Zu Beginn des 20. Jahrhunderts arbeitete ein britischer Bakteriologe namens Frederick Griffith mit dem Lungenentzündung verursachenden Bakterium Streptococcus pneumoniae. Er führte ein einfaches Experiment mit zwei verschiedenen Stämmen durch. Ein Stamm ist als S-Stamm bekannt, weil er durch eine Schutzkapsel geschützt ist, die die von ihm gebildeten Kolonien oder Klumpen glatt erscheinen lässt und ihn auch virulent oder schädlich macht. Der zweite war der R-Stamm, eine Version des Bakteriums, bei der die Schutzkapsel fehlte, was den Kolonien ein raues Aussehen verlieh und sie nicht virulent machte.
Zuerst nahm Griffith einige der Bakterien des S-Stammes und erhitzte sie, wodurch eine hitzeabgetötete Version des S-Stammes hergestellt wurde. Dann sammelte er einige Mäuse ein und teilte sie in vier Gruppen ein. Er injizierte der ersten Gruppe den virulenten S-Stamm und der zweiten den nicht-virulenten R-Stamm. Er verabreichte der dritten Gruppe den hitzegetöteten S-Stamm und schließlich den hitzeabgetöteten S-Stamm und den R-Stamm zusammen und injizierte diese Mischung in die vierte Gruppe. Wie erwartet starben die Mäuse der ersten Gruppe, und die Mäuse der zweiten und dritten Gruppe überlebten. Doch zu Griffiths Überraschung starben auch die Mäuse der letzten Gruppe.
Als er 1928 seine Studie veröffentlichte, nannte er diesen mysteriösen Prozess Transformation, da er über das Vorhandensein eines zugrundeliegenden Transformationsprinzips spekulierte, das es dem zuvor nicht virulenten Stamm ermöglichte, tödlich zu werden. Später, im Jahr 1943, berichteten Avert, MacLeod und McCarty, dass es sich bei diesem transformierenden Prinzip wahrscheinlich um Desoxyribonukleinsäure oder DNA handelte, von der wir heute wissen, dass sie das Vererbungsmaterial ist. Was in Griffiths Experiment im Wesentlichen geschah, war, dass, als die Bakterien kombiniert wurden, etwas DNA aus dem hitzegetöteten S-Stamm in die R-Stammzellen austrat, wodurch diese nicht-virulenten Bakterien umgewandelt und die Informationen weitergegeben wurden, um die Schutzkapsel herzustellen, wodurch der R-Stamm in einen virulenten Stamm verwandelt wurde, der nun in der Lage war, die Tiere der vierten Gruppe zu töten.
Heute haben Wissenschaftler eine viel einfachere Methode entwickelt, um die bakterielle Transformation zu untersuchen, indem sie die Bakterien E. coli und kleine, kreisförmige DNA-Schleifen, sogenannte Plasmide, verwenden. Normalerweise enthält das Plasmid, das in Transformationsexperimenten verwendet wird, ein Gen für eine spezielle Funktion, wie z. B. Antibiotikaresistenz. E. coli sind ein hervorragendes Objekt für die Transformation, da sie eine Eigenschaft namens Kompetenz aufweisen können, die Fähigkeit, DNA aus der Umwelt aufzunehmen. Im Wesentlichen bedeutet dies, dass unter bestimmten Umweltbedingungen, wie einer Chemikalie oder einem Strom- oder Hitzeschock, die Zellwand der E. coli vorübergehend durchlässig werden und die Aufnahme von DNA aus der Umwelt ermöglichen kann. Sobald sich das Plasmid im Inneren von E. coli befindet, kann es entweder im Zytoplasma seiner neuen Wirtszelle hängen und über Generationen hinweg zusammen mit dem Genom repliziert und exprimiert werden, oder es kann sich vollständig in das Genom des Wirts integrieren. Wenn die Bakterien das Plasmid an irgendeiner Stelle verlieren, verliert die Zelle auch ihre Antibiotikaresistenz, und so züchten die Wissenschaftler die Bakterien in einem Medium, das das Antibiotikum enthält, um sicherzustellen, dass die einzigen Überlebenden diejenigen sind, die das gewünschte Plasmid enthalten.
In diesem Labor lernen Sie, wie Sie E. coli-Zellen mit einem Plasmid transformieren, das ein Antibiotikaresistenzgen enthält, während Sie sterile mikrobiologische Techniken anwenden.
Hintergrund
Zu Beginn des 20. Jahrhunderts war die Lungenentzündung für einen großen Teil der Todesfälle durch Infektionskrankheiten verantwortlich1. Um einen wirksamen Impfstoff gegen Lungenentzündung zu entwickeln, untersuchte Frederick Griffith zwei verschiedene Stämme der Streptococcus pneumoniae: einen nicht-virulenten Stamm mit einem rauen Aussehen (R-Stamm) und einen virulenten Stamm mit einem glatten Aussehen (S-Stamm) aufgrund einer äußeren Polysaccharidkapsel2. Diese äußere Schicht der S-Stamm-Bakterien ermöglichte es ihnen, dem Immunsystem des Wirts zu widerstehen, was schließlich zu einer lebensbedrohlichen Krankheit führte. Als Griffith Mäusen separat hitzeabgetötete Bakterien beider Stämme injizierte, überlebten die Mäuse. Als er jedoch Mäusen eine Kombination aus dem hitzegetöteten S-Stamm mit dem lebenden R-Stamm injizierte, starben die Mäuse2. Als er die Proben von toten Mäusen analysierte, denen die Kombination injiziert worden war, stellte er fest, dass lebende S-Stamm-Bakterien vorhanden waren. Im Jahr 1928 stellte Griffith fest, dass ein "Transformationsprozess" stattgefunden haben muss, um die nicht-virulenten Bakterien in den virulenten Stamm zu verwandeln. Als erste bekannte Entdeckung der bakteriellen Transformation ebnete seine Entdeckung den Weg für die Entwicklung eines wesentlichen Werkzeugs der Gentechnik - der Transformation3.
Transformation ist die genetische Veränderung in einer Zelle aufgrund der Aufnahme von DNA aus der Umwelt. In Griffiths Experiment wurde die DNA, die für die schützende Polysaccharidbeschichtung der S-Stamm-Bakterien kodiert, durch den Hitzeschock nicht abgebaut und in den R-Stamm eingeführt, so dass dieser das Immunsystem der Maus umgehen konnte. Während dieser Prozess in freier Wildbahn ständig zwischen Organismen und sogar verschiedenen Arten stattfindet, transformieren Wissenschaftler Bakterien in Laborumgebungen zu Forschungszwecken4.
Bakterielle Transformation mit Hilfe von Plasmiden
Bakterien sind die idealen Organismen für die Transformation, da sie exogenes genetisches Material leicht in ihr Genom aufnehmen und schnell vermehren können3,5. Sie haben ein zirkuläres Chromosom und mehrere kleine kreisförmige Stücke doppelsträngiger DNA, die als Plasmide bezeichnet werden, im Zytoplasma. Diese Plasmide können sich unabhängig von der chromosomalen DNA replizieren und bieten im Allgemeinen bestimmte funktionelle Vorteile, wie z. B. Resistenz gegen Antibiotika6,7. In ihrer natürlichen Umgebung durchlaufen Bakterien eine "bakterielle Transformation", indem sie Plasmide von anderen Bakterien in einem Prozess aufnehmen, der als Konjugationbezeichnet wird 8. Darüber hinaus erhält jeder ihrer Nachkommen bei der Vermehrung eine Kopie des neuen Plasmids.
Plasmide, die zu experimentellen Zwecken verwendet werden, werden als Plasmidvektoren bezeichnet. In einer Laborumgebung können Wissenschaftler künstlich "rekombinante Plasmide" herstellen, die etwa 5.000 bis 10.000 Basenpaare lang sind, indem sie DNA-Fragmente in einen Plasmidvektor einfügen. Diese rekombinanten Plasmide haben in der Regel bestimmte Komponenten: einen Replikationsursprung (ORI), ein Antibiotikaresistenzgen, eine multiple Klonierungsstelle, einen Promotor, einen Selektionsmarker und das Gen von Interesse. Der Ursprung der Replikation ist der Ort, an dem die Replikation beginnt. Das Antibiotikaresistenz-Gen ermöglicht es den Bakterien, die das Plasmid aufnehmen, in Gegenwart eines bestimmten Antibiotikums auf Platten zu überleben. Obwohl Plasmide relativ kleine DNA-Stücke sind, müssen die Wissenschaftler die Wirtszellen behandeln, um das Plasmid-Eindringen durch die Zellmembran zu ermöglichen. Daher steht die Effizienz der Umwandlung in direktem Zusammenhang mit der Porosität der Wirtsmembran. Ein gängiger Ansatz besteht darin, die Bakterien, die mit einer Calciumchloridlösung behandelt wurden, mit einem Hitzeschock zu schocken9. Die Bakterien, die das Plasmid nicht einbauen, transformieren sich nicht und haben daher keinen Widerstand, um auf der Platte zu überleben und sichtbar zu sein. Die multiplen Klonierungsstellen helfen bei der DNA-Insertion, indem sie Stellen für Restriktionsenzyme enthalten, um das Plasmid zu schneiden, wo das Gen von Interesse eingefügt und ligiert werden kann. Der Promotor steuert die Transkription des interessierenden Gens. Es ist mit einem Marker markiert, in der Regel mit einem fluoreszierenden Protein wie einem grün fluoreszierenden Protein (GFP), oder kann ein zusätzliches Antibiotikaresistenzgen sein. Das Antibiotikaresistenz-Gen und die anderen Selektionsmarker helfen uns festzustellen, ob die gesammelten Bakterien das gewünschte Plasmid enthalten.
Anträge
Effektive Transformationsmethoden ermöglichten es Wissenschaftlern, Gene und Genprodukte zu isolieren und zu profilieren, und führten zu vielen Fortschritten in den Biowissenschaften und der Medizin, wie z. B. der Entwicklung wirksamer Medikamente, der Erzeugung gentechnisch veränderter Pflanzen und fortschrittlicher Diagnoseinstrumente10. Darüber hinaus sind mit dem technologischen Fortschritt neue Methoden der Transformation entstanden. Zum Beispiel ermöglicht die Gateway-Klonierung das Einfügen mehrerer DNA-Fragmente in verschiedene Vektoren sowie den Transfer von DNA-Sequenzen zwischen Plasmiden11. Darüber hinaus ist CRISPR-Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)-Cas9 eine Gen-Editing-Technik, die Nukleotide im Genom direkt modifiziert und ohne die Verwendung von Plasmidenauskommt 12. Nach der Transformation isolieren Forscher häufig das interessierende Gen und seine Produkte und erstellen ein Profil. In der Folge hat der gesamte Prozess des genetischen Klonens ein neues Feld der genetischen Manipulation eröffnet. Dank des genetischen Klonens können Forscher Bakterien so manipulieren, dass sie große Mengen spezifischer menschlicher Proteine produzieren, wie z. B. Insulin zur Behandlung von Diabetespatienten10. Auch in der modernen Landwirtschaft spielt das Klonen eine große Rolle. Gentechnisch veränderte Organismen (GVO) sind ein direktes Ergebnis des genetischen Klonens und der bakteriellen Transformation10. So arbeiten Wissenschaftler beispielsweise daran, gentechnisch veränderte Pflanzen mit stickstofffixierenden Genen zu erzeugen, die in ihr Genom eingebaut sind, um die Nahrungsmittelproduktion zu steigern und den Düngemittelverbrauch zu reduzieren, wodurch die wirtschaftlichen und ökologischen Auswirkungen von Düngemitteln verringertwerden 13. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die bakterielle Transformation der erste Schritt der modernen Biotechnologie und die Grundlage für zukünftige Forschungsentdeckungen ist.
Referenzen
- GL, Armstrong, LA, Conn und RW, Pinner. Trends bei der Sterblichkeit durch Infektionskrankheiten in den Vereinigten Staaten während des 20. Jahrhunderts. Jama. 1999, Bd. 281, 1 (61-66).
- F, Griffith. Die Bedeutung der Pneumokokken-Typen. J Hyg (London). . .1928 , 2 (113-59).
- Lorenz, MG und Wackernagel, F. Bakterieller Gentransfer durch natürliche genetische Transformation in der Umwelt. Mikrobiol Rev. . 1994 Sep;, Vol. 58, 3: (563-602).
- S, Domingues, et al. Die natürliche Transformation erleichtert den Transfer von Transposons, Integronen und Genkassetten zwischen Bakterienarten. PLOS Krankheitserreger. 2012, 8(8): e1002837.
- Dubnau, D. DNA-Aufnahme in Bakterien. Annu Rev Mikrobiol. . 1999, 53: (217-44).
- Solar, G del, et al. Replikation und Kontrolle von zirkulären bakteriellen Plasmiden. Mikrobiol Mol Biol Rev. . 1998 , Bd. 62, 2: (434-64).
- Bennett, Premierminister. Plasmid-kodierte Antibiotikaresistenz: Erwerb und Transfer von Antibiotikaresistenzgenen in Bakterien. Br J Pharmacol. .2008 , Bd. 153, S1: (S347-S357).
- MLlosa, et al. Bakterielle Konjugation: ein zweistufiger Mechanismus für den DNA-Transport. Mol Mikrobiol. 2002 Juli;, Vol. 45, 1: (1-8).
- Roychoudhury, A, Basu, S und Sengupta, DN. Analyse der vergleichenden Wirkungsgrade verschiedener Transformationsmethoden von E. coli unter Verwendung von zwei gängigen Plasmidvektoren. Indischer J Biochem Biophys. .2009 , Band 46, 5: (395-400).
- Khan, S, et al. Die Rolle der rekombinanten DNA-Technologie zur Verbesserung des Lebens. I. nt J Genomik. . 2016, 2016:2405954.
- Marsischky, G und LaBaer, J. Viele Wege zu vielen Klonen: Ein vergleichender Blick auf Klonierungsmethoden mit hohem Durchsatz. Genome Res. 2004, Vol. 14, 2020-28.
- Doudna, JA und Charpentie, E. Die neue Grenze des Genom-Engineerings mit CRISPR-Cas9. Wissenschaft. 2014, Band 346, 6213-1258096.
- Gut, A. Auf dem Weg zu stickstofffixierenden Pflanzen. Wissenschaft. 2018, Band 359, 6378: 869-70.
Zu Beginn des 20. Jahrhunderts arbeitete ein britischer Bakteriologe namens Frederick Griffith mit dem Lungenentzündung verursachenden Bakterium Streptococcus pneumoniae. Er führte ein einfaches Experiment mit zwei verschiedenen Stämmen durch. Ein Stamm ist als S-Stamm bekannt, weil er durch eine Schutzkapsel geschützt ist, die die von ihm gebildeten Kolonien oder Klumpen glatt erscheinen lässt und ihn auch virulent oder schädlich macht. Der zweite war der R-Stamm, eine Version des Bakteriums, bei der die Schutzkapsel fehlte, was den Kolonien ein raues Aussehen verlieh und sie nicht virulent machte.
Zuerst nahm Griffith einige der Bakterien des S-Stammes und erhitzte sie, wodurch eine hitzeabgetötete Version des S-Stammes hergestellt wurde. Dann sammelte er einige Mäuse ein und teilte sie in vier Gruppen ein. Er injizierte der ersten Gruppe den virulenten S-Stamm und der zweiten den nicht-virulenten R-Stamm. Er verabreichte der dritten Gruppe den hitzegetöteten S-Stamm und schließlich den hitzeabgetöteten S-Stamm und den R-Stamm zusammen und injizierte diese Mischung in die vierte Gruppe. Wie erwartet starben die Mäuse der ersten Gruppe, und die Mäuse der zweiten und dritten Gruppe überlebten. Doch zu Griffiths Überraschung starben auch die Mäuse der letzten Gruppe.
Als er 1928 seine Studie veröffentlichte, nannte er diesen mysteriösen Prozess Transformation, da er über das Vorhandensein eines zugrundeliegenden Transformationsprinzips spekulierte, das es dem zuvor nicht virulenten Stamm ermöglichte, tödlich zu werden. Später, im Jahr 1943, berichteten Avert, MacLeod und McCarty, dass es sich bei diesem transformierenden Prinzip wahrscheinlich um Desoxyribonukleinsäure oder DNA handelte, von der wir heute wissen, dass sie das Vererbungsmaterial ist. Was in Griffiths Experiment im Wesentlichen geschah, war, dass, als die Bakterien kombiniert wurden, etwas DNA aus dem hitzegetöteten S-Stamm in die R-Stammzellen austrat, wodurch diese nicht-virulenten Bakterien umgewandelt und die Informationen weitergegeben wurden, um die Schutzkapsel herzustellen, wodurch der R-Stamm in einen virulenten Stamm verwandelt wurde, der nun in der Lage war, die Tiere der vierten Gruppe zu töten.
Heute haben Wissenschaftler eine viel einfachere Methode entwickelt, um die bakterielle Transformation zu untersuchen, indem sie die Bakterien E. coli und kleine, kreisförmige DNA-Schleifen, sogenannte Plasmide, verwenden. Normalerweise enthält das Plasmid, das in Transformationsexperimenten verwendet wird, ein Gen für eine spezielle Funktion, wie z. B. Antibiotikaresistenz. E. coli sind ein hervorragendes Objekt für die Transformation, da sie eine Eigenschaft namens Kompetenz aufweisen können, die Fähigkeit, DNA aus der Umwelt aufzunehmen. Im Wesentlichen bedeutet dies, dass unter bestimmten Umweltbedingungen, wie einer Chemikalie oder einem Strom- oder Hitzeschock, die Zellwand der E. coli vorübergehend durchlässig werden und die Aufnahme von DNA aus der Umwelt ermöglichen kann. Sobald sich das Plasmid im Inneren von E. coli befindet, kann es entweder im Zytoplasma seiner neuen Wirtszelle hängen und über Generationen hinweg zusammen mit dem Genom repliziert und exprimiert werden, oder es kann sich vollständig in das Genom des Wirts integrieren. Wenn die Bakterien das Plasmid an irgendeiner Stelle verlieren, verliert die Zelle auch ihre Antibiotikaresistenz, und so züchten die Wissenschaftler die Bakterien in einem Medium, das das Antibiotikum enthält, um sicherzustellen, dass die einzigen Überlebenden diejenigen sind, die das gewünschte Plasmid enthalten.
In diesem Labor lernen Sie, wie Sie E. coli-Zellen mit einem Plasmid transformieren, das ein Antibiotikaresistenzgen enthält, während Sie sterile mikrobiologische Techniken anwenden.
Zu Beginn des 20. Jahrhunderts arbeitete ein britischer Bakteriologe namens Frederick Griffith mit dem Lungenentzündung verursachenden Bakterium Streptococcus pneumoniae. Er führte ein einfaches Experiment mit zwei verschiedenen Stämmen durch. Ein Stamm ist als S-Stamm bekannt, weil er durch eine Schutzkapsel geschützt ist, die die von ihm gebildeten Kolonien oder Klumpen glatt erscheinen lässt und ihn auch virulent oder schädlich macht. Der zweite war der R-Stamm, eine Version des Bakteriums, bei der die Schutzkapsel fehlte, was den Kolonien ein raues Aussehen verlieh und sie nicht virulent machte.
Zuerst nahm Griffith einige der Bakterien des S-Stammes und erhitzte sie, wodurch eine hitzeabgetötete Version des S-Stammes hergestellt wurde. Dann sammelte er einige Mäuse ein und teilte sie in vier Gruppen ein. Er injizierte der ersten Gruppe den virulenten S-Stamm und der zweiten den nicht-virulenten R-Stamm. Er verabreichte der dritten Gruppe den hitzegetöteten S-Stamm und schließlich den hitzeabgetöteten S-Stamm und den R-Stamm zusammen und injizierte diese Mischung in die vierte Gruppe. Wie erwartet starben die Mäuse der ersten Gruppe, und die Mäuse der zweiten und dritten Gruppe überlebten. Doch zu Griffiths Überraschung starben auch die Mäuse der letzten Gruppe.
Als er 1928 seine Studie veröffentlichte, nannte er diesen mysteriösen Prozess Transformation, da er über das Vorhandensein eines zugrundeliegenden Transformationsprinzips spekulierte, das es dem zuvor nicht virulenten Stamm ermöglichte, tödlich zu werden. Später, im Jahr 1943, berichteten Avert, MacLeod und McCarty, dass es sich bei diesem transformierenden Prinzip wahrscheinlich um Desoxyribonukleinsäure oder DNA handelte, von der wir heute wissen, dass sie das Vererbungsmaterial ist. Was in Griffiths Experiment im Wesentlichen geschah, war, dass, als die Bakterien kombiniert wurden, etwas DNA aus dem hitzegetöteten S-Stamm in die R-Stammzellen austrat, wodurch diese nicht-virulenten Bakterien umgewandelt und die Informationen weitergegeben wurden, um die Schutzkapsel herzustellen, wodurch der R-Stamm in einen virulenten Stamm verwandelt wurde, der nun in der Lage war, die Tiere der vierten Gruppe zu töten.
Heute haben Wissenschaftler eine viel einfachere Methode entwickelt, um die bakterielle Transformation zu untersuchen, indem sie die Bakterien E. coli und kleine, kreisförmige DNA-Schleifen, sogenannte Plasmide, verwenden. Normalerweise enthält das Plasmid, das in Transformationsexperimenten verwendet wird, ein Gen für eine spezielle Funktion, wie z. B. Antibiotikaresistenz. E. coli sind ein hervorragendes Objekt für die Transformation, da sie eine Eigenschaft namens Kompetenz aufweisen können, die Fähigkeit, DNA aus der Umwelt aufzunehmen. Im Wesentlichen bedeutet dies, dass unter bestimmten Umweltbedingungen, wie einer Chemikalie oder einem Strom- oder Hitzeschock, die Zellwand der E. coli vorübergehend durchlässig werden und die Aufnahme von DNA aus der Umwelt ermöglichen kann. Sobald sich das Plasmid im Inneren von E. coli befindet, kann es entweder im Zytoplasma seiner neuen Wirtszelle hängen und über Generationen hinweg zusammen mit dem Genom repliziert und exprimiert werden, oder es kann sich vollständig in das Genom des Wirts integrieren. Wenn die Bakterien das Plasmid an irgendeiner Stelle verlieren, verliert die Zelle auch ihre Antibiotikaresistenz, und so züchten die Wissenschaftler die Bakterien in einem Medium, das das Antibiotikum enthält, um sicherzustellen, dass die einzigen Überlebenden diejenigen sind, die das gewünschte Plasmid enthalten.
In diesem Labor lernen Sie, wie Sie E. coli-Zellen mit einem Plasmid transformieren, das ein Antibiotikaresistenzgen enthält, während Sie sterile mikrobiologische Techniken anwenden.
Videos from this collection:
Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. All rights reserved