Herstellung von Micro-Gewebe mit Modulen von Collagen Gel enthaltenden Zellen

Summary

Erstellung von Mikro-Gewebe mit zylindrischen Kollagengelen, Module genannt, die eingebetteten Zellen und die Oberfläche enthalten ist mit Endothelzellen beschichtet.

Abstract

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von einer Art Mikro-Gewebe Module genannt. Die Modul-Ansatz generiert einheitliche, skalierbare und vaskularisierten Geweben. Die Module können von Kollagen sowie andere gelierbare oder vernetzbare Materialien hergestellt werden. Sie sind ca. 2 mm in der Länge und 0,7 mm Durchmesser auf Herstellung, sondern schrumpfen in Größe mit eingebetteten Zellen oder, wenn die Module sind mit Endothelzellen beschichtet. Die Module sind einzeln klein genug, dass die eingebetteten Zellen innerhalb der Diffusions-Limit von Sauerstoff und anderen Nährstoffen sind, sondern Module können zusammen verpackt werden, um größere Gewebe, perfundierbaren sind zu bilden. Diese Gewebe sind modular aufgebaut, da verschiedene Zelltypen in eingebettet werden kann oder beschichtet auf den Modulen, bevor sie zusammen, um komplexe Gewebe zu bilden verpackt werden. Es gibt drei wesentliche Schritte zu machen die Module: (1) Neutralisieren der Kollagen-und Einbettung Zellen in ihr, (2) Geliermittel das Kollagen in die Röhre und Schneiden der Module und (3) Beschichtung der Module mit Endothelzellen.

Protocol

1) Herstellung der Rohre

1. Cut 2 bis 3 m Länge aus Polyethylen-Schlauch (0,76 mm ID x 1,22 mm OD).
2. Thema einem 20 G1 Nadel in das eine Ende des Schlauchs.
3. Coil den Schlauch und in einen Wandler selbst Dichtung Beutel (7 1 / 2 "x 13"). Die beiden Enden des Rohres sollte an der unverschlossenen Ende der Tasche platziert werden und mit Klebeband statt mit Gas-Sterilisation Band.
4. Seal Beutel und Gas sterilisieren.

2) Neutralisation von Collagen

Anmerkung: 1 ml Kollagen füllt ca. 2 m von PE-Rohre.

1. Legen Sie die erforderliche Menge von Kollagen für die gewünschte Länge des Schlauchs in ein konisches 15 ml Tube benötigt und halten auf dem Eis.
2. Mit 128 uL 10x α-MEM pro ml Kollagen mit dem Rohr und mischen durch mehrmaliges Pipettieren der Lösung. Hinweis: (1) Die Lösung sollte gelb wie die α-MEM gemischt ist in der angesäuerten Kollagen und (2) versuchen, Blasen zu minimieren beim Mischen.
3. Neutralisieren der Kollagen durch Zugabe von 0,8 M Natriumbicarbonat, bis das Kollagen hat einen pH von 7,4. Für eine allgemeine Schätzung des pH add Natriumbicarbonat, bis die gelbe Kollagenlösung wird eine hellrosa Farbe. Hinweis: Es dauert in der Regel 30 bis 60 ul pro ml Kollagen.
4. Halten Sie neutralisiert Kollagen auf Eis, bis bereit, als die neutralisierten Kollagen-Gel verwenden, wenn nicht bei 4 ° C gehalten

3) Einbettung der Zellen (Optional)

Hinweis: Je nach Zelltyp können die Zellen bei einer Konzentration zwischen 1 Million Zellen pro ml bis 20 Millionen Zellen pro mL eingebettet werden. Verwenden Sie das Medium für die Zellen, die Sie einbetten möchten erforderlich.

1. Entfernen Sie das Medium von den Zellen und wäscht mit 5 ml PBS.
2. Entfernen PBS und 3 mL Trypsin-EDTA.
3. Inkubieren Sie die Zellen in Trypsin-EDTA für 5 min bei 37 ° C.
4. Die Zellen in 7 mL Medien.
5. Zählen von Zellen.
6. Übertragen Sie die erforderliche Anzahl von Zellen für die Einbettung in ein 15 ml konischen Rohr.
7. Pellet die Zellen bei 300 xg für 5 min.
8. Saugen Sie Medien aus dem Zellpellet.
9. Resuspendieren der Zellen in der neutralisierten Kollagen und halten auf dem Eis.

4) Gelling von Collagen

1. In einer biologischen Sicherheitswerkbank abgeschnitten verschlossenen Ende der Beutel mit der PE-Rohre.
2. Bringen Sie ein 3-ml-Spritze, die 20G Nadel in das eine Ende des Schlauchs mit sterilisierten Pinzette. Halten Sie den Schlauch in der Tasche.
3. Stecken Sie das andere Ende des Schlauches in der neutralisierten Kollagen, bis die Spitze ist an der Unterseite der konischen Rohr mit sterilisierten Pinzette. Halten Sie die konischen Rohr auf Eis.
4. Ziehen Sie das Kollagen in der Polyethylen-Rohr durch Zurückziehen der Kolben der Spritze langsam.
   Hinweis: Wenn das Kollagen in den Schlauch gezogen, um schnell dann Blasen in das Kollagen zu bilden.
5. Nach dem Herausziehen des Kollagens durch den Schlauch, ziehen Sie die 20G Nadel aus Schläuchen und legte beide Enden wieder in die Tasche. Kleben Sie die Tüte verschlossen.
6. Inkubieren Sie die Tasche bei 37 ° C für 60 min. Wenn das Kollagen enthält Zellen dann drehen Sie den Beutel über alle 15 min. so dass die Zellen nicht auf eine Seite des Moduls zu begleichen.

5) Schneiden von Tubing mit der gelierten Collagen

1. Autoclave Kopf-und Blade für die Schneidvorrichtung und Fach-Schlauch zu halten.
2. Montieren Sie die Schneidvorrichtung.
3. Legen Sie Schlauch in ein steriles Tablett vor Schneideinrichtung und laden Sie den Schlauch in die Schneidvorrichtung.
4. Richten Sie eine 50 ml konischen Röhrchen mit 25 ml Medien am Ausgang der Schneidvorrichtung, um den Schnitt-Module sammeln.
   Hinweis: Verwenden Sie Medien, die FBS auch für Kollagen-only-Module wie die Module nicht getrennt von den Schlauch ohne FBS in den Medien. Wenn die Module enthalten Zellen nutzen die Medien für den Embedded-Zellen erforderlich ist. Wenn es keine eingebetteten Zellen in den Modulen nutzen die Medien für den Endothelzellen.
5. Stellen Sie die Schneidevorrichtung zu 2 mm Rohrlängen zu senken und den Schlauch.
6. Inkubieren geschnitten Module bei 37 ° C für 60 min in der 50 ml konischen Rohr.

6) Entfernen Collagen-Module von Tubing

1. Vortex 50 ml konische Röhrchen mit Modulen in den Schlauch für 10 sek.
   Hinweis: Seien Sie vorsichtig, wenn die Trennung Module mit hoher Zelldichte eingebettet, um ein Brechen zu vermeiden.
2. Lassen Sie Module an den Boden des Röhrchens absetzen. Gehzeit: ca. 5 min.
3. Mit einem breiten Mund 10 mL serologischen Pipette übertragen ständiger Module in ein 15 ml konischen Rohr.
4. Wiederholen Sie die Schritte 6,1 bis 6,3 zweimal.
5. Gehe zu 7 zu beschichten Module Schritt mit Endothelzellen oder Transfer-Module zu einer nicht-Gewebekulturen behandelte Platte.

7) Die Beschichtung der Module mit Endothelzellen

1. Settle-Module in den Boden eines 15 ml konische Röhrchen mit 5 ml Medium für the eingebetteten Zellen.
2. Entfernen Sie das Medium von den Endothelzellen und wäscht mit 5 ml PBS.
3. Entfernen PBS und 3 mL Trypsin-EDTA.
4. Inkubieren Sie die Zellen in Trypsin-EDTA für 5 min bei 37 ° C.
5. Die Zellen in 7 mL Medien.
6. Zählen von Zellen. Brauchen 5x10 ⁶ Endothelzellen pro ml verpackt Module an der Unterseite der konischen Rohr.
7. Pellet die Zellen bei 300 xg für 5 min und Resuspendieren in 5 mL Endothelzellen Medien.
8. Fügen Sie die 5 mL der Medien mit Endothelzellen zu den Modulen.
   Hinweis: Dies ergibt eine 50:50-Verhältnis der beiden Medien-Typen, die wir gefunden haben, die für das Überleben und die Funktion der beiden Zelltypen zu arbeiten. Testen Sie die Verwendung eines Co-Kulturmedium, das die richtigen Wartung von Phänotypen der beiden Zelltypen vor der Verwendung zu gewährleisten.
9. Inkubieren Sie die Module mit den Endothelzellen sowohl statisch als auch dynamisch.
10. Für statische Inkubation Mix Module mit Endothelzellen durch Inversion, und setzen Sie die Röhre aufrecht bei 37 ° C für 15 min. Wiederholen.
11. Dynamisch Samen der Endothelzellen durch sanftes Schütteln der Röhre bei 37 ° C für 60 min.
12. Wiederholen Sie die statische Inkubation zweimal.
13. Halten Sie die Module in einer nicht-Gewebekulturen behandelte Platte beimpft und über Nacht bei 37 ° C.
14. Am nächsten Tag legen Sie die Module in eine neue nicht-Gewebekulturen behandelte Platte mit frischem Medium (50:50 mischen, wenn mit Co-Kultur-System), um ungebundene endothelialen Zellen zu entfernen.
15. Inkubieren Module, die mit Endothelzellen beschichtet sind, bis sie 100% der Oberfläche der Module decken. Dies dauert in der Regel etwa 7 Tage.

8) repräsentative Ergebnisse:

Die Module werden schauen zylindrischen, wenn sie zum ersten Mal aus der Tube entfernt werden. Wenn die Module eingebetteten Zellen enthalten und / oder sind mit Endothelzellen beschichtet sie Vertrag bis zu 50% im Volumen und entwickeln eine ovale Form (Abb. 1). Die Module werden auch zu dichter und undurchsichtig, wenn sie durch Licht-Mikroskopie (Abbildung 1) angesehen. Auch wenn die Endothelzellen konfluent auf der Oberfläche der Module gibt es eine Bildung von Tight Junctions, die durch Immunfluoreszenzfärbung von VE-Cadherin (Abb. 2) zu sehen ist. Stofftransport Analyse hat gezeigt, dass die Module unterstützen können hohe Zelldichten (8x10 ⁷ Zellen / cm ^3), ohne die Entwicklung einer nekrotischen Kern aufgrund unzureichender Sauerstoff zu transportieren, die oft in größeren Gewebe problematisch (zB Module mit großem Durchmesser, D = 1,4 sind mm) (Abbildung 3).

Abbildung 1: Module Fertigung und Kontraktion. Module Kontraktion während der drei Tage nach der HUVEC-C (Endothel-Zelllinie) aufgetreten Aussaat Ergebnisse wesentlich kleineres Modul Durchmesser und Länge (p <0,001) (A). Embedded HepG2-Zellen wurden gleichmäßig innerhalb von Modulen zum Zeitpunkt der Herstellung ausgeschüttete und einbehaltene hohe Lebensfähigkeit (B). [Live-Zellen grün; toten Zellen rot] [von Corstorphine 2010 angepasst]

Abbildung 2: VE-Cadherin Immunfluoreszenzfärbung der EG enge Zellkontakte von 10 Tagen nach RAEC, wo auf der Oberfläche eines Moduls beschichtet. Balken = 50 um.

Abbildung 3: Masson-Färbung von typischen Modulen (0,76 mm anfänglichen Durchmesser) und große Module (1,4 mm anfänglichen Durchmesser) zeigen die Wirkung der Sauerstoff-Diffusion Einschränkungen. Sieben Tage nach Herstellung, hatte eine große Anzahl von toten Zellen in den Kern der großen Modulen (unten rechts) gebildet, so dass nur ein dünner Rand (~ 200 um dick) der lebensfähigen Zellen. Umgekehrt erhalten die kleinen Module ein einheitliches und hohes Vertrieb von lebenden Zellen. [Module mit HepG2 Zellen eingebettet und beschichtet mit Endothelzellen.] [Von Corstorphine 2010 getroffen]

Abbildung 4: (A) HMEC-1 ausgesät auf Poloxamin - Kollagen-Module. Nach Tag 1 der Aussaat der Poloxamin-Kollagen-Module behalten ihre zylindrische Form und gibt es nur begrenzte Zelladhäsion Eigenschaften im Vergleich zu Kollagen nur Module. Maßstab = 200 um. (B) Lichtmikroskopische Aufnahme einer Kollagen-Modul mit PLGA-biologisch abbaubaren Mikrosphären. Maßstab = 500 um.

Abbildung 5: Beispiele für in-vitro-Assays. (A) Angiogenese-Assay: Kapillar-Formationen auf dem Modul mit Endothelzellen besiedelt werden leicht erkannt und quantifiziert werden nach 5 Tagen Inkubation mit aus Fettgewebe gewonnenen Stammzellen. (B) Konfokale Mikroskopie-Aufnahmen eines Live / Dead Assay On-Module, wo die sTaining für lebende Zellen ist grün und tote Zellen rot.

Abbildung 6: Collagen-Module mit eingebetteten mesenchymalen Stammzellen und einer Oberflächenschicht aus Endothelzellen. Module wurden Schubspannung (~ 0,64 dyn / cm ²⁾ für 7 Tage in einem mikrofluidischen Kammer ausgesetzt und beginnen zu Fusion am Berührungspunkte zeigen. Endothelzellen sind mit vWF (braun) gefärbt und mesenchymalen Stammzellen Kerne erscheinen blau (H & E). Maßstab = 100 um.

Abbildung 7: Hunderte von Kollagen-Module enthalten, aus Fettgewebe gewonnenen Stammzellen (ASC) und beschichtet mit humanen mikrovaskulären Endothelzellen (HMEC) werden unter die Haut von Mäusen zu ASC / HMEC Interaktion in vivo für Fett Regeneration Anwendungen Studie implantiert.

Discussion

Wir haben verschiedene Mikro-Gewebe Verwendung von Modulen mit unterschiedlichen Zelltypen ^1-11 embedded hergestellt. Wir haben erfolgreich primären Kardiomyozyten, Inselchen, Stammzellen aus Fettgewebe und mesenchymale Stromazellen sowie mehrere Zelllinien einschließlich HepG2, NIH 3T3 und Klon 9 Leberzellen eingebettet. Wir haben die Module mit mehreren Arten von Endothelzellen einschließlich Ratte Endothelzellen, HUVEC-Zellen und humanen mikrovaskulären Endothelzellen beschichtet. Die Module sind auch mit ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Intramedic Schlauch PE60	BD Biosciences	427416	Unterschiedliche Durchmesser des Schlauchs können verwendet werden, um den Durchmesser der Module zu ändern
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	GIBCO, von Life Technologies	20012-027
Trypsin-EDTA	GIBCO, von Life Technologies	25200-072
Purcol gesäuertes Kollagen, 3 mg/mL	Cedarlane Labs	5005-B
Natriumbicarbonat	Sigma-Aldrich	S5761
20G Nadel	BD Biosciences	305175	Der Durchmesser der Nadel muss dem Durchmesser des Schlauchs entsprechen
3 mL Spritze	BD Biosciences	309585
15 mL Tube	BD Biosciences	352096
50 mL Tube	BD Biosciences	352070
Konverter Selbstversiegelnder Beutel 7 1/2” x 13”	Cardinal Health	92713
10 ml Serologische Pipette mit breiter Spitze	BD Biosciences	357504
10 ml serologische Pipette	BD Biosciences	357551
5 ml serologische Pipette	BD Biosciences	357543