Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Brug af Label-fri Optiske Biosensors Detect Modulation af kalium kanaler af G-protein koblede receptorer

Published: February 10, 2014 doi: 10.3791/51307
Automatic Translation
1, 3, 1,2
1Department of Pharmacology, Yale School of Medicine, 2Department of Cellular and Molecular Physiology, Yale School of Medicine, 3X-BODY Biosciences

Summary

Optisk biosensor teknikker kan detektere ændringer i massen nær plasmamembranen i levende celler og tillader en at følge cellulære reaktioner i både individuelle celler og populationer af celler. Denne protokol vil beskrive detektion af modulation af kaliumkanaler af G-protein-koblede receptorer i intakte celler ved hjælp af denne fremgangsmåde.

Abstract

Lonkanaler styre de elektriske egenskaber af neuroner og andre exciterbare celletyper ved selektivt at tillade ioner at strømme gennem plasmamembranen 1. Til regulering af neuronal excitabilitet, er de biofysiske egenskaber af ionkanaler modificeret ved signalproteiner og molekyler, der ofte binder til kanalerne selv til dannelse af et heteromert kanal kompleks 2,3. Traditionelle analyser undersøger samspillet mellem kanaler og regulatoriske proteiner kræver eksogene etiketter, der potentielt kan ændre proteinets opførsel og mindske den fysiologiske relevans af målet, men samtidig give lidt information om tidsforløbet af interaktioner i levende celler. Optiske biosensorer, såsom X-BODY Biosciences BIND Scanner-system, skal du bruge en ny etiket-fri teknologi, resonans bølgelængde rist (RWG) optiske biosensorer, at påvise ændringer i resonant reflekteret lys nær biosensor. Dette assay muliggør påvisning af den relativeÆndringen i massen i den nederste del af levende celler adhærente til biosensoroverfladen følge ligand inducerede ændringer i celleadhæsion og spredning, toksicitet, spredning, og ændringer i protein-protein interaktioner i nærheden af ​​plasmamembranen. RWG optiske biosensorer er blevet anvendt til at detektere ændringer i massen i nærheden af ​​plasmamembranen i celler efter aktivering af G-proteinkoblede receptorer (GPCR), receptortyrosinkinaser og andre celleoverfladereceptorer. Ligand-inducerede ændringer i ion-kanal-protein-interaktioner kan også undersøges ved hjælp af dette assay. I dette papir vil vi beskriver den eksperimentelle procedure, der anvendes til at detektere modulation af Slack-B natrium-aktiverede kalium (K Na) kanaler ved GPCRs.

Introduction

Undersøgelse levende celler i deres fysiologisk relevant kontekst er afgørende for at forstå de biologiske funktioner af cellulære mål. Men analyser undersøger samspillet mellem kanaler og regulatoriske cytoplasmatiske proteiner, såsom coimmunoprecipitation assays generelt give lidt information om tidsforløbet for interaktioner i levende celler. Størstedelen af ​​de nuværende cellebaserede assays måler en specifik cellulær begivenhed, såsom translokationen af ​​en fluorescens-mærkede protein af interesse. Disse analyser kræver modifikationer af proteiner af interesse, som potentielt kan ændre proteinets adfærd og reducere den fysiologiske relevans af målet. Noninvasiv cellebaserede assays, der ikke kræver manipulation af systemet, tilvejebringer en kontinuerlig måling af cellulær aktivitet, og som tillader undersøgelser af celler i deres mest fysiologisk relevante tilstand 4.

Optiske biosensorer er designet til at producereen målelig ændring i en egenskab af det lys, der er koblet til sensoroverfladen. Optiske biosensorer, som anvender flygtige bølger, som omfatter overfladeplasmonresonans (SPR) og resonans bølgelængde rist (RWG) teknikker, primært blevet anvendt til at påvise affiniteter og kinetik af molekyler, der binder til deres biologiske receptorer immobiliseret på sensoroverfladen. For nylig er kommercielt tilgængelige RWG biosensorer er blevet udviklet for at muliggøre påvisning af den relative ændring i massen i den nederste del af cellerne adhærerende til sensoroverfladen ved høj rumlig opløsning (op til 3,75 mM / pixel) 5. Disse biosensorer kan detektere ændringer i massen i nærheden af plasmamembranen af levende celler, der skyldes stimulation, såsom celleadhæsion og spredning, toksicitet, proliferation og signalveje fremkaldt af en række af celleoverflade receptorer, herunder G-protein-koblede receptorer (GPCR) 6. . RWG biosensorer detektere den relative change i brydningsindeks som funktion af den relative ændring i massen indenfor 150 nm af biosensor 7.. Når celler udplades til biosensoren, denne ændring i brydningsindeks afspejler ændringen i massen i nærheden af ​​plasmamembranen af ​​cellen som følge af en ændring i cellulær vedhæftning til biosensoren. Denne protokol vil diskutere detektering af kanal-protein interaktioner bruger RWG biosensorer.

RWG datafangst systemer består af flere komponenter. Fordi X-BODY Biosciences BIND Scanner blev anvendt til disse eksperimenter, skal vi henvise til de komponenter til netop dette system, som består af en plade-læser, der er forbundet biosensorer, BIND Scan erhvervelse software og BIND Se analyse software 8. De fotoniske krystal biosensorer, herefter benævnt optiske biosensorer, er sammensat af en periodisk arrangement af en dielektrisk og materiale i 2 eller 3 dimensioner, som forhindrer udbredelsen af ​​lys på specifikkebølgelængder og retninger. Fotoniske krystalstrukturer er baseret på et fænomen kaldet Wood anomali. Først opdaget af Wood i 1902, er disse anomalier er observerede virkninger i spektret af lyset reflekteres af optiske diffraktionsgitre hvor hurtige variationer i intensiteten af ​​bestemte diffraktion ordrer forekomme i visse smalle frekvensbånd. I 1962 Hessel og Oliner præsenteret en ny teori om Woods anomalier, hvor begrænset periode rist genererer en stående resonans bølgelængde 9. I de optiske biosensorer er beskrevet her, er Woods uregelmæssigheder anvendes til at fremstille en RWG biosensor, når de stimuleres med hvidt lys reflekterer kun meget smalt bånd af bølgelængder (typisk mellem 850-855 nm).

Individuelle biosensorer består af et lavt brydningsindeks plastmateriale med en periodisk overfladestruktur, som er belagt med et tyndt lag af den høje refraktionsindeks dielektrisk materiale titandioxid (TiO 2). Når Biosenseller er belyst med en bred bølgelængde lyskilde, optisk gitter af fotoniske krystaller afspejler en smal vifte af bølgelængder af lys, der er målt ved et spektrofotometer i BIND Scanner. Den maksimale intensitet af de reflekterede bølgelængder (Spidsbølgelængde værdi eller PWV) beregnes derefter fra signalet. Den PWV af lette skift på en ændring i brydningsindeks som følge af en stigning eller et fald i massen i nærhed (~ 150 nm) af biosensoroverfladen. Optiske biosensorer er inkorporeret i en standard Society for Biomolecular Sciences (SBS) 384-brønds mikroplade assayene, der anvendes i disse eksperimenter.

RWV biosensorer anvendes til at opdage ændringer efter tilsætning af udefrakommende signaler i levende celler 10. Celler dyrkes direkte på overfladen af ​​en RWG biosensor og ændringen i den lokale brydningsindeks overvåges ved behandling med specifikke stimuli. Retningen af ​​ændring i masse på biosensor kan værebestemmes, da en stigning i den lokale brydningsindeks resultater fra en masseforøgelse nær biosensoren og måles som en stigning i PWV. Omvendt et fald i masse giver et fald i PWV. Ændringen i opdaget PWV kan skyldes en lang række cellulære begivenheder, herunder ændringer i celle adhæsion, protein rekruttering / release, endocytose og genbrug, exocytose, apoptose og cytoskeletal omlejring. For eksempel kan assayet detektere ændringer i kanal-protein-interaktioner mellem kaliumkanaler og andre cytoplasmatiske eller cytoskeletale komponenter. Arrangementet, imidlertid skal være inden for ~ 150 nm påvisning zone nær biosensoren, og i tilfælde af en tilknyttet celle nær plasmamembranen. Erhvervelse af cellulære reaktioner udføres med BIND Scan software og et billede repræsentation af hver af de 384 brønde i SBS plade er genereret. Dette system har en opløsning på op til 3,75 mM / pixel, så detektion af hændelser i enkelte celler, ogkan bruges enten med cellelinier (såsom HEK293 eller CHO-celler) eller med flere fysiologisk relevant primære celler. Billedanalyse med BIND View software giver påvisning af cellulære reaktioner i både individuelle og populationer af celler. Som biosensorer er indarbejdet i standard SBS 384-brønds mikroplader, er systemet let tilpasses til high-throughput screening (HTS).

Resonans-bølgelængde rist optiske biosensorer er tidligere blevet brugt til at detektere ændringer i massen nær plasmamembranen af celler efter aktivering af GPCRs 11.. Vores laboratorium har klonet to natrium-aktiverede (K Na) kalium kanaler, Slack-B og Slick 12. Aktiviteten af begge Slack-B og Slick kanaler har vist sig at være meget stærkt påvirket af direkte aktivering af proteinkinase C (PKC) 13.. Aktivering af Ga q proteinkoblede receptorer, såsom M1 muskarinreceptor og mGluR1 metabotrope glutamat receptor, potent regulerer kanal aktivitet gennem PKC-aktivering. Disse K Na-kanaler bidrager til neuronal tilpasning under vedvarende stimulering og regulere nøjagtigheden af timingen af virkningspotentialer 14. Slack kanaler er kendt for at interagere med en række af cytoplasmatiske signalmolekyler, herunder FMRP, Fragile X mental retardering protein 15,16. Mutationer i Slack resultat i flere Migrering partielle anfald hos spædbørn (MMPSI), en tidlig debut form for epilepsi, som resulterer i alvorlige udviklingsmæssige forsinkelse 17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Cell Culture (Tilpasset fra Fleming og Kaczmarek 18)

  1. Kultur celler i passende medier til større end 2, men mindre end 10 passager før anvendelse i dette assay. Transficerede HEK-293-celler og HEK-293-celler, der stabilt udtrykker rotte Slack-B-protein dyrkes i den ene halvdel Dulbeccos modificerede Eagle-medium og en halv Leibovitz L-15 medium suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum og antibiotika. 500 mg / ml Geneticin (G418) tilsættes HEK-293-celler, der stabilt udtrykker Slack-B for at vælge for ekspression af Slack kanal. Passage celler ved 70-90% sammenløb af afstandtagen fra retter med en 0,25% trypsin-EDTA-opløsning.

2. Ekstracellulære matrix (ECM) Lakering af TiO 2 384-godt Optisk biosensor Plade med Fibronektin og Ovalbumin

  1. Fremstilling af fibronectin ECM blandingen og ovalbumin blokerende opløsning
    1. Forbered en arbejdsgruppe løsning fibronecti i phosphatbufret saltvand (PBS) med en endelig koncentration på 5 ug / ml fibronectin i 20,0 ml PBS. Fra en 1,0 mg / ml koncentration af stamopløsning, tilsættes 100 ul 20,0 ml PBS i en 200-ganges fortynding. Arbejdsopløsningen af ​​fibronectin kan alikvoteres og opbevares ved -20 ° C efter tilberedning.
    2. Forbered en 5% stamopløsning af varmeinaktiverede ægalbumin i sterilt vand. Fortyndet ovalbumin i steril vævskulturkvalitet vand til en 5% opløsning og varme-inaktivering i 30 minutter ved 60 ° C. Opløsningen afkøles til stuetemperatur og sterilt filter opløsningen. Afmål 5% ovalbumin-opløsning og opbevares ved 4 ° C.
    3. Forbered en brugsopløsning 2% af ægalbumin ved at fortynde 5% stamopløsning i PBS. For eksempel tilsættes 12,0 ml 5% ovalbumin stamopløsning til 18,0 ml PBS til et endeligt volumen på 30,0 ml.
  2. 384 brønde optisk biosensor plade belægning
    1. Hydrat TiO 2 plade med 20,0 ul / brøndsterilt vævskulturkvalitet vand i 15 min. De følgende trin skal udføres med en 16-kanals pipette.
    2. Vask plade 1x med 50,0 pi PBS per brønd.
    3. Tilføj 20.0 ul af fibronectin arbejdsopløsning til hver brønd og inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur for at skabe ECM.
    4. Vask plade 1x med 50,0 pi PBS pr godt.
    5. Tilføj 40.0 pi ovalbumin arbejdsopløsning til hver brønd og inkuberes natten over ved 4 ° C for at blokere pladen.
    6. Vask plade 3x med 50,0 pi PBS per brønd. ECM overtrukne plader kan opbevares ved 4 ° C i op til 48 timer.

3. Såning Celler på 384-godt Optisk biosensor Plate

  1. Fjern vækstmedium fra cellerne og tilføje trypsin for at fjerne cellerne fra pladen. Opsamle cellerne og centrifugeres ved 1.000 x g i 1 min. Fjern trypsin medier og resuspender cellerne i vækstmedier.
  2. Ved hjælp af et hæmocytometer eller en automatiseretcelletæller, bestemme koncentrationen af ​​cellerne.
  3. For at minimere virkningerne af fordampning under inkubation 50,0 pi vækstmedium per brønd anvendes. Skal fortyndes celler for at opnå det ønskede antal celler per brønd i et volumen på 50,0 pi vækstmedium. Til disse eksperimenter blev 1.000 celler / brønd udpladet på biosensoren.
  4. Lad udsåede celler at inkubere natten over i vækstmedium ved 37 ° C under luft / 5% CO2.

4.. Udarbejdelse af Biosensor og sammensatte plader til RWG Optical biosensor Assay

  1. Tag pladen ud af inkubatoren og fjerne vækstmedier fra cellerne. Vask cellerne 1x med Hanks Balanced Salt Solution (HBSS). Tilføj 25.0 ul HBSS til hver brønd.
  2. Placer biosensor plade på BIND Scanner og tillade cellerne at ækvilibrere til stuetemperatur i 1-2 timer.
  3. Forbered en separat sammensatte plade, hvorfra ligander af interesse vil være annonceDED til biosensoren pladen under assayet. For disse assays blev 25,0 pi af en opløsning indeholdende forbindelse tilsættes til hver brønd på biosensoren plade til et samlet volumen på 50,0 pl. Som sådan blev forbindelser i opløsning fremstillet i 2x den ønskede slutkoncentration.

5.. Udfør RWG Optical biosensor Assay

  1. Tag en baseline måling med Scanner for brøndene A1-P12 (halvdelen af ​​SBS 384-brønds plade) med en maksimal opløsning på 3,75 mM / pixel for den centrale 1,5 mm i hver brønd med BIND Scan software. Denne baseline scanning vil tage cirka 30 minutter.
  2. Tilføj 25.0 pi af forbindelsen løsninger til hver brønd for brønde A1-P12.
  3. Tag en baseline måling af brønde A13-P24.
  4. Tilføj 25.0 pi af forbindelsen løsninger til hver brønd til brønde A13-P24.
  5. Tage en post sammensatte tilføjelse måling af brøndene A1-P12, og gentage for boringer A13-P24.

6.. ANALYSE Assay data med BIND View

  1. Åbn BIND assay data til baseline måling i Windows, og klik på "Grid Editor"-knappen for at aktivere valg celle. Softwaren vil beregne målinger af interesse, der er defineret af brugeren.
  2. Åbn "Plug-ins", som omfatter "Cell Finder" og "baseliner"-funktion. Indstil parametre under "Cell Finder", så cellerne kan skelnes fra baggrunden af ​​biosensor.
  3. Eksporter celle kort fil, som indeholder de "Cell Finder" data for baseline måling.
  4. Gentag trin 6.1-6.2 for post-sammensatte tilføjelse data.
  5. Åbn "baseliner" plug-in og importere celle kort fra baseline måling. Softwaren vil beregne skiftet i PWV mellem de data, baggrund og post sammensatte.
  6. Vælg "Δ Cell Mean" til produktion af den gennemsnitlige ændring i PWV for celler. Dataene kan derefter eksporteres til Microsoft Excel til yderligere analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Slack-B stabilt transficerede HEK-293-celler, og styrer utransficerede HEK-293-celler blev podet ved 1.000 celler / brønd på 384 brønde, ECM coated RWG biosensor plader. Billeder fra den centrale 1,5 mm 2 af biosensoren blev registreret ved en opløsning på 3,75 mM / pixel (figur 1). Densitetsgradient kort over massen blev genereret før og 30 minutter efter sammensatte ud med BIND Scan software. BIND View software blev anvendt til at bestemme skiftet i PWV på GPCR-agonist tillæg ved at trække PWV indlæg sammensatte tilføjelse fra baseline PWV.

Den endogene M1 muskarinreceptor-agonist carbamoylcholine chlorid (carbachol) 19 blev anvendt til både utransfekterede kontrol HEK-293-og rotte-slack-B stabilt udtrykker HEK-293-celler resulterede i en positiv stigning i PWV (figur 2A). Målinger blev taget ved 30 min og signaler blev normaliseret til buffer kun (HBSS) additipå. Sammenlignet med de kontrol-celler, havde Slack-B-transfekterede celler en større stigning i peak shift i PWV. SFLLR-NH2 trifluoracetatsalt (SFLLR), en N-terminal TRAP pentapeptid, som udviser agonist-aktivitet mod den endogene GPCR protease aktiveret receptor 1 (PAR1) viste også differentierede reaktioner i ikke-transficerede og Slack-B-transficerede celler (figur 2B). Disse resultater viser tilstedeværelsen af ​​Slack-B-kanal øger skift i PWV, der opstår ved aktivering af endogene GPCRs i HEK-celler, og demonstrere muligheden for at bruge denne analyse til at studere kanal-protein interaktioner.

Figur 1
Figur 1. Analyse af cellulære reaktioner i BIND View. Repræsentative billeder af BINDScanner d ata for Slack-B stabilt transficerede HEK-293-celler A) før og B) efter billedanalyse med BIND View software "Cell Finder" plug-in. Tærskler blev manuelt indstille udnytte "Cell Finder" plug-in til at identificere celler fra baggrunden. B) Områder vist i rødt i repræsentere pixels er identificeret som tilhørende celler og gule linjer skelne celler fra den grå plade baggrund. C) Skiftet i PWV for celler upon SFLLR Desuden vises med en farve gradient, hvor rød er et positivt skift i PWV og blå repræsenterer ingen ændring. Skalaen søjle repræsenterer 100 um. Klik her for at se større billede .

00px "/>
Figur 2. Ekspression af Slack-B ændrer skift i PWV efter aktivering af GPCR'er. A) M1 muskarinreceptor-agonist carbachol (500 uM) producerede et skift i PWV, der er større i amplitude i Slack-B-transficerede celler end kontrol HEK-293-celler ( P <0,0001, N = 16 brønde / tilstand). B) Anvendelse af SFLLR (10 uM), en N-terminal TRAP pentapeptid, der udviser agonistaktivitet mod GPCR endogen protease aktiveret receptor 1 (PAR1) frembragte en forskydning i PWV reaktion , der er større i amplitude i Slack-B-transficerede celler end i kontrol HEK-293-celler (P <0,0001, N = 16 brønde / tilstand). Målinger blev registreret 30 minutter efter sammensatte Desuden og ligand reaktion var normaliseret til buffer kun kontrol. Fejllinjer er ± SEM. Klik her for at se større billede .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Z prime (Z ') faktor er en almindelig statistisk metode til at kvantificere kvaliteten af en high-throughput screening assay 20, og fordi screening af GPCR-agonister i dette assay forekom i en SBS kompatibel 384-brønds assay giver en fremragende måling af robusthed og gyldigheden af dette assay 21. AZ 'værdi på 1 angiver et teoretisk ideelle assay med et uendeligt antal datapunkter med ikke-eksisterende standardafvigelser. AZ "værdi på mellem 0,5-1 betragtes som et fremragende assay for high-throughput screening formål med under 0,5 betragtes som et marginalt informativ analyse. Til dette datasæt, den beregnede Z 'værdi udnytte carbachol en SFLLR som positive kontroller er 0,79 og 0,81 henholdsvis indikerer denne analyse er meget robust og de opnåede resultater er meget vigtige.

Ekstracellulære matrix coating af 384 brønde optisk biosensor plade, cellepodning, og forbindelse tilsætningi disse forsøg blev udført manuelt med en 16-kanals Finnpipette (5-50 pi). Da denne analyse udføres på et SBS plade, kan mere avancerede robot væskehåndteringssystemer anvendes i screening med højt gennemløb. Men når tilpasning af systemer til væskehåndtering instrumentering, bør der udvises omhu for at sikre, at pipettespidser ikke røre biosensoroverfladen da dette vil forårsage skader på biosensor.

Ved tilsætning af forbindelser opløst i DMSO, skal analyse kan udføres således at den endelige koncentration af DMSO i assaymedier holdes konstant for at undgå en forskydning i PWV grund DMSO toksicitet for cellen ("DMSO chok"). Selvom forskellige cellelinjer er forskelligt lydhøre over for DMSO i denne analyse, anbefaler vi, at den endelige koncentration af DMSO ikke overstige 0,1-0,2% vol.. Cellerne inkuberes i den endelige koncentration af DMSO i assaypuffer under temperaturækvilibrering trin i denne protokol for at undgå solvent-inducerede forandringer i PWV.

En bred vifte af celler, herunder primære celler, kan studeres med dette assay, selv om optimering af assayet for hver cellelinje skal udføres. Ved anvendelse af forskellige celletyper bør optimering af antallet af celler og ekstracellulær matrix biosensor overfladebelægninger udføres. Cellerne podes ved forskellige tætheder mellem 1,000-15,000 celler / brønd og behandlet med en kendt receptoragonist at afgøre, hvilken densitet giver den højeste Z '. Forskellige ECM overfladebelægninger, herunder, men ikke begrænset til fibronectin, collagen og laminin, enten alene eller i kombination, bør testes for at sikre, at celler forbliver klæbende til biosensoren under assayet. Cell sult (manglende serum) kan påvirke cellulær reaktion i dette assay, og da sådanne forsøg kan udføres i serum-frit og serum-holdige medier til indledende analyse optimering formål. Den høje opløsning på BIND Scanner etiket friafsløring giver respons målinger skal kvantificeres ved lav cellulære tæthed, da analysen af ​​cellulære reaktioner kan begrænses til kun de pixels kontaktet af celler. Desuden kan subpopulationer af celler i en heterogen blanding gates baseret på flere parametre (herunder størrelse og styrke celleadhæsion) og måles for de enkelte cellulære reaktioner. Tilsammen disse funktioner gør BIND Scanner ideel til analyser, der involverer primære dyrkede celler.

BIND Scanner system tillader målinger, der skal tages i løbet af en bestemt tid-kursus, og derfor kan registreres time-lapse målinger af ændringer i PWV. Dette er især nyttigt til måling af ændringer i celle adfærd, der opstår over længere perioder end dem, på grund af kanal-protein-interaktioner, herunder celleproliferation, celledeling og cellevandring. BIND View software giver mulighed for analyse af sådanne cellulære reaktioner, og kan kvantificere talrige Parameters af ændringer i celle struktur, herunder ændringer i celleadhærence, ændringer i celle volumen og ændringer i celle bevægelse, der gør det muligt både kvantitativ analyse og time-lapse billeddannelse af disse begivenheder. For eksempel kan dette system anvendes til at bestemme den hastighed, som fibroblaster svare vækstfaktor signalering ved at spore cellernes migration over en individuel brønd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Steven M. Shamah er ansat i X-Body Biosciences.

Acknowledgments

Forfatterne er taknemmelige til Dr. Yangyang Yan i laboratoriet af Dr. Fred Sigworth på Yale University for den generøse donation af HEK293 celler stabilt udtrykker rotte Slack-B protein. Derudover forfatterne er taknemmelige til Dr. Sigworth for cryo-elektronmikroskopi homologi model af Slack vises video introduktionen. Denne forskning blev støttet af NIH Tilskud DH067517 og NS073943 til LKK

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM, High Glucose Life Technologies 11965-092
Leibovitz's L-15 Medium Life Technologies 11415-064
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life Technologies 15140-122
Geneticin G-418 Sulfate American Bioanalytical AB05057
HBSS Life Technologies 14025-092
Fibronectin from human plasma Sigma-Aldrich F0895
Albumin from chicken egg white Sigma-Aldrich A5378
DPBS Life Technologies 14190-144
Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer Fisher Scientific 02-671-6
Carbamoylcholine chloride Sigma-Aldrich C4382
SFLLR-NH2 trifluoroacetate salt Sigma-Aldrich S8701
Finnpipette (5-50 µl) Thermo Scientific 4662090
BIND Scanner System X-BODY Biosciences N/A
384-well TiO2 coated plates X-BODY Biosciences TiO-96-CM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hille, B. Ion Channels of Excitable Membranes. , Sinauer Associates. (1992).
  2. Kaczmarek, L. K. Non-conducting functions of voltage-gated ion channels. Nat. Rev. Neurosci. 7, 761-771 (2006).
  3. Levitan, I. B. Signaling protein complexes associated with neuronal ion channels. Nat. Neurosci. 9, 305-310 (2006).
  4. Shamah, S. M., Cunningham, B. T. Label-free cell-based assays using photonic crystal optical biosensors. Analyst. 136, 1090-1102 (2011).
  5. Cunningham, B. T., Laing, L. M. icroplate-based label-free detection of biomolecular interactions: applications in proteomics. Expert Rev. Proteomics. 3, 271-281 (2006).
  6. Peters, M. F., Vaillancourt, F., Heroux, M., Valiquette, M., Scott, C. W. Comparing label-free biosensors for pharmacological screening with cell-based functional assays. Assay Drug Dev. 8, 219-227 (2010).
  7. Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing. Biophys. J. 91, 1925-1940 (2006).
  8. Cunningham, B. T., et al. Label-free assays on the BIND system. J. Biomol. Screen. 9, 481-490 (2004).
  9. Hessel, A. aO., A, A. A New Theory of Wood's Anomalies on Optical Gratings. Appl. Optics. 4, 1275-1297 (1965).
  10. Cunningham, B. T., Laing, L. G. Advantages and application of label-free detection assays in drug screening. Expert Opin. Drug Discov. 3, 891-901 (2008).
  11. Lee, P. H. Label-free optical biosensor: a tool for G protein-coupled receptors pharmacology profiling and inverse agonists identification. J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 146-153 (2009).
  12. Bhattacharjee, A., Kaczmarek, L. K. For K+ channels, Na+ is the new Ca2. Trends Neurosci. 28, 422-428 (2005).
  13. Santi, C. M., et al. Opposite regulation of Slick and Slack K+ channels by neuromodulators. J. Neurosci. 26, 5059-5068 (2006).
  14. Yang, B., Desai, R., Kaczmarek, L. K. Slack and Slick K(Na) channels regulate the accuracy of timing of auditory neurons. J. Neurosci. 27, 2617-2627 (2007).
  15. Brown, M. R., et al. Fragile X mental retardation protein controls gating of the sodium-activated potassium channel. 13, 819-821 (2010).
  16. Zhang, Y., et al. Regulation of neuronal excitability by interaction of fragile X mental retardation protein with slack potassium channels. J. Neurosci. 32, 15318-15327 (2012).
  17. Barcia, G., et al. De novo gain-of-function KCNT1 channel mutations cause malignant migrating partial seizures of infancy. Nat. Genet. 44, 1255-1259 (2012).
  18. Fleming, M. R., Kaczmarek, L. K. Use of optical biosensors to detect modulation of Slack potassium channels by G protein-coupled receptors. J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 173-181 (2009).
  19. Nelson, C. D., et al. Targeting of diacylglycerol degradation to M1 muscarinic receptors by beta-arrestins. Science. 315, 663-666 (2007).
  20. Zhang, J. H. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
  21. Gribbon, P., et al. Evaluating real-life high-throughput screening data. J. Biomol. Screen. 10, 99-107 (2005).

Tags

Bioteknik Ionkanaler kalium kanal slap G-protein-koblede receptorer (GPCR) etiket-fri screening high-throughput screening (HTS) kanal-protein interaktioner optiske biosensorer
Brug af Label-fri Optiske Biosensors Detect Modulation af kalium kanaler af G-protein koblede receptorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fleming, M. R., Shamah, S. M.,… More

Fleming, M. R., Shamah, S. M., Kaczmarek, L. K. Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors. J. Vis. Exp. (84), e51307, doi:10.3791/51307 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter