拟南芥花器官和角果的全装清和染色

在本议定书中, 我们描述了适当解剖拟南芥花和角果的技术, 一些基本的清洁技术, 以及对生殖结构的全装观察的染色程序。

该协议描述了如何正确解剖花蕾、花和年轻的角果。以及随后的整装透明化，用于各种染色和观察技术。这种方法可以帮助回答性植物生产领域的关键问题。

例如稳定突变分析或任何环境和实验诱导的花发育和功能失败。该技术的主要优点是可以同时轻松快速地筛选许多发育阶段。这种方法的视觉演示至关重要，因为花器官解剖步骤很难学习，因为它们需要花解剖学和解剖技能的先验知识。

首先，用小剪刀从同步植物上去除花朵。并立即将它们放入含有适当固定剂的单个微量离心管中。接下来，去除固定剂并加入足够的 70% 乙醇以完全覆盖样品。

将样品放回 4 摄氏度至少 24 小时。然后用新鲜制备的 70% 乙醇装满制表师的玻璃杯，并将其放入一个小培养皿中作为支撑。然后将花序放入制表师的玻璃杯中，确保它完全被乙醇覆盖。

使用镊子和装有针头的注射器，在立体显微镜下通过撕开萼片、花瓣和雄蕊来解剖花朵。然后将制表师的玻璃杯放在一边，使用载玻片进行最后的解剖。将样品移至玻片上，加入 10 微升新鲜制备的 70% 乙醇。

在腕骨的每一侧进行切割，根据需要旋转它。然后轻轻地取下瓣膜以露出胚珠。做一个锋利的小切口，从容器中分离出一半的传输组织，然后用镊子和针头撕开两半。

去除柱头样式和带有尖锐切口的花梗。使用镊子和针轻轻翻转并排列仍然附着的胚珠，以获得两排平行的胚珠。使用一小块印迹纸从载玻片上的样品中去除乙醇。

然后在载玻片中加入 20 微升的透明溶液。使用一对带有皮下注射针头的注射器定位标本并去除任何残留的气泡。接下来，轻轻地将盖玻片放在载玻片上，等待清除溶液填满盖玻片和样品之间的空间。

将玻片放入玻片支架中，并将其放在通风橱下。因此，让我们来看看刚收获的花蕾，它们即将与非开裂的花药一起开放。然后准备一个 96 孔板，加入足够的亚历山大溶液以完全浸没花蕾。

去除萼片和花瓣，露出花药，然后将它们浸入亚历山大溶液中。让板在通风橱下放置 1 到 3 小时。然后用 Herr 的四分半溶液替换 Alexander 溶液，并在通风橱下孵育板过夜。

第二天，用镊子小心地将清除的芽移动到新的载玻片上。接下来，解剖雄蕊并从样品中取出所有其他组织。然后使用 Herr 的四种半溶液进行基于水合氯醛的透明化和联合透明化染色。

首先将花朵从制表师的玻璃杯中移到载玻片上，并使用吸墨纸去除多余的乙醇。添加 5 至 10 微升 DAPI 溶液。使用两个带有皮下注射针头的注射器，解剖雄蕊并去除所有其他花器官。

然后将花粉粒释放到 DAPI 溶液中。从载玻片上清除雄蕊上的所有碎屑，确保载玻片上只留下花粉粒。从载玻片中去除所有雄蕊碎片是去除外显子的最关键步骤。

在载玻片和盖玻片之间只应留有花粉粒。接下来，将盖玻片放在带有样品的载玻片上，并添加填充载玻片和盖玻片之间空间所需的最少量的 DAPI 溶液。将食指轻轻放在盖玻片上，然后快速短促地滑动。

将玻片放入人盒中，在 4 摄氏度的黑暗中放置至少 15 分钟。然后在 24 小时内在宽视野荧光或共聚焦显微镜下观察载玻片。将解剖的样品从制表师的玻璃杯中移到玻璃板上，玻璃板的腔体中填充有 1% SDS 和 0.2 氢氧化钠溶液。

在室温下孵育过夜。SDS 氢氧化钠溶液可快速清除样品，使其在几分钟内呈现透明状态。用水仔细冲洗样品，并将其放在干净的载玻片上。

然后向载玻片中加入 20 至 40 μL 染色液。根据要分析的花器官和研究人员的技能，这种 DS 处理可以在解剖步骤之前、经验丰富的研究人员或解剖步骤之后进行，对于经验不足的研究人员。接下来，将盖玻片放在载玻片上，注意不要压碎制剂。

然后将所有准备好的玻片放入覆盖有铝箔的人盒中，并在 4 摄氏度下孵育 1 小时。最后，在宽视场荧光或共聚焦显微镜下观察标本。按照方案中描述的解剖程序，去除可能阻碍观察的不必要组织并获得更详细的图像。

根据目标的不同，水合氯醛染色可用于表征整个花芽水平的早期花发育、花药中的减数分裂和微 gomedal 发生、早期胚珠发育和大孢子母细胞的规范、雌性 go-med-ified 发育，甚至花粉管侵入中心网格。结合 Alexander 染色和 Herr 的 4.5 清除，能够评估给定腔室或整个花药内的花粉败育。虽然活的花粉粒显示红色的细胞质，但流产的花粉粒显示空的细胞质，最终它们的形状不规则并完全压碎。

去除外显子会导致细胞核的染色强度增加，染色质组织的细节增加。染色前使用 SDS 氢氧化钠透明化使花序透明。并导致花组织内胼胝质的染色更高。

它揭示了通常难以看到的胼胝质积累。例如将生成细胞与营养细胞分开的 Callose 层。即使花粉粒仍然包含在花药中。

一旦掌握了这些技术，如果执行得当，可以在 48 小时内完成。在尝试此程序时，重要的是要记住，结果在很大程度上取决于良好的样品制备，例如使用适当的固定剂、正确进行解剖以及在载玻片上分离感兴趣的组织。