使用扫描电镜，目前这些操作通常在提供外...

在生物学中，扫描电子显微镜（SEM）已被广泛应用于结构演化、比较形态学、器官发育以及种群或物种特征的研究1. 由于其对微观结构提供二维视图，自20世纪下半叶以来，微形态学和分类学等领域受益于扫描电镜（SEM）技术的进步th 世纪。例如，20世纪70年代引入的溅射镀膜技术使得对茎尖和花朵等精细材料的观察成为可能，从而改善了非导电组织的成像效果2,3扫描电子显微镜利用从样品表面激发出的电子，在高真空环境中重现样品的表面形貌。4.
涉及扫描电子显微镜（SEM）的研究主要集中在结构特征的推断以及生长过程的重建。通过SEM观察，已发现大量与多种生物分类学和系统学相关的新结构特征。例如，用于物种鉴定或种上分类的植物性状，如木材的具缘纹孔5、柱头多样性6、蜜腺和花部形态7、8、毛状体细微结构9以及花粉粒特征10、11，若无SEM则难以清晰观察。此外，常规SEM也已成功应用于长期福尔马林固定的生物样本12和植物标本馆标本的观察13。
另一方面，利用扫描电镜研究生长过程重建涉及广泛的主题，例如器官发育14、细菌诱导的感染15、植物根系生理学16、寄生生物与宿主的附着机制17,18、药物对寄生生物的影响19、霉菌寄生与抗生作用20,21、生长畸形22、野生型与突变个体的比较发育23，以及完整的生活史周期24。尽管环境扫描电子显微镜（ESEM）25在观察生长过程中湿润生物样品方面可能具有重要优势，但即使在ESEM的低真空条件下，精细材料仍可能受损，因此需要进行充分处理，以避免丧失有价值的形态学观察信息。
本文综述了针对三类不同样品进行扫描电镜（SEM）观察的具体实验方案：花分生组织、卵菌（Saprolegnia）以及真菌材料。这些方案总结了我们以往基于扫描电镜研究的实践经验26,27,28,29,30,31,32,33，其中发现了特定的技术难点及相应的替代解决方案。在植物比较发育与结构研究领域，扫描电镜的应用始于20世纪70年代34,35，自此研究人员发现某些花部特征比此前认为的更具可变性36。花发育过程的重建需要获取从幼嫩花分生组织到开花期之间的所有发育阶段图像。为实现这一目标，样品的表面形貌和细胞壁完整性在固定及后续脱水处理后必须保持完好无损。幼嫩的花分生组织尤其容易发生细胞壁塌陷（图1a, 1b）。类似地，蜜腺、花瓣、柱头和孢子囊等精细结构也需要高效且无损伤的处理方案。本综述总结了一套优化的实验流程，以确保幼嫩且脆弱的组织在扫描电镜成像中保持完整。
在卵菌纲（Oomycetes，属于茸鞭生物界 Stramenopiles）中——这是寄生生物中多样性最高且分布最广的类群之一，其宿主范围涵盖微生物、植物以及无脊椎动物和脊椎动物37- 孢子在湿润环境中生长和发育。这种条件对扫描电镜观察构成挑战，因为孢子需要一种不适合标准扫描电镜流程的适宜基质。在卵菌中，物种的 水霉菌 因其可导致水产养殖、渔业和两栖动物种群数量严重下降而备受关注38微形态学特征，例如包囊的钩状刺，已被发现可用于鉴定以下物种： 水霉菌， 这对于建立感染控制和潜在治疗方法至关重要39. 本实验方案旨在比较囊肿在不同基质上棘状突起的生长模式，并对样品进行临界点干燥（CPD）处理，以备后续扫描电镜（SEM）观察。
在第三种情况下，对真菌Phellorinia herculanea f. stellata f. nova（Agaricales）的孢子进行检查后获得了一些有趣的发现31。在观察孢子的同时，扫描电镜（SEM）下还发现了一组意料之外的护育细胞。采用以往的传统方法和未经处理的样品时，这些护育细胞完全塌陷（图1c）。而通过对本文所述的标准方法进行简单但关键的改进，即可进一步推断与孢子相关的特定组织结构（图1d）。
本文综述了可用于解决被子植物、卵菌和伞菌目在扫描电镜观察中所遇到不同问题的详细扫描电镜（SEM）实验方案，例如细胞塌陷和分生组织收缩、孢囊刺生长不理想以及短暂性组织破坏等问题。
<img alt="用于形态学分析的具有不同表面纹理的花粉粒的扫描电镜显微照片。" src="/files/ftp_upload/55031/55031fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1：未经（a, c）和经过（b, d）FAA-乙醇-临界点干燥（CPD）处理的样品比较。（a-b）Anacyclus clavatus 花蕾，处于中期发育阶段。经四氧化锇处理的花蕾46（a）与经FAA-CPD方案处理的花蕾（b）。（c-d）携带Phellorinia herculanea f. stellata 孢子的营养细胞。未经任何处理的干燥样品（c）与采用本文所述Agaricales目真菌处理方案的样品（d）。孢子呈橙色。比例尺：(a-b) 100 µm，(c-d) 50 µm。照片由Y. Ruiz-León拍摄。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55031/55031fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>乙酸</td><td>无特定供应商</td><td></td><td>皮肤刺激，眼睛刺激</td></tr><tr><td>铝制样品台</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>16221</td><td>www.tedpella.com</td></tr><tr><td>离心管</td><td>无特定供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>临界点干燥仪</td><td>Polaron Quatum Technologies</td><td>CPD7501</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Merck</td><td>1,083,421,000</td><td></td></tr><tr><td>双面透明胶带</td><td>无特定供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>无特定供应商</td><td></td><td>易燃</td></tr><tr><td>欧洲细菌学琼脂</td><td>Conda</td><td>1800.00</td><td>www.condalab.com</td></tr><tr><td>滤纸</td><td>无特定供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>无特定供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4% 甲醛</td><td>无特定供应商</td><td></td><td>有害，急性毒性，皮肤致敏性，致癌性。易燃</td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>无特定供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃密封容器&amp;nbsp;</td><td>无特定供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25% 戊二醛 DC 253857.1611&amp;nbsp; (L)</td><td>Dismadel S.L.</td><td>3336</td><td>www.dismadel.com</td></tr><tr><td>真菌蛋白胨</td><td>Conda</td><td>1922.00</td><td>www.condalab.com</td></tr><tr><td>针头</td><td>无特定供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>无特定供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>塑料容器</td><td>无特定供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>临界点干燥仪用带盖样品架&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>4591</td><td>www.tedpella.com</td></tr><tr><td>手术刀</td><td>无特定供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>扫描电子显微镜</td><td>日立</td><td>S3000N</td><td></td></tr><tr><td>扫描电镜软件</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>溶液 A：NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>溶液 B：Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>样品载台</td><td>无特定供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>溅射镀膜仪</td><td>Balzers</td><td>SCD 004</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>无特定供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>透射电子显微镜 (TEM) 载网</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>G200 (方格网)</td><td>www.emsdiassum.com</td></tr><tr><td>镊子</td><td>无特定供应商</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

扫描电镜（sem）用于难处理的植物、卵菌和真菌样品的实验方案

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

在使用扫描电子显微镜（SEM）进行观察时，生物样品制备过程中常见的问题包括细胞塌陷、来自湿润微环境的样品处理以及细胞破坏。本文以幼嫩的花组织、卵菌囊泡和真菌孢子（伞菌目）为例，介绍针对脆弱样品的特定制备方案，以克服在SEM成像过程中样品处理所面临的主要挑战。
使用 FAA（甲醛-醋酸-酒精）固定并经临界点干燥仪（CPD）处理的花分生组织未出现细胞壁塌陷或器官变形。这些结果对于花发育过程的重建至关重要。采用基于 CPD 的类似方法处理来自湿润微环境的样本（如戊二醛固定的卵菌囊孢），是检测不同基质上诊断性特征（例如，囊孢刺）差异生长的理想方案。在经过再水化、脱水及 CPD 处理后，附着于真菌孢子的助细胞未发生破坏，这对于后续开展这些细胞的功能研究具有重要意义。
本文所述方案为获取高质量图像以重建生长过程并研究诊断特征提供了低成本且快速的替代方法。

花的发育及发育中和完全形成植物结构的固定
采用本文所述的 FAA-CPD 方法，可对幼嫩和成熟的植物组织进行最佳的固定和脱水处理，以用于扫描电镜观察。由于芽的表面形貌和形状未受到细胞收缩的扭曲影响，因此可对花部发育等过程进行重建（图 1b、1d、4a-f）。具有复杂形态的结构可成功覆盖一层均匀的导电材料（溅射镀膜仪中的金属），从而获取原本难以观察到的细节（图 4g-I、5e）。对于来自湿润微环境的样品，若脱水和镀膜处理不当，以往在电子束流下易发生过度充电，而如今也可获得高质量图像（图 4f、5a、5b）。关键的细微结构，如花粉壁表面（图 5b、5c）以及不同类型的表皮毛被（图 5d-g），均可在无伪影或非理想颗粒干扰、无形态扭曲的情况下进行深入研究。
<p class="jove_...

在扫描电子显微镜观察的生物样品制备过程中，存在的问题包括细胞塌陷、来自湿润微环境的样品处理以及细胞破坏。本文汇编并详细描述了适用于制备具有挑战性样品（如花分生组织、卵菌囊、真菌（伞菌目））的低成本且相对快速的实验方案。

扫描电镜（SEM）用于难处理的植物、卵菌和真菌样品的实验方案

扫描电子显微镜（SEM）观察生物样品制备过程中的常见问题包括细胞塌陷、处理……

本方法学的目标是对植物、卵菌和真菌的 delicate 组织进行处理，以实现其在扫描电子显微镜（SEM）下的最佳观察。该方法有助于回答有关各类真菌、微生物、形态特征，以及它们如何侵染、定殖和附着于宿主的问题。我们改进后的方法学技术适用于样本的固定，尤其适用于水生生态系统中微生物的研究。该技术的主要优势在于，它使我们能够利用成本较低且易于获取的资源来观察感染过程中的关键方面。本方法的可视化演示至关重要，因为其操作步骤相较于传统方案已进行了大量修改，而已发表的方法通常仅描述了大致流程，缺乏细节。首先，在配备醛类过滤装置的通风橱内配制福尔马林-乙酸-乙醇（FAA）固定液。配制比例为：85份70%变性乙醇、10份60%甲醛溶液和5份冰醋酸。在通风橱内，将FAA储备液分装至各个容器中。选择要固定的花芽或营养分生组织，确保其未受到昆虫、真菌或极端天气条件的损伤。剪下枝条，去除不需要的组织，并立即将样品放入FAA固定液中。72至96小时后，将FAA溶液倒入塑料容器中进行化学废弃物处理。立即用新鲜的70%乙醇将样品清洗三次，以去除任何残留的FAA。固定后的材料可无限期地保存在70%乙醇中。将样品解剖至盛有乙醇的培养皿中，以防止组织干燥。使用培养皿，其底部覆盖一层干燥的黑色硅胶，以便更清楚地观察呈对比色的白色组织。将组织转移至不同的容器中，然后将其浸入盛有70%乙醇的培养皿内。盖上容器盖子，并将其放入装有足量70%乙醇的塑料离心管中。将解剖后的材料通过密封罐或离心管中的乙醇系列进行转移。每种溶液中至少放置一小时。然后在100%乙醇溶液中过夜保存样品。经过乙醇系列处理后，将装有材料的容器转移至临界点干燥仪（CPD）。在扫描电镜样品台下方写上样品编号。然后用双面胶带覆盖样品 stub 的顶部。将样品 stub 放入样品台中。在体视显微镜下，小心打开盛有经临界点干燥（CPD）处理后已干燥的幼嫩样品的容器。需要注意的是，经过 CPD 处理后，样品会变轻且对静电敏感。取出样品后立即关闭容器，以避免灰尘或杂质进入。将样品放置在载 stub 的粘性表面时，应提前规划好所需位置。一旦样品接触到表面，便很难再将其移除。此时不要尝试进行大型解剖操作，只需去除容易拾取的多余组织即可。对于孢粉学研究，需解剖花药并将其打开，使花粉暴露在花药残端上。将样品置于含硅胶的密闭容器中过夜保护，以防重新吸水。按照文本方案所述，使用喷点仪对样品进行镀膜处理，并将其转移至扫描电镜。为检测不同培养皿中囊胞刺突的差异性生长，将0.5毫升次级囊胞悬液分别接种到不同表面上。表面可包括碳、金和铜的透射电子显微镜载网，以及先前使用的漂白三文鱼和无须鳕鱼鳞片和玻璃盖玻片。将包囊在20摄氏度下孵育70分钟，以促进包囊附着于表面。吸去液体，向每个表面加入0.5毫升2%戊二醛以固定包囊。将样品置于通风橱内室温下保存1小时。去除戊二醛，并通过乙醇系列对样品进行脱水，每种乙醇溶液各加入5毫升，作用15分钟。将样品置于最后一次的100%乙醇溶液中后，可在密封的培养皿中保存长达一个月。小心地将载网和标尺从培养皿转移至适合临界点干燥仪（CPD）使用的样品 holder 中，确保样品彼此分离，例如使用CPD专用载网 holder 或堆叠式样品 holder。使用镊子夹取载网和标尺时，应注意始终使包囊面朝上。 在进行卵母细胞的扫描电镜样品制备以观察其在不同表面上的行为之前，需按照文本方案中的描述，先使用临界点干燥仪（CPD）对材料进行干燥。将每个样品小心地用滤纸包裹，制成约0.5至1平方厘米大小的信封状，并用铅笔标记。注意不要压碎样品。用回形针将滤纸封好。然后将封装好的样品转移至培养皿中，加入10毫升水浸泡，以使孢子周围的组织复水。立即将样品放入微波炉中。一旦水开始蒸发，立即取出材料，并在室温下冷却。然后将样品通过乙醇系列进行处理。根据样品量的多少，此步骤可使用烧杯或离心管。将样品在每种溶液中放置15分钟。接着，按照文本方案中的描述将样品放入CPD中。为进行扫描电镜观察而制备孢子时，打开信封。然后用载 stub 的黏性表面收集孢子，注意不要压碎。最后，按照文本方案中的详细步骤对样品进行镀金处理并进行扫描电镜观察。图中所示为经四氧化锇处理并采用本视频演示的 FAA CPD 方案制备的刺果毛茛花蕾。图中还展示了未经任何处理的赫氏菲罗里尼亚菌（phellorinia herculanea）干燥样本，以及按照本视频所示方法处理的真菌孢子。该图显示了在扫描电镜（SEM）下观察到的花器官早期、中期和晚期发育阶段。此图像为幼嫩再分裂花序（reh-cim）的顶面视图。图中显示的是雌蕊群分化期间的花芽以及开花期的花朵。某些结构在扫描电镜成像前的固定和保存过程中可能较为困难。例如来自湿润环境的样品，以及具有装饰性结构或毛被的样品。图中展示了寄生水霉（Saprolegnia parasitica）在玻璃、碳、铜、金、无须鳕鱼鳞和鲑鱼鱼鳞表面的菌丝差异性生长模式。本视频展示了寄生水霉的无性生命周期。无性生命周期对于这些生物在水生或潮湿环境中的扩散至关重要。此外，此阶段产生的水霉类寄生物种的游动孢子是感染的主要单位。虽然掌握该技术可在三到五天内完成，但必须正确操作。我们在马德里皇家植物园利用经费完成了用于此时间段内外部使用的扫描电镜（SEM）处理。观看本视频后，研究人员将了解如何有效采集并固定用于扫描电镜（SEM）观察的精细生物材料。通过该方法，可轻松克服细胞破坏、器官变形或来自湿润环境样本保存不良等问题。在进行该操作时，需注意扫描电镜观察仅限于对表面进行高倍放大研究。在进行CPD处理之前，还必须确保样品密封，避免受到剧烈的环境变化以及与空气的直接接触。该技术发展之后，为植物学领域的研究人员探索孢子在感染过程中的结构特征铺平了道路，尤其是在与渔业相关的物种中。完成此操作后，还可进一步采用其他方法，如透射显微镜（TM），以回答更多问题，例如特定器官或细胞、花粉中细胞组成的内部结构是怎样的。请务必注意，操作甲醛和戊二醛可能具有极高危险性，进行本实验操作时，必须采取防护措施，例如在通风橱内操作，并佩戴口罩、实验服和手套。

scanning-electron-microscopy-sem-protocols-for-problematic-plant

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

扫描电子显微镜（SEM）协议有问题的工厂，卵菌和真菌样本

本方案描述了一种在真菌菌丝上培养并利用共聚焦显微镜和电子显微镜对细菌生物膜进行定性分析的新方法。...

一种利用共聚焦显微镜和电子显微镜对丝状真菌菌落上细菌生物膜进行定性多尺度分析的新方法

扫描电子显微镜（SEM）分析是辅助物种鉴定或表型区分的有效方法。本实验方案描述了检测三种代表性生物体特定形态学细节的方法，可广泛适用于多种生物体及组织类型的特征观察。...

用于扫描电子显微镜（SEM）形态学分析的原核与真核生物化学干燥制备

本文介绍了一种结合两种样品处理技术的实验方案：高压冷冻与微波辅助样品处理，随后进行极小树脂包埋，以用于聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）获取数据。本方法以小鼠胫神经样品和Caenorhabditis...

高压冷冻、微波辅助对比度增强及最小树脂包埋的生物样本制备用于体积成像

为了观察昆虫感受器的超微结构，本研究介绍了扫描电镜和透射电镜（SEM 和 TEM）的样品制备方案。在固定液中添加吐温 20 以避免 SEM 样品发生形变。荧光显微镜有助于提高 TEM...

木蛀甲虫附肢的扫描与透射电子显微镜样品制备方法

本文介绍了一种高效结合连续块面扫描与聚焦离子束扫描电子显微镜的技术方案，用于定位目标区域。该方法可在大视野范围内实现三维空间中稀有事件的高效搜索与精确定位。...

利用连续块面扫描与聚焦离子束扫描电子显微镜进行的靶向研究

本文介绍了利用扫描电子显微镜（SEM）成像精细组织样本的详细处理方案。针对坚硬的蛋壳、早期发育阶段的胚胎以及真菌培养物，分别描述了三种不同的处理方法：六甲基二硅氮烷（HMDS）化学干燥法、简单的空气干燥法和临界点干燥法。...

胚胎、卵壳及真菌培养物的扫描电子显微镜制样

微型计算机断层扫描（Micro-CT）是一种非破坏性工具，可用于三维分析植物结构。本实验方案描述了利用微型计算机断层扫描分析寄生植物结构与功能所需的样品制备方法。通过使用不同物种，展示了该方法在结合特定样品制备技术时的优势。...

利用微计算机断层扫描技术分析寄生植物与寄主的相互作用

本实验方案旨在提供收集、固定和保存菌异养植物样品的详细步骤，并应用多种显微技术（如扫描电镜、透射电镜、光学显微镜、共聚焦显微镜和荧光显微镜），以研究菌根真菌在植物组织及经菌根真菌接种萌发的种子中的定殖情况。...

用于解读菌根异养植物组织中真菌定植及种子共生萌发的显微技术

我们提出了一种优化的扫描电子显微镜实验方案，用于观察包含植物和真菌生物量以及微生物群和生物膜的高度异质且脆弱的样品。该方案可用于描述微生物群空间结构的维度特征。...

切叶蚁菌圃的微生物群落：通过扫描电子显微镜可视化微生物景观

获得高质量的透射电子显微镜图像具有挑战性，尤其是在植物细胞中，因其含有大量充满水的液泡和通气空间。串联的高压冷冻与快速冷冻置换技术可显著缩短植物样品透射电镜制样的时间，同时获得超微结构保存极为良好的样品。...

植物组织的串联高压冷冻与快速冷冻置换透射电子显微镜制样技术

学习扫描电子显微镜样本制备方法，用于植物、卵菌和真菌的精细组织观察。该改进方案解决了细胞塌陷和样本损伤问题，帮助研究人员清晰观察感染过程的关键细节。

扫描电镜（SEM）用于难处理的植物、卵菌和真菌样品的实验方案

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