Summary
Методы оптический биосенсор может обнаружить изменения в массы вблизи плазматической мембраны в живых клетках и позволяют следовать клеточные ответы в обоих отдельных клеток и популяций клеток. Этот протокол будет описывать обнаружение модуляции калиевых каналов по G-белком рецепторов в неповрежденных клеток, использующих этот подход.
Abstract
Ионные каналы управления электрических свойств нейронов и других типов клеток возбудимых путем выборочного позволяя ионам проходить через плазматическую мембрану 1. Для регулирования возбудимость нейронов, биофизические свойства ионных каналов модифицируются сигнальных белков и молекул, которые часто связываются с самих каналов, чтобы сформировать гетеромерный канал сложную 2,3. Традиционные анализы рассматривая взаимодействие между каналами и регуляторных белков требуют экзогенных метки, которые потенциально могут изменить поведение протеина и уменьшить физиологическое значение цели, обеспечивая при этом мало информации о времени ходе взаимодействий в живых клетках. Оптические биосенсоры, такие как системы X-BODY Biosciences BIND сканера, использовать новый без наклеек технологии, резонансную длину волны решетку (RWG) оптические биосенсоры, чтобы обнаружить изменения в резонансной отраженный свет рядом с биосенсора. Этот анализ позволяет обнаруживать относительноеизменение массы в нижней части живой клетки прилипших к поверхности биосенсора результате лиганд индуцированных изменений в клеточной адгезии и распространения, токсичность, пролиферации и изменений в белок-белковых взаимодействий вблизи плазматической мембраны. РРГ оптические биосенсоры были использованы для обнаружения изменений в массе вблизи плазматической мембране клеток после активации G-белком рецепторов (GPCR), рецепторных тирозинкиназ и других рецепторов клеточной поверхности. Индуцированной лигандом изменения в ионном канале-белковых взаимодействий также могут быть изучены при применении этого теста. В этой статье мы опишем экспериментальное процедуру, используемую для обнаружения модуляции тормозной-B натрия активированного калия (K Na) каналов по GPCRs.
Introduction
Изучение живых клеток в их физиологически соответствующем контексте является ключевым для понимания биологические функции клеточных мишеней. Тем не менее, анализы рассматривая взаимодействие между каналами и нормативных цитоплазматических белков, таких как коиммунопреципитации подтверждено анализами, как правило, предоставляют мало информации о времени ходе взаимодействий в живых клетках. Большинство текущих анализов на основе клеток измеряют специфический клеточный событие, например транслокации флуоресцентно меченого белка. Эти анализы требуют модификации белков, представляющих интерес, которые потенциально могут изменить поведение протеина и уменьшить физиологическое значение цели. Неинвазивная клеток, основанные анализы, которые не требуют манипуляции с системой, обеспечивают непрерывное измерение клеточной активности и позволяют исследования клеток в их наиболее физиологически отношение государства 4.
Оптические биосенсоры предназначены для производстваизмеримое изменение в характеристике света, который соединен с поверхности датчика. Оптические биосенсоры, которые используют неоднородных волн, в том числе поверхностного плазмонного резонанса (SPR) и резонансную длину волны решетку методы (РРГ), были в основном используется для обнаружения сходства и кинетики молекул, связывающихся с их биологических рецепторов, иммобилизованных на поверхности сенсора. Совсем недавно, коммерчески доступные РРГ биосенсоры были разработаны, чтобы позволить обнаруживать относительное изменение массы в нижней части клеток прикрепленных к поверхности сенсора с высоким пространственным разрешением (до 3,75 мкм / пиксель) 5. Эти биосенсоры может обнаружить изменения в массе около плазматической мембраны живых клеток, которые являются результатом стимуляции, таких как клеточной адгезии и распространения, токсичность, пролиферации и сигнальных путей, вызываемых различными рецепторами клеточной поверхности, включая G-белком рецепторов (GPCR) 6 . РРГ биосенсоры обнаружить относительную чанGE в показателя преломления в зависимости от относительного изменения массы в пределах 150 нм биосенсора 7. Когда клетки высевают в биосенсора, это изменение в показателе преломления отражает изменение массы около плазматической мембраны клетки в результате изменений в клеточной присоединения к биосенсора. Этот протокол будет обсудить обнаружение канала-белковых взаимодействий с помощью РРГ биосенсоров.
Системы сбора данных РРГ состоят из нескольких компонентов. Поскольку X-BODY Biosciences BIND Сканер был использован для этих экспериментов, мы будем называть компонентами для этой конкретной системы, которая состоит из ридере, связанных биосенсоров, приобретения программного обеспечения BIND Scan и BIND Посмотреть анализа программного обеспечения 8. Фотонный кристалл биосенсоры, далее будет называться оптические биосенсоры, состоят из периодического расположения диэлектрика и материала в 2 или 3-х измерениях, что предотвращает распространение света в конкретныхдлины волн и направления. Фотонные кристаллические структуры основаны на явление, называемое аномалия Вуда. Впервые обнаружил Вудом в 1902 году, эти аномалии эффекты, наблюдаемые в спектре света, отраженного от оптических дифракционных решеток, где быстрые изменения в интенсивности отдельных порядков дифракции происходят в определенных узких частотных полос. В 1962 году Хессел и Олинера представил новую теорию аномалий Вуда, в котором конечный период решетки генерирует постоянный резонансной длины волны 9. В оптических биосенсоров, описанных здесь, Аномалии Вуда используются для производства биосенсор RWG, что при стимуляции с белым светом отражает лишь очень узкую полосу длин волн (как правило, между 850-855 нм).
Отдельные биосенсоры состоят из низко-преломления пластического материала с периодической структурой поверхности, покрытой тонким слоем с высоким содержанием двуокиси преломления диэлектрического материала титана (TiO 2). Когда Biosensили освещается с широким длин волн источника света, оптическая решетка фотонных кристаллов отражает узкий диапазон длин волн света, который измеряется с помощью спектрофотометра в BIND сканера. Пик интенсивности отраженных волн (Пиковая длина волны значение или PWV) рассчитывается из сигнала. PWV света изменяется при изменении показателя преломления в результате к увеличению или уменьшению массы в пределах близости (~ 150 нм) поверхности биосенсора. Оптические биосенсоры включены в стандартный общества по Биомолекулярных наук (SBS) 384-луночный микропланшет для анализов, используемых в этих экспериментах.
RWV биосенсоры используются для обнаружения изменений при добавлении экзогенных сигналов в живых клетках 10. Клетки культивировали непосредственно на поверхности биосенсора RWG и изменение в локальной показателя преломления контролируется при обработке конкретных стимулов. Направление изменения массы в биосенсора может бытьопределяют, потому что увеличение локального индекса рефракции результатов с увеличением массы вблизи биосенсора и измеряется как увеличение СПВ. Наоборот, уменьшение массы приводит к снижению СПВ. Изменение обнаруженного СПВ может быть результатом многочисленных клеточных событий, в том числе изменения в клеточной адгезии, белка набора / освобождения, эндоцитоза и утилизации, экзоцитоза, апоптоза и цитоскелетного перегруппировки. Например, анализ может быть обнаружения изменений в канал-белковых взаимодействий между калиевых каналов и других цитоплазматических или цитоскелета компонентов. Событие, однако, должен происходить в пределах зоны обнаружения ~ 150 нм вблизи биосенсора, а в случае прикрепленным клетки, вблизи плазматической мембране. Приобретение клеточных ответов выполняется с помощью программного обеспечения BIND сканирования и представление изображения каждого из 384 скважин в SBS пластины генерируется. Эта система имеет разрешение до 3,75 мкм / пиксель, что позволяет обнаруживать события в одиночных камерах, имогут быть использованы либо с клеточных линий (например, НЕК293 клетках СНО или) или с более физиологически соответствующих первичных клеток. Анализ изображений с BIND View программного обеспечения позволяет обнаружить клеточные реакции как в личности и популяций клеток. Как биосенсоры были включены в стандартный SBS 384-луночных микропланшет, система легко адаптируется к высокопроизводительного скрининга (HTS).
Резонанс-волны решетки оптические биосенсоры ранее использовались для обнаружения изменений в массе около плазматической мембране клеток после активации GPCRs 11. Наша лаборатория клонировал двух калиевые каналы натрия активированного (К Na) отними-B и Slick 12. Активность обоих слабину-B и гладкий каналов было показано, что очень сильно зависит от прямой активации протеинкиназы С (РКС) 13. Активация Gα д белком рецепторов, таких как М1 мускаринового рецептора и mGluR1 метаботропного глутаматного Receptor, мощно регулирует деятельность канала через активацию ПКС. Эти каналы K Na способствовать нейронов адаптации во время длительного стимуляции и регулируют точность сроков действия потенциалов 14. Натяжные каналы, как известно, взаимодействовать с различными цитоплазматических сигнальных молекул, в том числе FMRP, хрупкой Х умственной отсталости белка 15,16. Мутации в Слэк результате в нескольких Перенастройка частичного изъятия младенчества (MMPSI), раннего натиска формы эпилепсии в результате чего задержка развития 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Культура клеток (адаптировано из Флеминг и Качмарек 18)
- Культура клеток в соответствующих средствах массовой информации для более чем 2, но менее 10 проходов перед использованием в данном анализе. Нетрансфицированных клетках НЕК-293 и клетках НЕК-293, стабильно экспрессирующие белок крыс Slack-B выращивают в модифицированной Дульбекко среде половина Дульбекко и одной половины Лейбовица L-15 среде, дополненной 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки и антибиотики. 500 мкг / мл генетицина (G418) добавляют в клетках НЕК-293, стабильно экспрессирующих Slack-B, чтобы выбрать для экспрессии Slack канала. Прохождение клеток на 70-90% слияния диссоциацией от блюд с 0,25% раствором трипсин-ЭДТА.
2. Внеклеточного матрикса (ECM) Покрытие из TiO 2 384-а оптический биосенсор Тарелка с фибронектина и овальбумином
- Подготовка фибронектин ECM смеси и блокирующего раствора овальбумина
- Подготовьте рабочего раствора fibronectв в фосфатном буферном растворе (PBS) с конечной концентрацией 5 мкг / мл фибронектина в 20,0 мл PBS. Из 1,0 мг / мл маточного концентрацией, добавьте 100 мкл в 20,0 мл PBS в течение 200-кратного разведения. Рабочий раствор фибронектина можно аликвоты и хранили при -20 ° С после приготовления.
- Подготовьте 5% исходного раствора термоинактивированной овальбумином в стерильной воде. Развести овальбумина в стерильной культуре ткани марки воды для раствора 5%-и тепла инактивации в течение 30 мин при 60 ° С Раствор охлаждают до комнатной температуры и стерильный фильтр раствора. Алиготе 5%-ный раствор овальбумина и хранить при 4 ° С.
- Подготовьте 2% рабочий раствор яичного белка путем разбавления 5% исходного раствора в PBS. Например, можно добавить 12,0 мл 5% раствора овальбумина в 18,0 мл PBS для конечного объема 30,0 мл.
- 384-а оптический биосенсор пластины покрытие
- Увлажнения TiO 2 пластины с 20,0 мкл / лункуиз тканевой культуры стерильным класс воды в течение 15 мин. Следующие шаги должны быть выполнены с пипетки 16-канала.
- Вымойте пластины 1x 50,0 мкл PBS на лунку.
- Добавить 20,0 мкл рабочего раствора фибронектина в каждую лунку и инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре, чтобы создать ECM.
- Вымойте пластины 1x 50,0 мкл PBS на лунку.
- Добавить 40,0 мкл рабочего раствора овальбумина в каждую лунку и инкубируют в течение ночи при 4 ° С, чтобы блокировать пластины.
- Промыть 3 раза пластины с 50,0 мкл PBS на лунку. ECM покрытием пластины можно хранить при температуре 4 ° С в течение до 48 часов.
3. Посев клеток на 384-а биосенсоров плиты оптического
- Удаление питательной среды из клеток и добавить трипсин, чтобы сместить клетки от пластины. Сбора клеток и центрифугируют при 1000 х г в течение 1 мин. Удалите трипсина СМИ и Ресуспендируют клеток в питательной среде.
- Использование гемоцитометра или автоматизированнаясчетчик клеток, определить концентрацию клеток.
- Чтобы свести к минимуму эффектов испарения во время инкубации, будут использованы 50,0 мкл питательной среды на лунку. Клетки должны быть разбавлены, чтобы достичь желаемого количества клеток на лунку в объеме 50,0 мкл ростовой среды. Для этих экспериментов 1000 клеток / лунку высевали на биосенсора.
- Разрешить отобранные клетки инкубировать в течение ночи в среде роста при 37 ° С в атмосфере воздуха / 5% CO 2.
4. Подготовка биосенсора и соединение пластин для анализа RWG оптический биосенсор
- Снять пластину из инкубатора и удалить питательной среды из клеток. Вымойте клетки 1x с Хэнкс сбалансированный солевой раствор (HBSS). Добавить 25,0 мкл HBSS в каждую лунку.
- Поместите биосенсора пластину на BIND сканера и позволяют клеткам, чтобы уравновесить до комнатной температуры в течение 1-2 часов.
- Подготовьте отдельный соединение пластины, из которых лиганды интерес будет объявлениеDED в биосенсора пластины во время анализа. Для этих анализов, 25,0 мкл раствора, содержащего соединения добавляли в каждую лунку на пластине для биосенсора общим объемом 50,0 мкл. Таким образом, соединения в растворе были подготовлены в 2 раза желаемой конечной концентрации.
5. Выполнять исследования RWG оптический биосенсор
- Выполните измерение базовой с системой Scanner для скважин A1-P12 (половина 384-луночный планшет SBS), используя максимальное разрешение 3,75 мкм / пиксель для центрального 1,5 мм каждой лунки с помощью программного обеспечения BIND сканирования. Это базовое сканирование займет приблизительно 30 мин.
- Добавить 25,0 мкл растворах соединений в каждую лунку для скважин A1-P12.
- Возьмите базовое измерение скважин A13-P24.
- Добавить 25,0 мкл растворах соединений в каждую лунку для скважин A13-P24.
- Возьмите сообщение соединение сложения измерение для скважин A1-P12, и повторить для скважин A13-P24.
6.нализ из пробирной данных с BIND View
- Откройте данные BIND тест для базового измерения в Windows, и нажмите кнопку "Сетка Editor", чтобы позволить выбор соты. Программное обеспечение будет рассчитать показатели, представляющие интерес, определенные пользователем.
- Откройте "Плагины", которые включают в "Cell Finder" и функцию "Baseliner". Установка параметров в "Cell" Finder так что клетки отличаются от фоне биосенсора.
- Экспорт клеток карту файл, который содержит данные "Сотовый Finder" для измерения базовой.
- Повторите шаги 6.1-6.2 для почтовых данных соединение сложения.
- Откройте "Baseliner" плагин и импортировать клеток карту из измерения базовой. Программное обеспечение будет вычислить сдвиг в СПВ между фоном и после сложных данных.
- Выбрать "Δ Cell означать" для вывода средней сдвига в PWV для клеток. Затем данные могут быть экспортированы в Microsoft Ехсэль для дальнейшего анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Slack-B стабильно трансфицированные НЕК-293 клеток и контролируют нетрансфицированные HEK-293 клетки высевали на 1000 клеток / лунку на 384-луночный, ECM покрытием РРГ биосенсора пластин. Изображения из центральной 1,5 мм 2 биосенсора были записаны с разрешением 3,75 мкм / пиксель (рис. 1). Градиента плотности карты массы были получены до и 30 мин после соединение дополнение вместе с программным обеспечением BIND Scan. BIND Посмотреть программного обеспечения был использован для определения сдвига в СПВ на агониста GPCR того вычитанием СПВ сообщению соединение добавление от базового СПВ.
Эндогенный M1 мускариновых агонистов рецептора carbamoylcholine хлорид (карбахол) 19 был применен как к нетрансфицированные управления НЕК-293 и крысы Slack-B, стабильно экспрессирующих клетках НЕК-293 привели к положительным ростом PWV (рис. 2а). Измерения проводились при температуре 30 мин и сигналы были нормализованы в буфер только (HBSS) дополнительна. По сравнению с контрольными клетками, слабину-B трансфицированные клетки имели большее увеличение пиковой сдвига в PWV. SFLLR-NH 2, трифторуксусная соль (SFLLR), N-концевого TRAP пентапептид, который проявляет агонистическую активность по отношению к эндогенной протеазы GPCR активированный рецептор 1 (PAR1), также показали, дифференциальные реакции в нетрансфицированных и Slack-B трансфицированных клеток (фиг. 2b). Эти результаты показывают, наличие канала Slack-B значительно увеличивает сдвиг в СПВ, который происходит при активации эндогенного GPCR, в НЕК клеток, а также продемонстрировать возможность использования этого анализа для изучения канал-белковых взаимодействий.
Рисунок 1. Анализ клеточных реакций в BIND View. Представитель изображения BINDScanner г ата для отвисшей B стабильно трансфицированных клетках НЕК-293) до и Б) после анализа изображений с BIND View программного обеспечения "Сотовый Finder" плагина. Пороги были вручную установить используя "Сотовый Finder" плагин для выявления клеток от фона. B) Области, показанные в красном в представляют пикселей идентифицированы как принадлежащие к клеткам и желтых линий различать клетки от сером фоне пластины. C) сдвига в СПВ для клеток при SFLLR того будет заметно по цветового градиента, где красный представляет собой позитивный сдвиг в СПВ и синего не представляет никаких изменений. Масштабная линейка представляет 100 мкм. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
00px "/>
Рисунок 2. Выражение Slack-B изменяет сдвиг в PWV следующей активации GPCRs. А) М1 мускаринового агониста карбахола (500 мкМ), полученных сдвиг в СПВ, которое больше по амплитуде в Slack-B трансфицированных клеток, чем контрольных клетках НЕК-293 ( Р <0,0001, N = 16 скважин / состояние). B) Применение SFLLR (10 мкМ), с N-концевой TRAP пентапептида, который проявляет агонистическую активность по отношению к эндогенной протеазы GPCR активированного рецептора 1 (PAR1), получают сдвиг в ответ PWV что больше по амплитуде в слабину-B-трансфецированных клеток, чем в контроле НЕК-293 клеток (P <0,0001, N = 16 скважин / состояние). Измерения были записаны 30 мин после соединения дополнение, и ответ лиганд нормализовалась в буфер только контроль. Планки погрешностей равны ± SEM. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Z премьер (Z ') фактором является общей статистический метод для количественного определения качества высокой пропускной скрининге 20, и потому, что скрининг агонистов GPCR в этом анализе произошло в SBS совместимый анализе 384-а, обеспечивает превосходное мера надежности и обоснованности данного анализа 21. Значение Az '1 указывает на теоретически идеальную анализа с бесконечным числом точек данных с несуществующим стандартных отклонений. Значение AZ 'составляет от 0,5-1 считается отличным тест для целей высокопроизводительного скрининга, с ниже 0,5 считается незначительно информативным анализ. Для этого набора данных, значение вычисляется Z 'с использованием карбахол SFLLR как положительных контролей составляет 0,79 и 0,81 соответственно, что указывает Этот анализ очень прочный и полученные результаты имеют существенное значение.
Внеклеточной матрицы покрытие 384-а оптический биосенсор пластины, посева клеток, и соединения тогоВ этих экспериментах была выполнена вручную с помощью 16-канального Finnpipette (5-50 мкл). В этот анализ выполняется на пластине SBS, более передовые роботизированные системы обработки жидкости может быть использован в высокопроизводительного скрининга. Тем не менее, при адаптации системы для наливных приборов, следует проявлять осторожность, чтобы гарантировать, что наконечники не прикасайтесь к поверхности биосенсора, как это может привести к повреждению биосенсора.
При добавлении соединений, растворенных в диметилсульфоксиде, анализ должен быть выполнен таким образом, что конечная концентрация ДМСО в среде для анализа поддерживается постоянным, чтобы избежать сдвига в PWV из-за токсичности ДМСО в ячейки ("ДМСО ударную"). Хотя различные клеточные линии реагируют на дифференциально ДМСО в этом анализе, мы рекомендуем, чтобы конечная концентрация ДМСО не должна превышать 0,1-0,2% по объему. Клетки должны быть инкубировали в конечной концентрации ДМСО в буфере для анализа при температуре уравновешивания этого протокола во избежание solvenт-индуцированной сдвиги в СПВ.
Разнообразные клеток, в том числе первичных элементов, могут быть изучены с данного анализа, хотя оптимизация анализа для каждой клеточной линии должны быть выполнены. При использовании различных типов клеток, оптимизация количества клеток и внеклеточного матрикса биосенсора поверхностных покрытий должна быть выполнена. Клетки должны быть высевали при различных плотностях между 1,000-15,000 клеток / лунку и обрабатывают известного агониста рецептора чтобы определить, какие плотность производит высокий Z '. Различные покрытия ECM поверхности, включая, но не ограничиваясь фибронектин, коллаген, ламинин и, по отдельности или в комбинации, должны быть проверены для того, чтобы оставаться клетки прилегает к биосенсора при анализе. Сотовый голодание (отсутствие сыворотки) может влиять на клеточный ответ в этом анализе, и как такие эксперименты могут быть выполнены в бессывороточной и содержащей сыворотку средах для целей оптимизации начальных анализ. Высокое разрешение этикетке BIND сканера свободнойобнаружение позволяет проводить измерения отклика на быть количественно при низкой клеточной плотности, так как анализ клеточных ответов может быть ограничен только теми пикселей контактируют с клетками. Кроме того, субпопуляции клеток в гетерогенной смеси может быть закрытый на основе нескольких параметров (включая размер и прочность адгезии клеток) и измеряли для отдельных клеточных реакций. Взятые вместе, эти возможности делают BIND сканер идеально подходит для анализов, включавших первичные культивируемые клетки.
Система сканер BIND позволяет выполнять измерения в течение определенного времени, конечно, и поэтому измерения покадровой изменений в СПВ могут быть записаны. Это особенно полезно для измерения изменений в поведении клетки, которые происходят в течение более длительных периодов времени, чем те, из-за канал-белковых взаимодействий, включая пролиферацию клеток, деление клеток и миграции клеток. BIND Посмотреть программное обеспечение позволяет для анализа таких клеточных реакций, и могут количественно многочисленные Parameteрс от изменений в структуре клеток, в том числе изменения в клеточной приверженности, изменения объема клеток и изменения в движении клеток, позволяющих как количественный анализ и покадровой визуализации этих событий. Например, эта система может быть использована, чтобы определить скорость которые фибробласты реагировать на фактора роста сигнализации путем отслеживания скорость миграции клеток через отдельной скважины.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Стивен М. Shamah является сотрудником X-BODY Biosciences.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность доктору Янъян Янь в лаборатории доктора Фреда Сигуорта в Йельском университете за щедрое пожертвование НЕК293, стабильно экспрессирующих белок крысы Слэк-B. Кроме того, авторы благодарны доктору Сигуорта для крио-электронной микроскопии гомологии модели Слэк отображается в видео внедрения. Это исследование было поддержано NIH грантов DH067517 и NS073943 к LKK
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, High Glucose | Life Technologies | 11965-092 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Geneticin G-418 Sulfate | American Bioanalytical | AB05057 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-092 | |
| Fibronectin from human plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Albumin from chicken egg white | Sigma-Aldrich | A5378 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-6 | |
| Carbamoylcholine chloride | Sigma-Aldrich | C4382 | |
| SFLLR-NH2 trifluoroacetate salt | Sigma-Aldrich | S8701 | |
| Finnpipette (5-50 µl) | Thermo Scientific | 4662090 | |
| BIND Scanner System | X-BODY Biosciences | N/A | |
| 384-well TiO2 coated plates | X-BODY Biosciences | TiO-96-CM |
References
- Hille, B. Ion Channels of Excitable Membranes. , Sinauer Associates. (1992).
- Kaczmarek, L. K. Non-conducting functions of voltage-gated ion channels. Nat. Rev. Neurosci. 7, 761-771 (2006).
- Levitan, I. B. Signaling protein complexes associated with neuronal ion channels. Nat. Neurosci. 9, 305-310 (2006).
- Shamah, S. M., Cunningham, B. T. Label-free cell-based assays using photonic crystal optical biosensors. Analyst. 136, 1090-1102 (2011).
- Cunningham, B. T., Laing, L. M. icroplate-based label-free detection of biomolecular interactions: applications in proteomics. Expert Rev. Proteomics. 3, 271-281 (2006).
- Peters, M. F., Vaillancourt, F., Heroux, M., Valiquette, M., Scott, C. W. Comparing label-free biosensors for pharmacological screening with cell-based functional assays. Assay Drug Dev. 8, 219-227 (2010).
- Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing. Biophys. J. 91, 1925-1940 (2006).
- Cunningham, B. T., et al. Label-free assays on the BIND system. J. Biomol. Screen. 9, 481-490 (2004).
- Hessel, A. aO., A, A. A New Theory of Wood's Anomalies on Optical Gratings. Appl. Optics. 4, 1275-1297 (1965).
- Cunningham, B. T., Laing, L. G. Advantages and application of label-free detection assays in drug screening. Expert Opin. Drug Discov. 3, 891-901 (2008).
- Lee, P. H. Label-free optical biosensor: a tool for G protein-coupled receptors pharmacology profiling and inverse agonists identification. J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 146-153 (2009).
- Bhattacharjee, A., Kaczmarek, L. K. For K+ channels, Na+ is the new Ca2. Trends Neurosci. 28, 422-428 (2005).
- Santi, C. M., et al. Opposite regulation of Slick and Slack K+ channels by neuromodulators. J. Neurosci. 26, 5059-5068 (2006).
- Yang, B., Desai, R., Kaczmarek, L. K. Slack and Slick K(Na) channels regulate the accuracy of timing of auditory neurons. J. Neurosci. 27, 2617-2627 (2007).
- Brown, M. R., et al. Fragile X mental retardation protein controls gating of the sodium-activated potassium channel. 13, 819-821 (2010).
- Zhang, Y., et al. Regulation of neuronal excitability by interaction of fragile X mental retardation protein with slack potassium channels. J. Neurosci. 32, 15318-15327 (2012).
- Barcia, G., et al. De novo gain-of-function KCNT1 channel mutations cause malignant migrating partial seizures of infancy. Nat. Genet. 44, 1255-1259 (2012).
- Fleming, M. R., Kaczmarek, L. K. Use of optical biosensors to detect modulation of Slack potassium channels by G protein-coupled receptors. J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 173-181 (2009).
- Nelson, C. D., et al. Targeting of diacylglycerol degradation to M1 muscarinic receptors by beta-arrestins. Science. 315, 663-666 (2007).
- Zhang, J. H. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Gribbon, P., et al. Evaluating real-life high-throughput screening data. J. Biomol. Screen. 10, 99-107 (2005).
