Wir beschreiben die Anpassung der optischen Projektions-Tomografie (OPT) 1 Zur Bildgebung in der nahen infraroten Spektrum, und die Umsetzung einer Reihe von rechnerischen Werkzeugen. Diese Protokolle ermöglichen Einschätzungen von Pankreas-β-Zellmasse (BCM) in größeren Exemplaren, erhöhen Sie die Mehrkanal-Fähigkeit der Technik und erhöhen die Qualität der OPT-Daten.
Methodenartikel
Near Infrared Optical Projection Tomography für Assessments von β-Zellen Massenverteilung im Diabetes Research
* These authors contributed equally
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Zusammenfassung
Zusammenfassung
Durch Anpassung OPT, um die Fähigkeit der Bildgebung im nahen Infrarot (NIR)-Spektrum umfassen, wir hier zeigen die Möglichkeit, größere Körper Bild von Pankreasgewebe, wie Ratten Pankreas, und um die Anzahl von Kanälen (Zelltypen), die möglicherweise erhöhen in einer einzelnen Probe untersucht werden. Wir beschreiben die Umsetzung einer Reihe von rechnerischen Werkzeugen, die vorsehen: 1 / genaue Positionierung eines Prüflings (in unserem Fall die Bauchspeicheldrüse) Zentrum der Masse (COM) an der Rotationsachse (AR) 2, 2 / verbesserte Algorithmen zur Post Tuning-Ausrichtung, die geometrische Verzerrungen verhindert während der tomographischen Rekonstruktion 2 und 3 / ein Protokoll für Intensitätsangleichung um Signal-Rausch-Verhältnisse in OPT-basierte BCM Bestimmungen 3 zu erhöhen. Darüber hinaus beschreiben wir einen Probenhalter, die das Risiko für ungewollte Bewegungen der Probe minimiert während der Bildaufnahme. Zusammen ermöglichen diese Protokolle Einschätzungen der BCM Vertriebs-und other bietet, um im gesamten Volumen des intakten Pankreas oder in anderen Organen (zB in Studien von Inseltransplantation) durchgeführt werden, mit einer Auflösung bis auf die Ebene einzelner Langerhans-Inseln.
Einleitung
Die Insulin produzierenden β-Zellen sind der Schlüssel für die Fähigkeit des Körpers, um den Blutzucker-Homöostase zu kontrollieren. Daher sind Einschätzungen von Pankreas BCM Vertriebs unbedingt viele Bereiche der prä-klinischen Diabetesforschung. In Auswertungen von therapeutischen Regimes zum Beispiel die Auswirkungen der gezielten Genablation auf endokrine Zelldifferenzierung oder Studien von Diabetes Ätiologie in Tiermodellen für die Krankheit oft auf solche Analysen ab. Traditionell sind diese Arten von Bewertungen, die auf zeitaufwendig stereologische Ansätze schwer aufgrund der Größe und komplexen anatomischen Konstitution des Pankreas führen sind verlassen. Die meisten hochauflösende Bildgebung Ansätze zur Zeit (in der Regel optisch), bieten keinen ausreichenden Eindringtiefe gesamte Bauchspeicheldrüse Bildgebung bei Nagetieren zu ermöglichen. Umgekehrt bieten bildgebenden Verfahren, die nicht durch ihre Eindringtiefe (typischerweise nuklearen) beschränken sich auf schlechte Auflösung, um die volle BCM Verteilung zu lösen und werden behindertdurch den Mangel an geeigneten Kontrastmittel 4,5.
Optische Projektion Tomographie ist ein 3D-Bildgebungsverfahren, die hochauflösende Einschätzungen der biomedizinischen Proben können auf dem mm-bis cm-Skala 6. Hiermit können auch Informationen über die räumliche Lage und das Volumen des einzelnen Insulin exprimieren Langerhans-Inseln über das gesamte Volumen der Bauchspeicheldrüse in normalen und diabetischen Mäusen 3,7-10 extrahiert werden. Das Ziel der vorliegenden Studie ist zur weiteren Verbesserung der Fähigkeit dieser Technik für die Beurteilung von pankreatischen β-Zellen; ihrer endogenen Verteilung, wenn sie in anderen Geweben, ihrer Beziehung zu anderen Pankreas Bestandteile (wie infiltrierenden Zelltypen) und in größeren gepfropften Pankreas-Präparate als bisher möglich.
Die Nah-Infrarot-optischen Projektion Tomographie (NIR-OPT) setup
In der unten Protokolle, eine OPT-Scanner auf dem ursprünglichen Satz durch Sharpe beschriebenen Basis et al 1, angepasst, um Bildgebung im nahen Infrarotbereich wird beschrieben und eingesetzt. Für einkanalige Beurteilungen der Bauchspeicheldrüse der Maus (zB von BCM), kann der SkyScan 3001 (Bioptonics)-Scanner verwendet werden.
Metallhalogenidlampe, die höher ist als Anregungsenergie einer Quecksilberbogenlampe bietet bei Wellenlängen über 650 nm, liefert das Anregungslicht. Das Licht wird durch eine Flüssigkeit Lichtleiter übertragen. Eine sinnvolle Kombination von Farbstoffen und Bandpass-Filter für NIR Fluoreszenz-Bildgebung und Kanaltrennung sind in Abbildung 3 dargestellt. Das emittierte Licht wird mit einer Rückseite beleuchtet CCD-Kamera detektiert, mit hohem Quantenwirkungsgrad im NIR-Spektrum. Das OPT Scannen automatisiert über eine LabView-Plattform, die die Kamera steuert und Schrittmotor. Proben, die in der Größe von intakten Ratten Pankreas, einem geschützten versilberten Spiegel und einem großen Küvette unterstützt wird. Schließlich wird ein Probenhalter, die beseitigt unerwünschte vertikale movements der Probe während der Untersuchung wurde entworfen.
Protokoll
Ein. Probenvorbereitung und Scanning
1,1 Probenvorbereitung
Das folgende Verfahren wird im Wesentlichen wie zuvor beschrieben 7 durchgeführt.
- Ernten die Bauchspeicheldrüse. Verwenden eiskaltem PBS gegen proteolytischen Abbau zu vermeiden.
- Fixierung des Gewebes in 4% PFA in PBS auf Eis für 2-3 Stunden. Stellen Sie sicher, dass die Lappen sind während der Fixierung "ausgebreitet" werden. Dies erleichtert Identifikation von anatomischen Landmarken nach dem Wiederaufbau.
- Waschen über PBS für 30 min.
- Entwässern der Bauchspeicheldrüse stufenweise in Methanol (33, 66%, 100%), 15 min / Schritt. Dies minimiert die Bildung von Blasen beim Bleichen (siehe Schritt 5) und verhindert Zell-Zerstörung im Gefrier-Auftau (siehe Schritt 7).
- Inkubieren des Gewebes in frisch hergestelltem MeOH: H 2 O 2: DMSO Bleichen Puffer in einem Verhältnis 02.01.03 bei RT für 24 h, um endogene Gewebefluoreszenz quenchen. Für größere Proben, Austausch, neue bleaching-Puffer und Inkubation für weitere 24 Stunden.
- Waschen über MeOH, ON.
- Gefrier-Tau für mindestens 5 Zyklen in -80 ° C - RT, um Antikörper Durchdringung zu erleichtern.
- Rehydrieren schrittweise zurück zu TBST (33, 66%, 100%), 15 min / Schritt.
- Block in TBST mit 10% Serum (vorzugsweise von der gleichen Spezies, in dem der sekundäre Antikörper generiert wurde), 5% DMSO und 0.01% naaz für 12-24 h bei RT
- Inkubieren mit primären Antikörpern in Blocking-Puffer für 48 Stunden bei RT bis 72 hr für größere Proben (hier verwendeten Antikörper sind in der Tabelle aufgeführt von Reagenzien) erstrecken.
- Waschen über TBST, ON.
- Inkubieren mit fluoreszierend konjugierten Sekundärantikörper für 48 h bei RT bis 72 h für größere Proben zu verlängern.
- Waschen über TBST, ON.
1,2
Das folgende Verfahren beschreibt, wie die Probe in Agarose montieren und verbinden Sie es mit der maßgeschneiderten Probenhalter (siehe Abbildung 7) Vor dem Scannen entscheiden.
- Trennen Sie die Milz, Zwölffingerdarm und Magen-Lappen nach 3A in Hörnblad et al Abbildung 3. Die Beziehung zwischen den Lappen wird in Hörnblad et al 11 verdeutlicht.
- Planen 1,5% (w / v) Agarose mit niedriger Schmelztemperatur in dH 2 O, Filter, lassen auf 37 ° C abkühlen und spült das Gewebe in dH 2 O abzuwaschen das Waschmittel und Blasen zu entfernen, bevor Agarose-Einbettung auf Eis.
- Ausschneiden eines Agarose-Block umschließende Ihre Probe und hinterlassen ein ~ 1 cm Abstandshalter zwischen der Probe und dem Boden der Agarose. Trimmen scharfen Kanten (≤ 90 °) des Agaroseblock um Lichtstreuung zu reduzieren.
- Dehydratisieren stufenweise die Probe in MeOH (33, 66%, 100%), so dass genügend Zeit, um zwischen jedem Schritt äquilibrieren. Wenn die Probe sinkt es gilt als äquilibriert.
- Deaktivieren Sie die Probe in einer 1:2-Lösung von Benzyl Alcohol: Benzyl Benzoat (BABB), bis sie transparent wird. Börse BABB Lösung, Inkubation für eine zusätzliche 12 Stunden.
- Positionieren Sie den geräumt Probe in den Probenhalter und sichern Sie sie, indem Sie 2 Nadeln durch die Agarose Abstandhalter über die Bohrungen in den Flanschen des Halters.
- Legen Sie die Probe in den Scanner und tauchen sie in eine Küvette mit BABB Clearing-Lösung gefüllt. Beim Vergleich einer Reihe von Bauchspeicheldrüsen die gleiche Vergrößerung sollte für alle Scans verwendet werden. Die Vergrößerung sollte für die größte Probe in der Folge optimiert werden.
1,3 Positionierung der Probe unter dem AR
Das folgende Protokoll beschreibt das Verfahren exakt zu positionieren eine Stichprobe mithilfe des COM-AR-Algorithmus. Dieses Verfahren ist nur anwendbar, wenn der ROI umfasst die gesamte Probe. Für eine detaillierte Beschreibung der Algorithmen finden Sie Cheddad et al 2.
- Erwerben Sie Bilder der Probe in zwei Positionen für both die Anatomie und Signalkanäle. Position 1 bei 0 ° (verbunden mit der X-Achse), Anzeigen des größten Projektionsfläche, und die Position 2 bei 90 ° (in Verbindung mit der Z-Achse). Wir sind mit dem GFP-Kanal, um die Anatomie zu visualisieren.
- Übernehmen die Erwartung Maximierung (EM) Algorithmus auf die Anatomie Bilder Schwelle des ROI.
- Berechne die COM Punkte (x-Koordinaten) der binären Bilder in Schritt 2 sowohl für die 0 ° und 90 ° Vorsprünge erhalten.
- Überlagern eine vertikale Linie, die durch den identifizierten COM Punkt in Schritt 3 auf der 0 ° und 90 °-Bilder des Signals Kanal berechnet.
- Verwenden Sie die Bilder in Schritt 4 erworbenen verweist auf die Probe, so dass die Mittellinie des Field of View durch die gefundenen COM Punkte der Probe passiert bewegen.
1,4 Scanning
- Passen Belichtungszeiten das höchste Signal-Rausch-Verhältnis zu erzielen, ohne saturating alle Bereiche der Projektionsbilder. Wiederholen Sie dies für alle Kanäle gescannt werden.
- Wählen Sie den Filter-Set für die erste Fluoreszenz-Kanal abgetastet werden. Emission von kürzeren λ Fluorophore können Fluorophore mit mehr λ erregen und dadurch zu bewirken, photo Bleichen. Um diese Gefahr zu minimieren, scannen Sie das Fluorophor mit der längsten Anregung λ erste.
- Öffnen des Verschlusses, um die Probe zu beleuchten und sammelt das Fluoreszenzsignal über 360 ° Drehung der Probe entlang der vertikalen Achse für jeden Kanal. Der Schritt Winkel für die NIR-OPT-Setup verwendet wird, ist 0,9 ° und für die Bioptonics 3001 scanner 0,45 °.
- Wählen Sie den entsprechenden Filter für die nächsten Kanal und weiter wie oben.
2. Computational Verarbeitung und Wiederaufbau
2,1 Post-Akquisition Versatz Erkennung und Korrektur (A-Wert tuning)
In Projektionstomografie, ist es im Allgemeinen notwendig,eine post-Abgleichwert den Projektionen für die Feinabstimmung der Bilder entlang der Drehachse vor der Rekonstruktion zuweisen. Allerdings kann eine kleine Aberration in dem Winkel der Kamera in Richtung der optischen Achse ungleichmäßige A-Werte entlang der Länge der Probe verursachen und somit zu induzieren geometrische Verzerrungen. Um solche Verzerrungen zu vermeiden, kann eine rechnerische Methode, um die genaue und einheitliche post-Ausrichtung (A-Wert) in der gesamten Probe zu finden 2 angewendet werden.
- Verwenden einer diskreten Fourier-Transformation, um einen Vorsprung des spezifischen Signals bei 0 ° und 180 ° in acht Pixel Höhe Blöcke unterteilen und berechnen die Verschiebung entlang der x-Achse (A-Wert) zwischen jedem Block.
- Anwenden einer linearen Regression der kleinsten Quadrate zu berechnen, um den Winkel θ ', der die Neigung der X-Achse-Schicht entlang der Länge der Probe beschreibt, und einen Drehmittelpunkt zu finden.
- Zu korrigieren Fehlstellungen während des Scannens durch Drehen alle projections θ '/ 2 um den Drehmittelpunkt.
2,2 Kontrast begrenzte adaptive Histogrammentzerrung (CLAHE)
Um die Erkennung und Segmentierung von Objekten (Inselchen) Aussteller sehr schwache Signale, die in Gefahr sind, um "einem Schwellenwert out" werden beim Wiederaufbau und / oder Segmentierung für quantitative Einschätzungen zu erleichtern, kann ein CLAHE Algorithmus auf die Projektionsfläche Bilder angewendet werden. Die CLAHE Betrieb mit zwei großen Intensität Transformationen durchgeführt:
- Der lokale Kontrast wird geschätzt und entzerrten innerhalb nichtüberlappende Blöcke in dem Projektionsbild.
- Die Intensitäten werden dann an den Grenzregionen zwischen den Blöcken durch bilineare Interpolation normalisiert.
Der Name kontraststeigernde begrenzten bezieht sich auf den Clip Grenze, die auf Sättigen Pixel in dem Bild zu vermeiden. In diesem Protokoll, das MATLAB eingebaute Funktion "adapthisteq" verwendet wurde und mit dem Standard-c angewendet Lippe Grenze von 0,01 und eine Fliese von 256. Anmerkung, muss die optimale Kachelgröße empirisch getestet werden und kann je nach der Probe analysiert. Mehr Details über den Algorithmus und Beispiele finden Sie in Hörnblad et al 3 gefunden werden.
Hinweis! Die oben aufgeführten Computational Verarbeitungsschritte (einschließlich COM-AR, A-Value-Tuning und CLAHE, siehe 1,3-2,2) werden auf Standard-Algorithmen gebaut und sind in MATLAB (Mathworks) ausgeführt.
2,3 tomographische Rekonstruktion und Iso-Oberflächen-Rendering
- Verwendung einer gefilterten Rückprojektion Algorithmus können die korrigierten und normierten Bilder nun mit einheitlichen Verlagerungsfähigkeit und minimale Erfordernis zur Optimierung des dynamischen Bereichs rekonstruiert werden. In diesem Protokoll werden alle Rekonstruktionen unter Verwendung der gefilterten Rückprojektion Verfahren verfügbar, bei dem NRecon Software (Skyscan), Version 1.6.8 durchgeführt (= "_blank"> Http://www.skyscan.be/products/downloads.htm). Anmerkung hängt die Vergrößerung von einem abgebildeten Objekt auf seinen Abstand von dem Brennpunkt der Linse sofern Parallelstrahlgeometrie im Abbildungsstrahlengang Setup implementiert ist. Daher beim Importieren einer Projektionsdatensatz der NRecon Software ist es wichtig, das richtige Objekt zur Quelle (mm) und Drehrichtung des Scanners (für Gegenuhrzeigersinn Eingang "cc" und für Rechts-Eingang "cw") in der begleitenden gehören Log-Datei, die Cone-Beam-induzierte Artefakte beim Wiederaufbau zu vermeiden.
- Zur Visualisierung und Quantifizierung der Stapel virtuelle Schnitte erhalten, erzeugen 3D-Iso-Oberflächen mit geeigneten Bildverarbeitungssoftware wie Imaris oder Volocity.
Murine Inselisolierung und Transplantationen wurden bei Präklinische Zelle das Diabetes Research Institute Verarbeitung und Translational Modell Kern unter Protokolle bewertet durchgeführt und von der University of Miami Institutional Animal Care und Use Committee. Die Ethikkommission für Tierversuche, Nordschweden, genehmigt alle anderen Experimente mit Tieren.
Ergebnisse
In dem aktuellen Bericht beschreiben wir ein Protokoll für die Extraktion und rechnerische Verarbeitung der BCM-Daten in Nagetier-Pankreas (und anderen Geweben) mit NIR-OPT (Abbildung 1). Wie in 2 dargestellt ist, wird Gewebe aus pankreatischen autofluorescense Probe erwartungsgemäß deutlich im NIR-Spektrum ab. Dies führt zu einem signifikanten Anstieg des mittleren Signal-Rausch-(S: N-Verhältnis) für die Beurteilung von Insulin markierten Langerhans-Inseln. Der von den Änderungen von OPT zur Bildgebung im NIR Bereich des Spektrums, wie hierin beschrieben, können mindestens drei spezifischen Kanälen visualisiert werden mit ausreichender S: N-Verhältnis, eine Prüfung der Antikörper markiert Zelltypen im gesamten Volumen des murinen Pankreas mit ausgeprägten ermöglichen Kanaltrennung (siehe Abbildung 3 und 4). Angewandt auf Bildgebung von diabetogenen Prozesse und / oder BCM-Einschätzungen im Allgemeinen die Technik ermöglicht somit zur Visualisierung und QuantifizierungInsulin-positive Bereiche in Bezug auf die Umgebung und / oder Interaktion Zelltypen (siehe Abbildung 4). Solche Erwägungen sind dank der erhöhten Gewebe Eindringtiefe in den NIR-Bereich möglich erhalten, um in viel größeren Proben als bisher, einschließlich der Ratte Bauchspeicheldrüse, die 3-5 mal größer als die Maus-Gegenstück (siehe Abbildung 5) ist durchzuführen. Unabhängig davon, ob sichtbar oder NIR-Wellenlängen eingesetzt werden, kann die Umsetzung der CLAHE wesentlich erleichtern OPT Assessments von BCM in verschiedenen genetischen und physiologischen Bedingungen durch die Erhöhung der Nachweisempfindlichkeit der Technik (siehe Abbildung 6). Eine Blaupause für die entwickelten Probenhalter ist in Abbildung 7 dargestellt.
Abbildung 1. Flussdiagramm, das die entscheidenden Schritte für OPT Analysen der BCM in der murine Bauchspeicheldrüse. Die erforderliche Zeit, um eine typische Maus Bauchspeicheldrüse beurteilen 13-14 Tage. Der Großteil der Zeit während Gewebeverarbeitung und immunhistochemische Färbung (10 Tage) verbraucht wird, benötigt Gewebe Lichtung etwa 2 Tage, während die Länge der Abtastung ist abhängig von der Einwirkzeit erforderlich (in der Regel ca. 1 h). Die anschließende Rechenverarbeitung wird typischerweise innerhalb eines Tages durchgeführt. Bemerkungen wird relativ langwierig Färbeprotokoll idealerweise für die Stapelverarbeitung von größeren Mengen an Proben.
Abbildung 2. Signal-Rausch-Verhältnisse für BCM Einschätzungen bei verschiedenen Wellenlängen. Eine Maus Zwölffingerdarm Pankreas lobe, für Insulin und mit einem Cocktail von Fluorochrom-konjugierten Sekundärantikörper (Alexa 488, 594, 680 und gefärbt750), wurde verwendet, um zu bestimmen S: N-Verhältnis bei unterschiedlichen Wellenlängen. A, Bilder zeigen den ersten Vorsprung Rahmen für jeden Signalkanal. B, graphische Darstellung der mittleren S: N für jeden Signalkanal. Die Verhältnisse wurden als der Mittelwert islet Intensität (bezogen auf 215 Inselchen) durch die Hintergrund-Intensität (die endogenes Gewebe Fluoreszenz aus dem exokrinen Gewebe) dividiert wird. C, Graph zeigt S: N-Verhältnisse für die einzelnen Inseln in jedem Kanal, normiert auf die S: N für die Alexa 594-Kanal erhalten. Ein Weg ANOVA wurde für statistische Auswertungen verwendet. Signifikanzniveaus angegeben entsprechen ** p <0,01. Maßstab in (A) entspricht 1 mm. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
Abbildung3. Kanaltrennung. Ein wurden Sekundärantikörper konjugiert mit AlexaFluor Farbstoffe in der Tabelle aufgeführten separat auf ProteinG-Sepharose-Kügelchen immobilisiert. B, wurden die fluoreszierende Kügelchen dann auf verschiedenen Ebenen in einem Agarose-Phantom eingebettet und bebildert mit angegebenen Filter.
Abbildung 4. OPT Multichannel Bildgebung in der Diabetes-Forschung. A, OPT iso-Oberfläche Rekonstruktion eines Pankreas (12 Wochen, Zwölffingerdarm lobe) aus dem Non Obese Diabetic (NOD)-Modell für Typ-1-Diabetes basiert. Glatte Muskulatur α-Actin (Blutgefäße, rot) und CD3 (infiltrierenden T-Lymphozyten, grün); Die Probe wird für Insulin (Inselzellen β-Zellen, Pseudo blau gefärbt) gefärbt. Die entsprechenden Sekundärantikörper verwendet wurden; Cy3, IRDye-680 und DyeLight-750 jeweils. DieEinsätze (A'-A'' ') zeigen die einzelnen Signalkanäle. B, OPT Bild (blow up view) einer Maus Leberlappen (Lobus sinister lateralis) mit syngenen Inselchen gepfropft und bebildert mit NIR-OPT zwei Wochen nach Transplantation. Die Insulin Ausdruck Inseln sind in blau pseuodocolored und die glatte Muskulatur α-Aktin positive Gefäße sind in rot. Der Ansatz ermöglicht Einschätzungen der Insel Transplantat innerhalb des vaskulären Netzwerk. Maßstabsbalken bis 1 mm entsprechen.
Abbildung 5. NIR-OPT erleichtert die Darstellung von größeren Exemplaren. A, Iso-Oberflächen-Rendering des BCM-Verteilung in einem Rattenpankreas aus dem Zucker Fatty Modell für Typ-2-Diabetes (Lobus Splenicus um 9 Monate), die beispielgebend für die Möglichkeit, Bild Probe auf der Ratte Bauchspeicheldrüse Skala durch NIR-OPT. Wie ermitteltdurch diese Technik die angezeigte Lappen ist ~ 6 mal größer (v / v) als sein Gegenstück und Maus birgt 10.139 Insulin exprimieren Langerhans-Inseln, deren β-Zellvolumen macht 1,32% des gesamten Volumens lobuläre. B, tomographische Schnitt entsprechend der gestrichelten Linie in (A) darstellt, daß Inseln aus allen Tiefen des Gewebes detektiert werden. C, Iso-Oberflächen-Rendering des BCM Verteilung in einer Maus Bauchspeicheldrüse (Milz lobe nach 8 Wochen) als Größenangabe angezeigt. Die angezeigte Lappens birgt 2490 Insulin exprimieren Inselchen deren β-Zellvolumen macht 0,89% des gesamten Volumens lobuläre. Die Bauchspeicheldrüsen mit GP Anti-Insulin durch Alexa594 konjugiertem Ziegen-Anti-GP (Maus) und IRDye 680 Konjugierte Esel anti-GP (Ratte) bzw. Antikörper verfolgt angefärbt. Die Exemplare (AC) mit Skala und dem Balken in (C) entspricht 2 mm dargestellt.
Abbildung 6. CLAHE erleichtert den Nachweis von Inseln in der murinen Bauchspeicheldrüse durch OPT Bildgebung. AC, Vertreter iso-gerendert OPT Bilder einer C57BL / 6 Mäuse Bauchspeicheldrüse (Milz lobe nach 8 Wochen) für Insulin gekennzeichnet. Isofläche Rekonstruktionen OPT Bilder wurden zuvor durchgeführt (A, Pseudo grün) und nach dem CLAHE Protokoll wurde aufgebracht (B, Pseudo rot eingefärbt). C, Overlay der nicht normalisierten Daten in (A) und die verarbeiteten Daten in CLAHE (B). C'-C rot-only "Inseln", Repräsentative hoher Vergrößerung Überlagerung der nicht normalisierten (A) und CLAHE verarbeiteten (B) Bildern. Als durch die Anwesenheit von gezeigte "erleichtert der CLAHE Skript den Nachweis von kleinen und niedrige Signal Intensität Inselchen. In dem aktuellen Beispiel der abgebildete Exemplar (nach CLAHE Verarbeitung) hegte 2419 Inseln mit einem Volumen von 1,74 mm 3 (Zahlen auf den entsprechenden unverarbeitete Projektionsdaten, betrug 1057 Inseln with einem Volumen von 1,77 mm 3). D und E, Beispiel Daten von der Steuerung (D) und der ob / ob-Maus-Modell für Diabetes Typ 2 12 (E) nach 6 Monaten Durchführung des CLAHE Protokoll. Beachten Sie die massiven allgemeinen Anstieg der Insel Größe in der ob / ob Bauchspeicheldrüse (E). In (D) und (E) die Bauchspeicheldrüse Umriss (grau) wird auf dem Signal von Gewebeautofluoreszenz basiert. Maßstab in C ist 500 um in AC. Maßstabsbalken in C "entspricht 200 um in C 'und C''. Maßstabsbalken in E entspricht 1 mm in (D) und (E). Bilder in (AC) aus Hörnblad et al 3 angepasst und wurden unter Verwendung der Bioptonics 3001 Scanner.
Abbildung 7. Probenhalter zur Befestigung OPT Proben. Die Probe wird durch Einführen der Nadeln durch Agarose Abstandshalter über die vorgebohrten Löcher der Flansche befestigt ist. Der Halter ist an dem Schrittmotor über einestarken Magneten in ihrer Basis entfernt. Dieser Aufbau lässt die Verwendung von instabiler Leimen und verhindert unerwünschte Bewegungen der Probe während des Scannens.
Diskussion
Die beschriebenen Techniken für OPT Bildgebung ermöglicht die Extraktion von räumlicher und quantitativen Parameter über das gesamte Volumen des murinen Bauchspeicheldrüse. Aufgrund von Einschränkungen in erreichbare Auflösung für diese Art der bildgebenden mesoskopischen ist anzumerken, dass wie bei den meisten bildgebenden Verfahren, je größer die Probe je niedriger die Auflösung (Obwohl die Verwendung einer höheren Auflösung CCD sollte die Auflösung des OPT Scan erhöhen) . Daher ist für die Beurteilung der intakten Pankreas Maus Lappen, wird die Technik zur Zeit keine einzelne Zelle Auflösung obwohl schließen (ca. 15-20 um) 7. Doch für die Extraktion von BCM Verteilung in der Maus Bauchspeicheldrüse die Protokolle Daten, die mehr als gut übereinstimmen, die vom Zählen zB Punkt Morphometrie 3,13 erhaltenen Es sollte angemerkt werden, dass, obwohl vorgesehen Durchführung des CLAHE Protokoll ermöglicht zum Nachweis von signifikant mehr Inselchen Diese Inseln sind meist kleiner und nicht Beitragte im Wesentlichen den gesamten β-Zellen Bände.
Die immunhistochemischen Protokollen beteiligt sind relativ lange (bis zu zwei Wochen), aber die eigentlichen Hände auf Zeit für die Probenvorbereitung ist kurz und somit die Technik ist gut für die Untersuchung von großen Kohorten von Tieren 9 geeignet. Wenn das Potential der heterogenen Verteilungsmuster ist ein Schwerpunkt für die Untersuchung, darauf hinzuweisen, dass Pflege in den Maßnahmen sollten ergriffen werden über Fixierung und Montage zu vermeiden, dass das Pankreasgewebe wird in ungünstiger Weise fixiert und eine flache ("ausgebreitet" werden ) mount des Gewebes sollte für solche Prüfungen erleichtern angestrebt werden.
Ein wichtiger Punkt bei der Durchführung von OPT ist, dass die Probe COM an der Drehachse befestigt ist, und dass es nicht zu bewegen, entweder vertikal oder horizontal, während des Scanvorgangs. Daher ist es wichtig, eine stabile mechanische Aufbau und ein gut funktionierendes System zur attachi habenng der Probe. Wir lösten dieses Problem, indem er eine neue Halterung (Abbildung 7).
Parallelgeometrie stimmte nicht für unsere NIR-OPT oder Bioptonics 3001-Scanner, der als vertikale Verschiebung zwischen der hinteren und vorderen Stellungen der peripheren Objekten in den Projektionsbildern aufgezeichnet erkannt wurde. Durch Einstellen des Objekts Source Abstand in der Log-Datei des jeweiligen Scanners (siehe 2.3.1) konnten wir deutlich verbessern die Qualität unserer Daten und korrigieren für geometrische Verzerrungen an den weit Kanten der Projektionsfläche Bilder, die von besonderer Bedeutung ist, wenn Beurteilung größeren Exemplaren.
In dem aktuellen Protokoll, bieten wir einen Vorschlag von Filter-Sets, die Visualisierung von drei verschiedenen spezifischen Kanälen und einer "Anatomie"-Kanal bei der Beurteilung der intakten Pankreas Präparate ermöglichen. Offensichtlich sind diese Einstellungen können angepasst werden, um besser auf die Fluorochrome für eine gegebene Studie zwar genutzt, wie bei allen Formen der Fluoreszenzcent Mikroskopie, sollte die potenzielle Gefahr des Signals Durchbluten sorgfältig evaluiert werden. Die Studie von Insulin markierten Inselchen mit Fluorochromen, die oberhalb von 750 nm angeregt werden noch nicht von uns mit dem Metallhalogenidlampe dass unsere Einrichtung nutzt möglich. Es ist möglich, dass eine Kamera mit noch höheren Quantenausbeute in den entsprechenden Wellenlängen in Kombination mit alternativen Lichtquellen (zB Diodenlasern) könnte das Potential der NIR-OPT weiter steigern und damit zur Bildgebung bei noch höheren Wellenlängen.
OPT-Bildgebung ist eine sehr vielseitige Technik zur räumlichen und quantitative Einschätzungen der biomedizinischen Probe auf dem mm-cm-Skala. Obwohl die hier präsentierten Protokolle für den Hauptzweck Bauchspeicheldrüse / Diabetesforschung entwickelt wurden sie sollte möglich sein, die Forschung an anderen Spezies, Probentypen und Marker zu übersetzen. Durch die Möglichkeit, mehrere verschiedene Kanäle in intakten Pankreas Vorbereitungen visualisieren, NIR-OPT Bildgebung feitere birgt das Potenzial als ein Werkzeug, um die Aufnahme Spezifität von Kontrastmitteln für die nicht-invasive Einschätzungen anderen bildgebenden Verfahren, solange diese Kontrastmittel gestalten könnte zu tragen auch eine Fluorophor nachweisbar OPT werden soll auszuwerten.
Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Dr. P. Lindström ist für die Bereitstellung ob / ob Mäusen bestätigt. J. Lehtonen ist für die Unterstützung bei Video-Produktion und J. Gilbert für die Hilfe bei Bearbeitung anerkannt. (JS und: Diese Studie wurde durch Zuschüsse aus dem Diabetes Research Institute Foundation (AP), der Juvenile Diabetes Research Foundation (AP and UA), der Europäischen Kommission (. CP-IP 228933-2 FP-7, Zuschussvereinbarung no) unterstützt UA), die Kempe Foundations, Umeå University und dem schwedischen Forschungsrat UA
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Name des Reagenz / Material | Firma | Catalog Number | Kommentare |
| Methanol | Scharlau | ME03162500 | |
| 30% H 2 O 2 | Scharlau | HI01362500 | |
| Benzylalkohol | Scharlau | AL01611000 | |
| Benzyl Benzoate | Scharlau | BE01851000 | |
| Low-Schmelzpunkt Agarose | LONZA | 50100 | |
| Paraformaldehyd (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Mouse anti-Asma-Cy3 | Sigma-Aldrich | C6198 | Primärantikörpers |
| Rabbit anti-CD3 | Sigma-Aldrich | C7930 | Primärantikörpers |
| Guinea Pig anti-Ins | DAKO | A0564 | Primärantikörpers |
| Esel anti GP-IRDye680 | LI-COR Biosciences | 926-32421 | Sekundärantikörpers |
| Ziege anti Rb-DyeLight750 | Thermo Scientific | 35570 | Sekundärantikörpers |
| Ziege anti GP-Alexa594 | Molecular Probes | A-11.076 | Sekundärantikörpers |
| Ziege anti GP-Alexa488 | Molecular Probes | A-11008 | Sekundärantikörpers |
| Ziege antiGP-Alexa594 | Molecular Probes | A-11012 | Sekundärantikörpers |
| Ziege anti GP-Alexa680 | Molecular Probes | A-21.076 | Sekundärantikörpers |
| Ziege anti GP-Alexa750 | Molecular Probes | A-21.039 | Sekundärantikörpers |
| OPT Skyscan 3001 | Bioptonics | OPT-Scanner | |
| Leica MZ FLIII | Leica Microsystems | Stereomikroskop | |
| Leica Objektiv 0.5x | Leica Microsystems | 10446157 | |
| Leica Camera Adapter 1.0x | Leica Microsystems | 10445930 | |
| EL6000 Metal Halide | 11504115 | Lichtquelle | |
| Liquid Light-Führer | 11504116 | ||
| Cuvette | Hellma Analytics | 6030-OG | 55 x 55 x 52,5 mm |
| Spiegel | Edmund Optics | F68-334 | 50 x 50 mm |
| Andor Ikon-M | Andor Technology | DU934N-BV | Back-illuminated CCD |
| Filterset | Chroma Technology | 41.021-MZFLIII | TXR, Alexa-594, Cy3 |
| Filterset | Chroma Technology | 41.022-MZFLIII | IRDye680, Alexa-680 |
| Filterset | Chroma Technology | 49.037-MZFLIII | Dylight750, Alexa-750 |
| ProteinG-Sepharose-Kügelchen | GE Healthcare | 17-0618-01 | Protein G Sepharose 4 Fast Flow |
| Natriumazid | Sigma-Aldrich | 08591 | Natriumazid 0,1 M Lösung |
Referenzen
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- Cheddad, A., Svensson, C., Sharpe, J., Georgsson, F., Ahlgren, U. Image Processing Assisted Algorithms for Optical Projection Tomography. IEEE Trans. Med. Imaging. , (2012).
- Hornblad, A., Cheddad, A., Ahlgren, U. An improved protocol for optical projection tomography imaging reveals lobular heterogeneities in pancreatic islet and beta-cell mass distribution. Islets. 3, 204-208 (2011).
- Holmberg, D., Ahlgren, U. Imaging the pancreas: from ex vivo to non-invasive technology. Diabetologia. 51, 2148-2154 (2008).
- Ahlgren, U., Gotthardt, M. Approaches for imaging islets: recent advances and future prospects. Adv. Exp. Med. Biol. 654, 39-57 (2010).
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- Alanentalo, T., et al. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nat. Methods. 4, 31-33 (2007).
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Nachdrucke und Genehmigungen
Erratum
Formal Correction: Erratum: Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of β-cell Mass Distribution in Diabetes Research
Posted by JoVE Editors on 11/05/2018. Citeable Link.
A correction was made to Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of β-cell Mass Distribution in Diabetes Research. In Protocol section 1.1, the order of the listed chemicals MeOH:H2O2:DMSO has accidentally been switched and should instead be MeOH:DMSO:H2O2.
Protocol section 1.1 was changed from:
Incubate the tissue in freshly prepared MeOH:H2O2:DMSO bleaching buffer in a 2:1:3 ratio at RT for 24 hr to quench endogenous tissue fluorescence. For larger samples, exchange to new bleaching buffer and incubate for another 24 hr.
to:
Incubate the tissue in freshly prepared MeOH:DMSO:H2O2 bleaching buffer in a 2:1:3 ratio at RT for 24 hr to quench endogenous tissue fluorescence. For larger samples, exchange to new bleaching buffer and incubate for another 24 hr.
