Tests für gentechnisch veränderte Lebensmittel

Gentechnisch veränderte Lebensmittel sind Produkte, die eine Zutat oder Zutaten enthalten, deren DNA spezifisch verändert wurde. Das Vorhandensein dieser Modifikationen kann mit einer Technik nachgewiesen werden, die als Polymerase-Kettenreaktion bezeichnet wird.

Die genetische Veränderung von Lebensmitteln ist aufgrund der umstrittenen Bedenken hinsichtlich der Gesundheits- und Umweltsicherheit ein umstrittenes Thema. Die Fähigkeit, genetisch veränderte DNA in Lebensmittelproben von Interesse nachzuweisen, ermöglicht eine fundierte Entscheidungsfindung über die Sicherheit und die potenziellen Gefahren der Verwendung von gentechnisch veränderten Organismen (GVO) in der Lebensmittelversorgung.

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wird verwendet, um Lebensmittel-DNA zu amplifizieren, um das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein von gentechnisch veränderten Sequenzen zu bestimmen. Die Gelelektrophorese zieht dann die amplifizierte DNA durch eine Agarose-Gelmatrix und trennt DNA-Banden unterschiedlicher Größe, die modifizierten oder nicht modifizierten Markern entsprechen. Diese werden dann mit Kontrollbanden von Lebensmitteln verglichen, von denen bekannt ist, dass sie GVO enthalten oder von denen bekannt ist, dass sie frei von Modifikationen sind.

Dieses Video veranschaulicht die Prinzipien hinter dem Nachweis gentechnisch veränderter DNA aus Lebensmittelproben, wie DNA extrahiert und Marker amplifiziert werden, die im Prozess der genetischen Veränderung verwendet werden, und wie das Vorhandensein oder Fehlen von GVO in Lebensmittelproben festgestellt werden kann.

Bei der Polymerase-Kettenreaktion werden DNA-Sequenzen identifiziert, die in das gentechnisch veränderte Lebensmittel eingefügt wurden. Da es sich bei der DNA um ein relativ stabiles Molekül handelt, können lebensfähige DNA-Fragmente, die für die Amplifikation geeignet sind, auch aus stark verarbeiteten Produkten wie Maischips oder Gemüseburgern isoliert werden. Eine kleine Anzahl regulatorischer DNA-Sequenzen wird verwendet, um die Expression eingefügter Gene zu kontrollieren, so dass diese Sequenzen in den meisten gentechnisch veränderten Pflanzen vorhanden sind. Dieses Verfahren identifiziert zwei der am häufigsten verwendeten Gene, das 35S-Promotor-Gen und das Nopalinsynthase-Terminator-Gen. Die 35S-Sequenz ist ein starker Promotor, und wenn sie an ein eingefügtes Gen gebunden ist, sorgt sie für ein konstant hohes Expressionsniveau. Der Nopalinsynthase-Terminator ist enthalten, um die Transkription des eingefügten Gens am gewünschten Endpunkt zu stoppen.

Bei der PCR werden wiederholte Heiz- und Kühlzyklen in einem Thermocycler durchgeführt, einer Maschine, die die Temperatur der PCR-Reaktionsgefäße streng kontrolliert. Erhitzen der Probe auf 94 ? C bewirkt, dass DNA-Stränge denaturieren und sich trennen. Schnelle Abkühlung auf 45 bis 65 ? C ermöglicht das Andocken von Primern an die getrennten DNA-Stränge. Schließlich das Aufwärmen auf 72 ? C ermöglicht es dem Taq-Polymerase-Enzym, die Primer zu verlängern und die Zielregion vollständig zu duplizieren.

Jeder Probe wird ein gekaufter Pflanzenprimer zugesetzt, der in Proben, die Pflanzen-DNA enthalten, amplifiziert wird. GVO-Positivvorlagen für 35S und NOS werden verwendet, um eine Positivkontrolle für GVO zu ermöglichen. Als Negativkontrolle wird ein zertifizierter Non-GMO verwendet. Wenn eine dieser Kontrollreaktionen unerwartete Banden aufweist, kann den Ergebnissen der Prüfmuster nicht vertraut werden.

Die amplifizierte DNA wird durch Elektrophorese durch ein Agarosegel geführt. PCR-Produkte werden mit einem Farbstoff vermischt und in Vertiefungen geladen. Die DNA ist negativ geladen und bewegt sich, wenn sie am Kathodenende der Kammer in das Gel geladen wird, beim Anlegen von Strom in Richtung Anodenende. Größere DNA-Fragmente können sich nicht so leicht durch die Gelmatrix bewegen und bleiben daher näher an der Kathode, während kleinere Sequenzen sich in Richtung Anodenende bewegen, was zu einer Trennung von unterschiedlich großer DNA in unterschiedliche Banden führt.

Nach der Elektrophorese hilft die Gelfärbung, getrennte DNA-Banden sichtbar zu machen.

Nachdem wir nun mit den Prinzipien hinter dem GVO-Nachweis und dem Einsatz von PCR und Elektrophorese zur GVO-Identifizierung vertraut sind, werfen wir einen Blick darauf, wie dies im Labor durchgeführt werden kann.

Sobald die interessierenden Lebensmittel identifiziert wurden, kann mit der Analyse begonnen werden. Um die DNA zu extrahieren, nehmen Sie zwei saubere Schraubverschlussröhrchen und übertragen Sie in jedes dieser Röhrchen 500 ? L des gekauften DNA-Isolationsreagenzes und stellen Sie sicher, dass die Mischung zwischen den Aliquoten auf und ab pipettiert wird, um das Reagenz gleichmäßig zu mischen. Beschriften Sie eines der Röhrchen mit "gentechnikfrei" und das andere mit "Test".

Wiegen Sie anschließend 0,5 g zertifizierte gentechnikfreie Lebensmittel ab und geben Sie sie in einen sauberen Mörser. Fügen Sie 2,5 ml destilliertes Wasser hinzu und mahlen Sie es mit dem Stößel 2 Minuten lang, um eine Aufschlämmung zu bilden. Fügen Sie weitere 2,5 ml destilliertes Wasser hinzu und mahlen Sie die Aufschlämmung weiter, bis sie glatt genug ist, um sie zu pipettieren.

Pipette 50 ? L der bekannten gentechnikfreien Aufschlämmung in das als "nicht gentechnisch verändert" gekennzeichnete Schraubverschlussröhrchen, das das DNA-Isolationsreagenz enthält. Addieren Sie nun 50 ? L der Prüflebensmittelprobenaufschlämmung in das mit "Test" gekennzeichnete Schraubverschlussröhrchen geben. Die beiden Röhrchen mit den Lebensmittelproben und dem DNA-Reagenz 1 Minute lang vortexen. Legen Sie anschließend die Röhren in ein Wasserbad bei 95 ? C für 5 Min. Zum Schluss legen Sie die Röhrchen für 5 Minuten in eine Zentrifuge. Bei der Untersuchung sollte sich am Boden des Rohres ein festes Pellet bilden. Wenn sich nach 5 Minuten kein Pellet bildet, wird erneut in Abständen von 2 Minuten zentrifugiert, bis sich ein Pellet bildet. Die Proben können nun sofort für die PCR verwendet oder bis zu 1 Woche im Kühlschrank gelagert werden.

Erstens, Nummer sechs PCR-Röhrchen. Diese Zahlen entsprechen dem in der Tabelle aufgeführten Röhrcheninhalt. Legen Sie jedes der markierten PCR-Röhrchen mit geöffneten Kappen in einen Mikroröhrchenhalter.

Fügen Sie mit einem frischen Tipp für jede Zugabe 20 ? L-Primer, der in der Tabelle zu jedem PCR-Röhrchen angegeben ist. Addieren Sie als Nächstes 20 ? L der DNA-Proben, die in der Tabelle für jedes PCR-Röhrchen angegeben sind. Pipettieren Sie zum Mischen auf und ab. Achten Sie bei pelletierten Proben darauf, nur aus dem Überstand zu pipettieren und vermeiden Sie das feste Pellet am Boden der Röhrchen. Legen Sie abschließend die PCR-Röhrchen in einen Thermocycler und programmieren Sie ihn so, dass er die in der Tabelle angegebenen Heiz- und Kühlschritte durchläuft.

Geben Sie ein 3%iges Agarosegel in die Elektrophoresekammer, wobei die Vertiefungen dem Kathodende am nächsten liegen. Geben Sie TAE-Puffer in die Kammer, um sie 2 mm über der Gelschale abzudecken. Entnehmen Sie die PCR-Röhrchen aus dem Thermocycler und legen Sie sie in einen Mikroröhrchenhalter. Fügen Sie jedes Mal mit einer frischen Pipettenspitze 10 ? L gekaufter DNA-Ladefarbstoff in jede Probe und gut mischen.

Befüllen Sie die Vertiefungen des Agarose-Gels jedes Mal mit einer frischen Spitze mit 20 ? L des Molekulargewichtslineals in eine Vertiefung und 20 ? L jeder Probe in nachfolgende Vertiefungen, wie in dieser Tabelle angegeben. Stellen Sie die Elektrophoresekammer so ein, dass sie 30 Minuten lang mit 100 V läuft.

Sobald das Gel abgelaufen ist, ziehen Sie vorsichtig den Netzstecker aus der Gelkammer, entfernen Sie die Schale und schieben Sie das Gel in eine Färbeschale. Tauchen Sie das Gel 5 Minuten lang in gekauften 100x Gelfleck und schütteln Sie das Tablett vorsichtig, um den Fleck zu verteilen. Sobald es fleckig ist, füllen Sie das Gel in einen Waschbehälter und spülen Sie es ca. 10 s lang mit Leitungswasser ab. Trocknen Sie die Färbung durch dreimaliges Waschen in warmem Leitungswasser für jeweils 3 Minuten unter leichtem Schütteln, um ein optimales Ergebnis zu erzielen. Setzen Sie die Entfärbung bei Bedarf in warmem Wasser fort, bis der gewünschte Kontrast erreicht ist.

Das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein einer 200 bp-Bande auf Spur 4 gibt an, ob das Prüflebensmittel GVO enthält. Die Pflanzenprimer bestimmen, ob die Pflanzen-DNA erfolgreich aus der Probe extrahiert wurde. Die Kontrolle von nicht gentechnisch veränderten Lebensmitteln ist ein Indikator für falsch positive Ergebnisse, sollten diese auftreten. Wenn die Kontrolle von nicht gentechnisch veränderten Lebensmitteln positiv ausfällt, bedeutet dies, dass die PCR zu irgendeinem Zeitpunkt kontaminiert war. Die Template-Kontrolle für GVO-Positive ist ein Indikator für falsch negative Ergebnisse. Wenn die GVO-positive Matrizenkontrolle nicht amplifiziert, gibt es ein Problem mit der PCR-Reaktion und einem GVO-negativen Ergebnis des Testlebensmittels kann nicht vertraut werden.

Gele können auf ein weißes oder gelbes Papier aufgetragen werden, um einen kontrastreichen Hintergrund zu schaffen, um DNA-Banden hervorzuheben, oder ein erhöhter Kontrast kann mit einer UV-Lichtbox erreicht werden.

Die Möglichkeit, Lebensmittel oder Produkte auf gentechnisch veränderte Zutaten zu testen, ist für eine Reihe von wissenschaftlichen oder regulatorischen Anwendungen relevant.

Es gibt Hinweise darauf, dass transgene DNA von gentechnisch veränderten Pflanzen in die Genome von Wildpflanzenpopulationen eindringen kann. Bestäuber können diesen Transfer zum Beispiel erleichtern, indem sie Wildtyp-Pflanzen mit Pollen aus einer gentechnisch veränderten Quelle befruchten. Dies ist besorgniserregend, da die Auswirkungen der Ausbreitung dieser eingefügten Gene auf die Ökosysteme als Ganzes nicht gut verstanden sind. PCR-Tests von Wildpopulationen können Daten über die mögliche Ausbreitung oder erfolgreiche Eindämmung von genetischen Inserts liefern.

Fehlende oder falsche Kennzeichnung von gentechnisch veränderten Inhaltsstoffen kann ein Problem für die Verbraucher sein. Dies kann auf die Präferenz des Verbrauchers beim Verzehr oder auf die mögliche Einführung von Allergenen während des GV-Prozesses zurückzuführen sein, obwohl letzteres umstritten ist. In einigen Ländern müssen gentechnisch veränderte Zutaten auf Lebensmittelverpackungen angegeben werden. Die Aufsichtsbehörden in diesen Ländern können PCR-Tests verwenden, um die Richtigkeit der Lebensmittelkennzeichnung zu überprüfen.

In den Fällen, in denen die genetische Veränderung, die in eine Kulturpflanze eingebracht wird, Pestizidresistenz verleiht, haben einige Studien Bedenken hinsichtlich der Produktion von "Superunkräutern" geäußert. Im Wesentlichen kann es sich dabei um jede Pflanze handeln, die ursprünglich nicht modifiziert werden soll und die die Resistenz gegen Pestizide durch Mechanismen wie Introgression oder Hybridisierung erlangt. Diese Pflanzen können sich dann möglicherweise erfolgreicher ausbreiten und sind schwieriger zu kontrollieren als solche ohne Einsatz. PCR-Tests auf genetische Veränderung können helfen, solche potenziellen Populationen hervorzuheben und zu verfolgen, um festzustellen, ob sich diese Ausbreitung als problematisch erweisen könnte.

Sie haben gerade die Einführung von JoVE in die Prüfung auf GVO-Lebensmittel gesehen. Sie sollten nun die Prinzipien hinter der Identifizierung gentechnisch veränderter Lebensmittel mittels PCR verstehen, wie Sie DNA aus Lebensmitteln extrahieren und amplifizieren und wie Sie feststellen können, ob Ihre Lebensmittelprobe gentechnisch verändert wurde. Danke fürs Zuschauen!