扫描电子显微镜（SEM）协议有问题的工厂，卵菌和真菌样本

该方法的目标是处理来自植物、卵菌和真菌的脆弱组织，以便在扫描电子显微镜 （SEM） 下进行最佳观察。这种方法可以帮助我们回答有关几乎任何真菌、微生物、微生物以及它们如何感染、定植和附着在宿主上的问题。我们改进的方法中的技术是用于固定样品，用于水生生态系统中的 mi-toh-mins。

这种技术的主要优点是它允许我们使用昂贵且容易获得的资源来可视化感染的关键方面。这种方法的可视化演示至关重要，因为这些步骤已从传统方案中进行了大量修改。而已发布的方法描述的是一般过程，但没有细节。

首先，在装有醛过滤器的通风橱中准备福尔莫和醋醇或 FAA 固定剂。85份70%变性乙醇，10份60%甲醛溶液，5份冰醋酸。在通风柜下，将 FAA 的原料倒入单独的容器中。

选择要固定的花或营养分生组织，确保它们不会受到昆虫、真菌或极端天气条件的损害。剪下树枝，去除不需要的材料，并立即将样品沉积在 FAA 溶液中。72 到 96 小时后，将 FAA 倒入塑料容器中进行化学处理。

立即用新鲜的 70% 乙醇洗涤样品 3 次，以去除任何残留的 FAA。固定材料可在 70% 乙醇中无限期储存。将样品解剖到覆盖有乙醇的培养皿中，以防止组织干燥。

使用培养皿，底座覆盖有干燥的黑色硅胶，以更好地看到对比鲜明的白色组织。将组织转移到单独的容器中，然后将它们浸入含有 70% 乙醇的培养皿中。盖上容器的盖子，将它们放入装有大量 70% 乙醇的塑料离心管中。

密封罐或离心管中通过乙醇系列转移解剖的材料。将样品在每种溶液中放置至少 1 小时。然后将样品在 100% 乙醇溶液中放置过夜。

按照乙醇系列，将装有材料的容器转移到 CPD。在 SEM 样品架下方写下样品识别号。然后用双面胶带覆盖存根的顶部。

将存根放入样品架中。在体视显微镜下，小心地打开装有已在 CPD 中干燥的年轻而精致的样品的容器。请记住，经过 CPD 处理后，样品会变得更轻并且对静电敏感。

取出样品后，请关闭容器，以避免灰尘或杂质。将样品放在存根的粘性表面上，提前规划所需的位置。一旦样品接触到表面，就很难去除它们。

此时不要尝试进行重大解剖。只需去除容易拾取的不需要的组织即可。对于古生物学研究，解剖花药并打开它们以暴露存根上的花粉。

将样品保存在装有硅胶的密封容器中过夜，以避免再水化。使用点样涂布机包被样品，并按照文本协议中的说明将它们转移到 SEM 中。为了在单独的培养皿上测试囊肿棘的差异生长，将 0.5 毫升次级囊肿悬液放在不同的表面上。

表面可以包括碳、金和铜透射电子显微镜网格。以前，漂白的鲑鱼和鳕鱼鳞片以及玻璃盖玻片。将囊肿在 20 摄氏度下孵育 70 分钟，这有利于囊肿附着在表面。

取出液体，向每个表面加入 0.5 毫升 2% 戊二醛以固定囊肿。将样品在室温下放在通风柜中放置 1 小时。去除戊二醛，并通过乙醇系列使样品脱水，每种乙醇溶液加入 5 mL，持续 15 分钟。

一旦进入最后的 100% 乙醇溶液，样品可以在密封的培养皿中储存长达一个月。小心地将网格和刻度从培养皿转移到适合 CPD 的支架上，以保持样品彼此分离，例如 CPD 网格支架或堆叠样品支架。用镊子拿起网格和秤，记住囊肿应该始终朝上放在网格上。

对卵母细胞进行 SEM 样品制备之前，继续使用 CPD 干燥材料，以观察它们在不同表面上的行为，如文本协议中所述。用滤纸小心地包裹每个样品，形成大约 0.5 到 1 平方厘米的铅笔标记信封。注意不要压碎样品。

用回形针密封滤纸。然后将填充的样品转移到培养皿中，并将其浸入 10 毫升水中，以使孢子周围的组织再水化。立即将样品放入微波炉中。

一旦水开始蒸发，就去除材料，并让它在室温下冷却。然后将样品通过乙醇系列。根据样品量，使用烧杯或离心管进行此步骤。

将样品在每种溶液中放置 15 分钟。接下来，按照文本协议中的说明将样品放入 CPD 中。要安装孢子进行 SEM 观察，请打开信封。

然后用存根的粘性表面收集孢子，注意不要压碎它们。最后，按照文本协议中的详细说明对样品进行镀金和 SEM 观察。这里显示的是用四氧化锇处理并使用本视频中演示的 FAA CPD 方案制备的 Anacyclus clavatus 的花芽。

还显示了未经任何处理的 phellorinia herculanea 的干燥样品，以及本视频中所示处理的真菌孢子。该图说明了在 SEM 下捕获的早期、中期和晚期花卉发育。这张图片是一只年轻的 reh-cim 的俯视图。

这里显示的是雌科分化过程中的花芽和开花时的花。有些结构可能难以固定和保存，以便在 SEM 下成像。示例包括来自潮湿环境的结构，以及带有装饰物的结构，以及带有内膜的结构。

这里显示的是寄生沙霉刺在玻璃、碳、铜、金、无须鳕鳞片和鲑鱼鳞片上的差异生长模式。这是一段视频，展示了 saprolegnia parasitica 的无性生命周期。无性生命周期对于这些生物体在其水生或潮湿环境中的传播很重要。

此外，在这个阶段产生的动物园粪便代表了 saprolegnals 目寄生物种的主要感染单位。虽然掌握这项技术可以在三到五天内完成，但它是正确执行的。我们用钱在这段时间内在马德里皇家植物园完成了提供给外部使用的 SEM 疗法。

观看此视频后，研究人员将了解如何有效地收集和固定精细的生物材料以进行 SEM 观察。该程序可以轻松克服细胞破坏、器官扭曲或潮湿环境中样品保存不良。在尝试此程序时，重要的是要记住，通过 SEM 进行的观察仅限于表面的高倍率研究。

此外，在 CPD 处理之前，必须保护密封件免受冲击变化和与空气直接接触。发展后，这项技术为植物学领域的研究人员探索感染过程中的孢子结构铺平了道路，特别是在渔业感兴趣的物种中。按照此程序，可以执行其他方法，如透射显微镜或 TM 来回答其他问题，例如细胞组成的内部结构如何在特定器官或细胞或花粉中。

不要忘记，作福尔马林和戊二醛可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如在通风柜下工作和使用口罩、实验服和手套。