Name: 拟南芥花器官和角果的全装清和染色 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: 学习拟南芥花器官和角果的解剖与全装清染色技术，用于植物生殖生物学研究。该方法支持突变体分析和花发育功能研究，可快速筛选多个发育阶段。

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本工作由苏黎世大学、欧盟居里国际研修奖学金（A.H. 获资助编号 TransEpigen-254797）、欧洲研究理事会高级资助（U.G. 获资助编号 MEDEA-250358）以及瑞士系统生物学计划 SystemsX.ch 的研究与技术开发项目（U.G. 获资助 MecanX）资助。

1. 花朵和角果的固定
<ol>
	<li>在首朵花开放时同步采集植株的花和角果。 
	注意：在本实验所用条件下，植株从Murashige和Skoog（MS）培养基平板移栽至土壤后约21天开始开花。种子在4 °C下层积处理3–4天，随后在22 °C、16小时光照/18 °C、8小时黑暗条件下于MS平板上萌发并生长8至10天，之后将幼苗移栽至盆中富含养分的土壤，并在相同环境条件下继续培养（图1）。重复次数取决于具体研究目的，但建议每处理至少使用5个花序（来自5株独立植株）。若以花为实验单位，建议每个重复至少包含10朵花。</li>
	<li>使用小型剪刀（例如，指甲剪）剪下花序或花（图1E-H），并立即放入含有新鲜配制的Carnoy固定液、甲醇/乙酸或FPA50固定液（根据应用选择，见下文）的微量离心管（用于单个花序/花固定）或锥形管（用于批量固定）中，并置于冰上。 
	注意：样品应完全浸没于固定液中。</li>
	<li>将组织在固定液中于4 °C下固定4小时至过夜。 
	注意：可采用真空渗透以加快固定液进入组织的速度，但这可能不利于组织结构的保存。作者未采用真空渗透法。</li>
	<li>移除固定液，加入足量70%乙醇覆盖样品，并于4 °C下保存至少24小时；样品可无限期保存于此溶液中。去除乙醇后应立即进行下一步操作，即解剖或SDS透明处理。</li>
</ol>
2. 体视显微镜下的解剖
<ol>
	<li>将新配制的70%乙醇放入置于小型培养皿上作为支撑的钟表匠玻璃皿中。</li>
	<li>将花序/花/角果放置于新配制的固定液中，并使用镊子和带针头的注射器在体视显微镜下进行解剖。
	<ol>
		<li>建议使用钟表匠玻璃皿或类似装置，使样品在解剖花序以及撕开成熟花朵的花部器官（此时可解剖萼片、花瓣和雄蕊）时能完全浸没于乙醇中，以避免样品干燥的风险。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在载玻片上解剖角果和小花蕾，具体操作如下所述。
	<ol>
		<li>将装有预处理样品的钟表匠玻璃皿暂放一旁，使用普通载玻片进行最终解剖。</li>
		<li>将目标样品转移至载玻片上，并加入10 µL新鲜的70%乙醇。迅速完成最终解剖操作，必要时可再添加10 µL乙醇，以保持样品湿润但避免液体过多。</li>
		<li>若需从雄蕊中释放花粉粒，请参见步骤5.1。若需解剖雌蕊和胚珠，请遵循图2中所述的操作流程。该流程适用于雌蕊发育的所有阶段，包括绿色角果的发育阶段。 
		注意：若样品转移时已带有足量乙醇，则无需额外添加；在极少量液体中操作可使微小样品的解剖更为简便。载玻片上应始终仅保留目标器官（萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊、胚珠、种子或花粉粒）。此操作可确保载玻片与盖玻片之间具有均匀的厚度，该厚度与待观察器官的厚度一致，从而提高显微观察的均一性与效率（使更多目标样本处于同一焦平面内）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用一小块吸水纸尽可能吸除并去除乙醇。在样品干燥前，迅速进入下一步操作（第3、4或6节）。</li>
</ol>
3. 基于水合氯醛的透明化与联合透明-染色法
注意：使用 FPA50 固定的样本可获得基于水合氯醛透明化方法的最佳效果。
<ol>
	<li>在载有样本的载玻片上加入 20 µL 透明溶液（水合氯醛/甘油、改良的霍耶氏介质、Herr's 4½ 或 Herr's IKI-4½ 溶液）。使用带有皮下注射针头的两个注射器，通过减小样本之间的间距以及翻转器官朝下的样本，将样本调整至所需位置。用针头去除任何残留的气泡。</li>
	<li>将盖玻片从一侧缓缓放下并轻轻放置，极轻地按压，等待透明溶液充满其间隙。如有需要，可添加少量透明溶液，以完全填充盖玻片下方的空间。</li>
	<li>将载玻片置于玻片架上，并放置于通风橱内。至少等待 4 小时后开始显微观察，观察可在随后的 4–5 天内进行。</li>
</ol>
4. 花药的联合亚历山大染色与赫尔氏4½透明法
注意：原始的Alexander染色法是在染色前将花粉粒释放到载玻片上。一种更高效且信息更丰富的改良Alexander染色与透明方法，是在成熟但尚未开裂的花药内对成熟的花粉粒进行染色。
<ol>
	<li>选择即将开放且花药未开裂的新鲜花蕾。 
	注意：不要选用较年轻的花蕾，因为亚历山大染色法适用于成熟花粉粒，对未成熟花粉粒染色效果不佳。建议每种处理至少采集来自不同植株和花序的5朵花。</li>
	<li>在96孔板中加入足量的亚历山大溶液，以浸没花蕾。去除萼片和花瓣以暴露花药，并将其浸入亚历山大溶液中。将样品置于通风橱内孵育1–3小时。</li>
	<li>用Herr's 4½溶液替换亚历山大溶液，并将多孔板重新放回通风橱中过夜孵育。</li>
	<li>用镊子将透明处理后的花蕾轻轻转移至新的载玻片上。由于可能残留少量亚历山大溶液，需使用吸水纸尽可能吸除残留的透明溶液。</li>
	<li>解剖雄蕊并去除其他所有组织。随后按照第3节中的步骤使用Herr's 4½溶液进行操作。</li>
</ol>
5. 去除花粉粒的外壁
注意：我们建议使用 Carnoy 固定剂进行 DAPI 染色。
<ol>
	<li>按照第1和第2节所述的固定和解剖步骤操作。此时，载玻片上应已保留有一枚或多枚雄蕊，且浸泡在少量70%乙醇中。</li>
	<li>使用吸水纸除去多余的乙醇，加入 5–10 µL DAPI 溶液。用几支带针头的注射器将花粉粒释放到该少量溶液中（例如，用一支注射器固定雄蕊，另一支释放花粉粒）。若溶液变干，再加入 5 µL DAPI。</li>
	<li>去除花药的所有残渣是关键步骤，以确保载玻片和盖玻片之间仅留下花粉粒。</li>
	<li>将盖玻片从一侧缓缓放下，覆盖在载有样本的载玻片上，加入刚好填满间隙所需的最小量 DAPI 溶液。用食指轻压盖玻片，适度用力，快速而短暂地滑动一次，避免过度挤压。 
	注意：为确定滑动操作所需的力量和幅度，应多次练习此步骤，并每次在显微镜下检查结果。</li>
	<li>如有需要，加入 DAPI 溶液，将载玻片置于避光、4 °C 的湿盒中孵育 15 分钟至 1 小时。在 24 小时内使用宽场荧光显微镜或共聚焦显微镜观察样品。可尝试将此步骤与 SDS 透明化处理结合，以检测是否可获得进一步优化效果。</li>
</ol>
6. 十二烷基硫酸钠（SDS）透明处理
注意：根据待分析的花器官以及研究者解剖非常柔软且微小样本的技术水平，SDS 处理可在甲醇-醋酸固定材料的解剖步骤之前（适用于有经验的研究者）或之后（适用于经验较少的研究者）进行。
<ol>
	<li>使用钟表匠玻璃皿、凹面载玻片或微量离心管，在室温下将已解剖或未解剖的样本于1% SDS和0.2 N NaOH溶液中孵育过夜。</li>
	<li>小心操作，因为样品非常柔软且呈透明状。用水冲洗数次。 
	注意：加入染色液时，SDS 溶液的残留物可能导致沉淀产生。 例如，苯胺蓝。</li>
	<li>对于未解剖的样品，按照第2节中所述的解剖步骤操作，使用水代替70%乙醇。解剖出目标组织后，去除任何残留物和碎片，并用吸水纸吸去多余水分，然后加入20–40 µL染色液，接着进行步骤6.5。</li>
	<li>对于已解剖的样本，小心地将样本从洗涤液中转移至洁净的载玻片上，并加入 20–40 µL 染色液。</li>
	<li>轻轻将盖玻片从一侧缓缓放下，覆盖在载玻片上。注意不要压碎标本。如果组织过于柔软，可在盖玻片的四角处放置薄片隔物，置于载玻片与盖玻片之间例如，胶带或破损的盖玻片），在载玻片与盖玻片之间形成类似腔室的空间，以防止盖玻片压碎样本。</li>
	<li>将所有载玻片放入湿盒中，用铝箔纸包裹，于4 °C孵育至少1小时。在24小时内使用宽场荧光显微镜或共聚焦显微镜观察样本。</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

单个花序中存在多个花芽 拟南芥，涵盖花发育的所有阶段，为研究处理效应或发育特征在花发育不同阶段的同步表现提供了独特的机会。不同个体植株之间的良好参照点是主花序第一朵花的开放。植株应以尽可能同步开花的方式进行处理（例如，4 °C下层积处理3–4天可最大程度地实现种子同步萌发，从而获得更整齐的开花时间），仅将同一天开放第一朵花的植株作为同一批次用于不同处理和重复之间的分配；连续数天内准备就绪的批次可用于实验的重复。通过该流程，可进行更为可靠的比较分析，有效控制植株内外部环境与发育差异带来的影响。
结合卢戈氏碘液染色与Herr的透明溶液，不仅使透明样品的对比度较传统透明溶液有所提升，而且能够表征花和胚胎发育过程中淀粉的动态变化，这一点在最近关于Arabidopsis46的研究中已有报道。通过这一简单方法，我们揭示了花药发育过程中存在新一轮的淀粉合成-降解波动，并将淀粉动态变化与编码参与糖和淀粉代谢蛋白的基因表达整体变化相关联。分析表明，GPT6是将细胞质中的糖磷酸转运至淀粉体以合成淀粉的...

花是被子植物最重要的界定器官之一。开花植物大约在9000万至1.3亿年前出现1，其快速多样化使得其突然出现曾被查尔斯·达尔文称为“&#34;令人厌恶的谜团&#34;”2。植物研究人员对花发育的研究兴趣广泛多样。一些研究集中于理解花作为一个整体的进化起源，或花特定解剖、结构和功能特性的演化过程3,4,5,6。花形态与结构的高度变异，以及依赖于花的有性与无性繁殖方式，使花成为一种高度复杂的结构。这促使研究人员采用光学和电子显微技术，并结合遗传学与分子生物学手段，对花器官的解剖结构和形态特征进行多种表征尝试7。此外，作为果实和种子的来源，花对人类和动物营养具有至关重要的意义。因此，对花和果实发育过程的解析在应用研究中具有广泛意义，包括为不断增长的人口保障粮食安全，以及在环境变化背景下制定生态保护策略8,9,10。
花发育过程 拟南芥 从花诱导开始，营养分生组织转变为花序（花的集合）分生组织。花原基随后在花序分生组织的侧面启动形成11花器官原基从花的外侧向中心逐轮依次形成，最终发育为萼片、花瓣、雄蕊和心皮7这些花器官具有不同的营养、保护和功能作用（例如，以及在不同植物物种中吸引传粉者等作用，其中雄性和雌性生殖器官分别维持雄配子体和雌配子体的发育12,13配子体进而各自分化出一对雄性配子（精子）和雌性配子（卵细胞和中央细胞），在双受精过程中结合，形成下一代的合子以及初生胚乳。初生胚乳是一种终末组织，可支持胚胎的发育。14,15果实和种子的发育支持胚的生长、成熟和保存，并最终促进其传播。已有大量研究致力于表征多种植物物种中花和胚的发育过程，尤其是在模式物种中 拟南芥7,16,17.
早期对花发育的显微分析依赖于耗时的样品处理与观察技术，例如石蜡或树脂包埋与切片，结合光学显微镜或电子显微镜观察。这些传统显微技术常与分子遗传学研究相结合，例如对突变体的显微分析、RNA定位 原位 杂交或蛋白质的免疫检测。近年来，宽场和共聚焦荧光显微镜技术、先进的三维计算机辅助图像分析方法，以及可用于轻微处理的整体样本的分子技术不断改进，使得人们迫切需要高效且简化的样本处理技术，这些技术更有利于进行定量分析。近年来，在整体动物样本的透明化技术方面已取得显著进展。这些技术通过使用基于尿素或糖类的水溶液试剂使样本透明（例如，SCALE，SeeDB，CUBIC18,19,20，或在将样品包埋于稳定的水凝胶后，通过去垢剂SDS选择性去除脂质；脂质的去除可通过被动扩散实现（例如，改良的 CLARITY 方案21PACT-PARS-RIMS22）或通过电泳主动进行（原始 CLARITY 方案）23 和 ACT-PRESTO24受这一快速进展的鼓舞，一些衍生技术也正在被开发用于植物研究。
本文以模式植物Arabidopsis为重点，介绍了正确解剖花蕾、花朵和幼嫩角果的方法，以及对整体样品进行透明处理以用于多种染色和观察步骤的实验流程，所用透明方法包括传统的或近期基于SDS的透明技术。文中提供了淀粉、胼胝质和染色质染色的实例。尽管这些方法在应用于其他物种时可能需要进一步优化和调整，但我们希望这些简单而关键的技术能为后续研究奠定基础，因为它们是许多研究项目的起点。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂与材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Scharlau</td><td>ET00102500</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Applichem</td><td>A3686,2500</td><td>100% 分子生物学级</td></tr><tr><td>冰乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td>分子生物学级</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Scharlau</td><td>ME03062500</td><td></td></tr><tr><td>甲醛溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>丙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81910-250 ml</td><td></td></tr><tr><td>水合氯醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15307</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Roth</td><td>3783.1</td><td></td></tr><tr><td>阿拉伯胶</td><td>Fluka</td><td>51198</td><td></td></tr><tr><td>乳酸</td><td>Fluka</td><td>69773</td><td></td></tr><tr><td>苯酚</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77607-250ML</td><td>我们使用液态苯酚（使用密度计算溶液所需体积）</td></tr><tr><td>丁香油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8392-100ML</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Roth</td><td>4436.1</td><td></td></tr><tr><td>碘</td><td>Fluka</td><td>57665</td><td></td></tr><tr><td>碘化钾</td><td>Merck</td><td>5043</td><td></td></tr><tr><td>孔雀石绿</td><td>Fluka</td><td>63160</td><td></td></tr><tr><td>酸性品红</td><td>Fluka</td><td>84600</td><td></td></tr><tr><td>橙黄G</td><td>Sigma</td><td>7252</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td>分子生物学级</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71690</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Applichem</td><td>A1047,1000</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763-1KG</td><td></td></tr><tr><td>磷酸钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>04347</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Applichem</td><td>A2937,1000</td><td></td></tr><tr><td>卡氏荧光增白剂</td><td>Sigma</td><td>F6259</td><td>荧光增白剂28</td></tr><tr><td>金胺O</td><td>Chroma</td><td>10120</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>有毒</td></tr><tr><td>吐温X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>苯胺蓝</td><td>Merck</td><td>1275</td><td></td></tr><tr><td>MS培养基</td><td>Carolina</td><td>19-57030</td><td></td></tr><tr><td>营养丰富的基质</td><td>Einheitserde</td><td>ED73</td><td></td></tr><tr><td>钟表匠用玻璃片</td><td></td><td></td><td>无特定品牌</td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>VWR</td><td>62406-200</td><td></td></tr><tr><td>Dumont镊子</td><td>Actimed</td><td>0208-5SPSF-PS</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>DUMONT BIOLOGY</td><td>0108-5</td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td>BD</td><td>BD Plastipak 300013</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>制片针</td><td>BD</td><td>BD Microlance 304000</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Thermo Scientific</td><td>10143562CE</td><td>切边</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Thermo Scientific</td><td>DV40008</td><td></td></tr><tr><td>湿盒</td><td></td><td></td><td>内含湿润纸巾和载玻片支撑架的塑料盒</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;溶液&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;固定液&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>卡诺氏（法默氏）固定液</td><td></td><td></td><td>无水乙醇 : 冰乙酸，3:1（ml:ml）</td></tr><tr><td>甲醇/乙酸固定液</td><td></td><td></td><td>50%（v/v）甲醇，10%（v/v）冰乙酸，溶于去离子水中</td></tr><tr><td>FPA50固定液</td><td></td><td></td><td>甲醛、丙酸、50%乙醇；5:5:90（ml:ml:ml）</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;透明液&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>水合氯醛/甘油</td><td></td><td></td><td>水合氯醛 : 甘油 : 水，8:1:2（g:ml:ml）。可用于所有花发育阶段及角果发育阶段的微分干涉差显微镜（DIC）观察。最佳固定液为基于甲醛的FPA50</td></tr><tr><td>改良Hoyer透明液</td><td></td><td></td><td>阿拉伯胶7.5 g，水合氯醛100 g，甘油5 ml，水30 ml。可用于所有花发育阶段及角果发育阶段的DIC观察。最佳固定液为基于甲醛的FPA50</td></tr><tr><td>Herr's 4&amp;frac12; 透明液</td><td></td><td></td><td>乳酸、水合氯醛、苯酚晶体、丁香油、二甲苯；按重量比2:2:2:2:1混合。可用于所有花发育阶段（尤其适用于雄蕊发育）及角果发育阶段的DIC观察。最佳固定液为基于甲醛的FPA50</td></tr><tr><td>SDS/NaOH溶液</td><td></td><td></td><td>将SDS和NaOH储备液稀释至1% SDS / 0.2 N NaOH（10倍稀释）。适用于花和角果发育的所有阶段。最佳固定液为甲醇/乙酸固定液；其他两种固定液也可使用。可与卡氏荧光增白剂、金胺O、DAPI和苯胺蓝染色液联合使用。</td></tr><tr><td>SDS储备液</td><td></td><td></td><td>10%（w/v）十二烷基硫酸钠。将10 g十二烷基硫酸钠溶于80 ml去离子水中，定容至100 ml。</td></tr><tr><td>NaOH储备液</td><td></td><td></td><td>2 N NaOH溶液：将4 g NaOH溶于40 ml去离子水中，定容至100 ml</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;透明与染色联合溶液&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Herr's IKI-4&amp;frac12;</td><td></td><td></td><td>在标准4&amp;frac12;（共9 g）中加入：100 mg碘，500 mg碘化钾。该透明液可用于所有花发育阶段和角果发育阶段，既可用于增强对比度，也可用于淀粉动态的表征。结构分析使用FPA50固定液，定量淀粉分析使用卡诺氏固定液。</td></tr><tr><td>Alexander染色液</td><td></td><td></td><td>95%乙醇10 ml，孔雀石绿（1%溶于95%乙醇）1 ml，酸性品红（1%溶于ddH2O）5 ml，橙黄G（1%溶于ddH2O）0.5 ml，苯酚5 g，水合氯醛5 g，冰乙酸2 ml，甘油25 ml。该透明/染色液可单独使用或与Herr's 4&amp;frac12;溶液联合使用，用于评估成熟花中三细胞花粉粒的花粉败育情况。适用于新鲜采集的未固定材料。</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;染色液&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>卡氏荧光增白剂溶液</td><td></td><td></td><td>卡氏荧光增白剂0.007%水溶液（g:ml）。最初用作光学增白剂。可用于染色细胞壁中的纤维素、羧化多糖和胼胝质。常用于花粉粒内壁的染色。三种固定液均可与此溶液配合使用。</td></tr><tr><td>金胺O溶液</td><td></td><td></td><td>金胺O 0.01%水溶液（g:ml）。该亲脂性荧光染料可用于角质层、角质和外壁等结构的染色。三种固定液均可与此溶液配合使用</td></tr><tr><td>卡氏荧光增白剂-金胺O混合液</td><td></td><td></td><td>金胺O溶液 : 卡氏荧光增白剂溶液，3:1。可用于两种染料的联合染色。其他比例也可尝试，但卡氏荧光增白剂的比例应小于金胺O。</td></tr><tr><td>DAPI溶液</td><td></td><td></td><td>DAPI 0.4 μg/ml，0.1 M磷酸钠缓冲液（pH 7），0.1%吐温X-100，1 mM EDTA。该溶液可用于雄性和雌性减数分裂过程中的染色体铺展以及任何组织的细胞核染色。常用于花粉粒发育的研究。卡诺氏固定液和甲醇/乙酸固定液是此溶液的最佳固定液。基于甲醛的固定液（如FPA50）可能干扰染色。紫外激发，最大发射波长约461 nm。</td></tr><tr><td>磷酸钠缓冲液（0.1 M）</td><td></td><td></td><td>质子受体：0.2 M Na2HPO4，质子供体：0.2 M NaH2PO4，质子供体/质子受体比例：1.364（pH 7）</td></tr><tr><td>苯胺蓝溶液</td><td></td><td></td><td>0.1%（w/v）苯胺蓝，108 mM K3PO4（pH 11），2%甘油。该溶液可用于多个发育阶段的胼胝质和纤维素染色（例如雄性和雌性四分体中的胼胝质沉积、花粉管中的胼胝质栓）。紫外激发，最大发射波长约455 nm。也可在514 nm激发，产生红色发射，用于细胞内容物染色。</td></tr></tbody></table>

整体透明化与染色 拟南芥 花器官与角果

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

由于其在分子遗传学研究中具有强大的工具，Arabidopsis thaliana 是植物生物学尤其是植物生殖生物学中最突出的模式物种之一。然而，传统的植物形态学、解剖学和超微结构分析通常需要耗时的包埋和切片步骤，以用于明场显微镜、扫描电镜和透射电镜观察。近年来，共聚焦荧光显微镜技术的进步、先进的三维计算机辅助显微分析方法，以及对经最少处理的整体样本所使用的分子技术的不断优化，使得开发高效且简化的样本处理技术的需求日益增加。在本实验方案中，我们介绍了正确解剖拟南芥花朵和角果的技术、基本的透明化方法，以及用于生殖结构整体观察的一些染色步骤。

拟南芥 属于十字花科，具有总状花序，花为两性花，排列成伞房状图1）。每朵花有四个萼片、四个花瓣、六枚雄蕊（四长两短），以及一个由两个合生心皮组成的合心皮雌蕊。图1F- H）排列成四个同心螺旋25,26. 拟南芥 具有薄珠心、倒生胚珠，每室两列，以壁着胎座方式排列于子房的两个室中（每列12–20枚胚珠），每个子房共45–80枚胚珠（未发表数据及参考文献）27,28,29,30）。为了在单株植物内或不同植物间（作为重复或...

在本实验方案中，我们介绍了正确解剖拟南芥花朵和角果的技术、一些基本的透明化方法，以及用于生殖结构整体观察的特定染色步骤。

由于其在分子遗传学研究中具有强大的工具，拟南芥（Arabidopsis thaliana）是植物生物学中最突出的模式物种之一，……

本方案描述了如何正确解剖花蕾、花朵和幼嫩的角果，并进行后续的整体透明化处理，以适用于多种染色和观察技术。该方法有助于回答植物有性生殖研究领域中的关键问题。例如，稳定的突变体分析，或由环境及实验因素诱导的花发育与功能异常。该技术的主要优势在于能够同时对多个发育阶段进行简便快速的筛选。本方法的可视化演示至关重要，因为花器官解剖步骤较难掌握，需要具备花的解剖学知识和解剖操作技能。首先，使用小剪刀从同步生长的植株上取下花朵，并立即将其放入含有适当固定液的各个微量离心管中。接着，去除固定液，加入足量的70%乙醇以完全浸没样品。将样品放回 4°C 环境中至少 24 小时。然后用新配制的 70% 乙醇充满一个钟表匠玻璃皿，并将其放入一个小的培养皿中以提供支撑。接着将花序放入钟表匠玻璃皿中，确保其完全被乙醇覆盖。使用镊子和装有针头的注射器，在体视显微镜下将花解剖，撕开萼片、花瓣和雄蕊。然后将钟表匠用玻璃片移至一旁，使用载玻片进行最终解剖。将样品转移至载玻片上，并加入 10 µL 新鲜配制的 70% 乙醇。在子房两侧进行切割，必要时旋转子房。然后轻轻移除瓣膜以暴露胚珠。用锋利的刀片做一小切口，将一半的传导组织从花托上分离，并使用镊子和针将两半撕开。用锋利的切割去除柱头、花柱和花梗。用镊子和针轻轻翻转并排列仍附着的胚珠，使其形成两排平行的结构。取一小块吸水纸，从载玻片上的样品上吸去乙醇。然后向载玻片上加入 20 µL 透明溶液。使用带皮下注射针头的两个注射器调整样本位置，并去除残留的气泡。接着，轻轻将盖玻片放置在载玻片上，等待透明溶液充满盖玻片与样本之间的空隙。将载玻片放入载片夹中，并置于通风橱下。取即将开放且花药未开裂的新鲜花蕾。然后准备一个96孔板，加入足量的亚历山大溶液，以完全浸没花蕾。去除花萼和花瓣，暴露出花药，并将其浸入Alexander溶液中。将培养皿置于通风橱内静置1至3小时。然后用Herr's four and a half溶液替换Alexander溶液，并将培养皿在通风橱中过夜孵育。第二天，使用镊子将已清除杂质的花芽小心转移至新的载玻片上。接着，解剖雄蕊，并从样品中去除所有其他组织。然后采用水合氯醛进行透明处理，并结合使用 Herr 的四又二分之一溶液进行透明和染色处理。首先将花从钟表匠玻璃片转移到载玻片上，并用吸水纸除去多余的乙醇。加入5至10微升DAPI溶液。使用两个带皮下注射针头的注射器解剖雄蕊，并移除所有其他花器官。然后将花粉粒释放到DAPI溶液中。从载玻片上清除花药的所有残渣，确保仅留下花粉粒。将花药残渣从载玻片上彻底清除是去除外壁最关键的步骤。载玻片与盖玻片之间应仅保留花粉粒。接下来，将盖玻片盖在载有样品的载玻片上，加入最少量的DAPI溶液，以充满载玻片与盖玻片之间的空隙即可。用食指轻轻按压盖玻片，并进行快速短暂的滑动操作。将载玻片置于暗处的4摄氏度人源样本盒中，至少放置15分钟。随后在24小时内使用宽场荧光显微镜或共聚焦显微镜观察载玻片。将解剖后的样品从钟表匠用玻璃皿转移至含有充满1%SDS和0.2摩尔氢氧化钠溶液的凹槽的玻璃板上。室温下孵育过夜。SDS 氢氧化钠溶液会迅速使样品透明，在几分钟内即可观察到透明现象。用清水小心冲洗样品，并将其置于干净的载玻片上。然后向载玻片上加入 20 至 40 微升染色液。根据待分析的花器官类型及研究人员的技术水平，该 DS 处理步骤可在解剖前进行（适用于经验丰富的研究人员），或在解剖后进行（适用于经验较少的研究人员）。接下来，将盖玻片轻轻盖在载玻片上，注意避免压碎样品。然后将所有制备好的载玻片放入一个用铝箔包裹的人体组织盒中，在4°C条件下孵育一小时。最后在宽场荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察样本。按照本方案中描述的解剖步骤，去除可能妨碍观察的多余组织，从而获得更详细的图像。根据研究目的，水合氯醛染色可用于表征花器官早期发育的整体花蕾水平、花药中的减数分裂和小孢子发生、胚珠早期发育及大孢子母细胞的确定、雌性配子体的发育，甚至花粉管对胚囊中央细胞的侵入。结合亚历山大染色与赫尔氏4.5透明法，可评估特定药室或整个花药中的花粉败育情况。正常可育的花粉粒细胞质呈红色，而败育花粉的细胞质则为空泡状，最终形态不规则且完全塌陷。去除外壁可导致细胞核染色强度增加，并使染色质结构的细节更加清晰。在染色前使用SDS和氢氧化钠进行透明处理，可使花序透明化，并提高花组织中胼胝质的染色强度。这揭示了通常难以观察到的胼胝质积累，例如将生殖细胞与营养细胞分隔开的胼胝质层，即使在花粉粒仍被包裹于花药中时也能显现。一旦掌握，这些技术若操作得当，可在不到 48 小时内完成。在进行该实验流程时，重要的是要牢记，实验结果在很大程度上取决于良好的样品制备，例如使用合适的固定剂、正确进行解剖，以及在载玻片上准确分离出目标组织。

whole-mount-clearing-staining-arabidopsis-flower-organs

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

拟南芥花器官和角果的全装清和染色

植物细胞壁的组成因组织类型而异，可能包含木质素、纤维素、半纤维素和果胶。已有多种染色技术被开发用于在细胞类型水平上观察这些差异。本文汇编了常用的细胞壁染色技术。...

组织化学染色 拟南芥 次生细胞壁组分

我们在此提供一种高效且可靠的免疫染色和荧光检测方案 在 原位 杂交，DNA染色后对整体样本进行定量高分辨率成像 拟南芥...

一种用于整体封片胚珠中染色质修饰与细胞核结构的高效定量单细胞分析方法 拟南芥

结晶纤维素是植物细胞壁的重要组成成分。然而，在细胞分辨率下对其进行定量在技术上具有挑战性。本文中，我们报道了利用偏振光技术结合根部横切片，以获取具有时空分辨率的细胞壁组分信息。...

高分辨率定量分析结晶纤维素的积累 拟南芥 监测组织特异性细胞壁修饰的根部方法

活体共聚焦成像为生物学家研究发育过程提供了强有力的工具。本文中，我们介绍了一种对发育中的拟南芥（Arabidopsis）花进行活体共聚焦成像的详细实验方案。...

活体共聚焦成像观察拟南芥花的发育过程

本方案概述了一种观察胚胎发生的方法 拟南芥...

一种表征胚胎发生的方法 拟南芥

我们报道了一种简单且通用的方法，可用于对拟南芥（Arabidopsis...

一种通用的封片方法 拟南芥 用于活体时间序列成像的叶片

本文描述了一套转基因拟南芥（Arabidopsis...

可诱导的、细胞类型特异性表达 拟南芥 通过LhGR介导的 转录-激活

本文描述了一种在保持荧光蛋白稳定性的前提下使植物组织透明化的方法。该技术有助于对透明化处理后的植物组织进行深层成像，而无需物理切片。...

植物组织的光学透明化以实现荧光成像

本实验方案描述了一种用于组织学观察由植瘿昆虫诱导产生的虫瘿的优化方法 芸薹根肿菌 下胚轴的振动切片在荧光成像前进行透明化处理，以研究转录因子和植物激素在病程进展中的作用。该方案克服了树脂包埋的局限性，能够实现 在植株内 荧光蛋白的可视化...

结合透明化技术与荧光显微镜观察基因表达变化及对Plasmodiophora brassicae的生理响应

在此，我们描述了一种对半体外 (SIV) 法用于观察花粉管导向与接收过程 拟南芥, 这会提高胚珠的接受性。高通量SIV 与隔膜...

活体成像 拟南芥 花粉管接收与半体外双受精实验方法体外室间隔 方法

本文介绍了一种改进的拟南芥（Arabidopsis...

高分辨率单颗粒 体内 花粉水合生物测定法 拟南芥

学习拟南芥花器官和角果的解剖与全装清染色技术，用于植物生殖生物学研究。该方法支持突变体分析和花发育功能研究，可快速筛选多个发育阶段。

整体透明化与染色拟南芥花器官与角果

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整体透明化与染色 拟南芥 花器官与角果

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