Summary
光バイオセンサー技術は、生細胞における形質膜の近傍の質量の変化を検出し、一方、個々の細胞および細胞集団の両方において細胞性応答に従うことを可能にすることができる。このプロトコルは、このアプローチを使用して、無傷の細胞におけるGタンパク質共役受容体によりカリウムチャネルの調節の検出について説明する。
Abstract
イオンチャネルを選択的にイオンが原形質膜1を流すことにより、ニューロンおよび他の興奮性の細胞型の電気的特性を制御する。神経細胞の興奮性を調節するために、イオンチャネルの生物物理学的特性は、多くの場合、ヘテロメリックチャネル複合体2,3を形成するために、チャネル自体に結合するシグナル伝達タンパク質および分子によって修飾されている。生きた細胞内の相互作用の時間経過にほとんどの情報を提供しながら、チャネルおよび調節タンパク質との相互作用を調べるの伝統的なアッセイは、潜在的に、タンパク質の動作を変更し、ターゲットの生理的関連性を減少させることができ、外因性のラベルが必要です。共振の変化を検出するために、光は、X-BODYバイオサイエンスBINDスキャナシステムなどのバイオセンサー、新規ラベルフリー技術を使用して、共振波長グレーティング（RWG）光学バイオセンサーは、バイオセンサー付近の光を反映していた。このアッセイは、相対的な検出を可能にするリガンド誘導性細胞接着の変化や広がり性、毒性、増殖、および原形質膜の近くのタンパク質 - タンパク質相互作用の変化に起因するバイオセンサー表面に付着した生細胞の底部内の質量変化。 RWGバイオセンサは、光学Gタンパク質共役受容体（GPCR）、受容体チロシンキナーゼ、及び他の細胞表面受容体の活性化後の細胞の原形質膜の近くの質量の変化を検出するために使用されてきた。イオンチャネル - タンパク質相互作用におけるリガンド誘導変化はまた、このアッセイを用いて研究することができる。本論文では、スラック-B型ナトリウム活性化カリウム（K Na）の GPCRによってチャネルの調節を検出するために使用される実験手順を説明します。
Introduction
その生理学的に適切なコンテキストで、生きた細胞を調べると、細胞標的の生物学的機能を理解することが重要です。しかしながら、このような免疫共沈降アッセイなどのチャネルおよび調節細胞質タンパク質との相互作用を調べるアッセイは、一般に生細胞における相互作用の時間経過にほとんど情報を提供する。現在のセルベースアッセイの大多数は、このような関心の蛍光タグ付けされたタンパク質の転座などの特定の細胞事象を測定する。これらのアッセイは、潜在的に、タンパク質の挙動を変化させ、標的の生理学的な関連性を減少させることができ、目的のタンパク質の修飾を必要とする。 、システムの操作を必要と細胞活性の連続的な測定を提供し、彼らの最も生理学的に関連する状態4にある細胞の研究を許可していない非侵襲的な細胞ベースのアッセイ、。
光学バイオセンサを製造するように設計されているセンサ表面に結合された光の特性の測定可能な変化。表面プラズモン共鳴（SPR）と共振波長格子（RWG）技術を含むエバネッセント波を利用する光学バイオセンサは、主にセンサー表面上に固定化されたそれらの生物学的受容体への結合分子の親和性および速度を検出するために使用されてきた。より最近では、市販のRWGバイオセンサは、高空間分解能（最大3.75ミクロン/ピクセル）5のセンサ表面への付着細胞の底部内の 質量の相対的変化の検出を可能にするために開発されてきた。これらのバイオセンサーは、細胞接着および拡散性、毒性、増殖、およびGタンパク質共役受容体（GPCR）を含む細胞表面受容体の種々によって誘発されるシグナル伝達経路などの刺激から生じる、生細胞の原形質膜の近傍の質量の変化を検出することができる6 。 RWGバイオセンサは、相対ちゃんを検出バイオセンサ7の150nmの内の質量の相対的変化の関数としての屈折率のシチズン。細胞は、バイオセンサーにメッキされている場合、屈折率のこの変化は、バイオセンサへの細胞付着の変化に起因する細胞の原形質膜の近くの質量の変化を反映する。このプロトコルは、RWGバイオセンサを使用してチャネル - タンパク質相互作用の検出について説明する。
RWGデータ収集システムは、複数のコンポーネントで構成されています。 X-BODY Biosciences社BINDスキャナがこれらの実験に使用されたため、我々は、プレートリーダー、関連するバイオセンサー、BINDスキャン取得ソフトウェア、およびBINDビュー解析ソフトウェア8から構成され、この特定のシステムのための構成要素を指すものとする。フォトニック結晶バイオセンサは、特定の光の伝播を防止する2又は3次元の誘電体材料の周期的な配置で構成され、光学バイオセンサと称する波長と方向。フォトニック結晶構造はウッドの異常と呼ばれる現象に基づいている。最初1902年にウッドによって発見され、これらの異常は、特定の回折次数の強度の急激な変化は、特定の狭い周波数帯域で発生する光の回折格子によって反射される光のスペクトルで観察された効果である。 1962年に、ヘッセルとOliner、有限期間格子は立って共振波長9を生成するWoodの異常の新しい理論を発表した。ここで説明する光学バイオセンサにおいては、木材の異常は、白色光で刺激された場合には、波長のごく狭い帯域（典型的には850から855 nm）を反映していることをRWGバイオセンサを製造するために使用される。
個々のバイオセンサーは、高屈折率誘電体材料の二酸化チタン（TiO 2）の薄層で被覆された周期的な表面構造を有する低屈折率プラスチック材料からなる。ときはbiosensまたは広い波長光源で照明されるフォトニック結晶の光学格子はBINDスキャナで分光光度計によって測定される光の波長の狭い範囲を反映する。反射波長（ピーク波長値またはPWV）のピーク強度は、信号から計算される。バイオセンサー表面の近接内の質量の増加または減少（〜150 nm）での結果としての屈折率の変化する光シフトのPWV。光学バイオセンサは、これらの実験で使用したアッセイのための標準的な生体分子科学学会（SBS）384ウェルマイクロプレートに組み込まれる。
RWVバイオセンサは、細胞10を生体内に外因性シグナルの添加により変化を検出するために使用される。 RWGバイオセンサと屈折の地元率変化の表面は特定の刺激で処理して監視されている上に細胞を直接培養する。バイオセンサにおける質量の変化の方向があり得る局所バイオセンサーの近くの質量の増加から生じる屈折の屈折率との増加はPWVの増加として測定されるので、決定した。逆に質量の減少は、PWVの減少を生成します。検出されたPWVの変化は、細胞接着の変化、タンパク質の補充/リリース、エンドサイトーシス、リサイクル、エキソサイトーシス、アポトーシス、および細胞骨格再配列を含む多数の細胞事象に起因することができます。例えば、アッセイは、カリウムチャネルおよび他の細胞質または細胞骨格成分の間のチャネル - タンパク質相互作用の変化を検出することができる。イベントは、しかしながら、原形質膜の近くに、バイオセンサーの近くに〜150nmの検出ゾーン内、および接続されたセルの場合に発生しなければならない。細胞応答の取得は、BINDスキャンソフトウェアを用いて実行され、SBSプレート384のウェルの各々の画像表現が生成される。このシステムは、単一細胞内のイベントの検出を可能にする、最大3.75ミクロン/ピクセルの解像度を有し、かつ（例えば、HEK293またはCHO細胞）細胞株、またはそれ以上の生理学的に関連する一次細胞のいずれかで使用することができる。 BIND Viewソフトウェアを有する画像分析は、個々の細胞の集団の両方における細胞応答の検出を可能にする。バイオセンサはマイクロプレート、384ウェル標準SBSに組み込まれるように、システムは、ハイスループットスクリーニング（HTS）に容易に適応可能である。
共振波長格子光学バイオセンサは、以前は11のGPCRの活性化後の細胞の原形質膜の近くの質量の変化を検出するために使用されてきた。当研究室では、2ナトリウム活性化（K Na）のカリウムチャネル、スラック-Bおよびスリック12をクローン化しています。スラック-Bとスリックチャネルの両方の活性が非常に強く、プロテインキナーゼC（PKC）13の直接的な活性化により影響されることが示されている。このような、M1ムスカリン受容体とのmGluR1代謝調節型グルタミン酸rとGαqはタンパク質共役型受容体の活性化eceptorは、強力PKC活性化を介してチャネル活性を調節する。これらのK のNaチャネルは、持続的な刺激の間に神経細胞の適応に貢献し、アクションのタイミングの精度が14を電位調節する。たるみチャンネルはFMRP、脆弱X精神遅滞タンパク質15,16を含む細胞質シグナル伝達分子、様々な相互作用することが知られている。乳児期（MMPSI）、重度の発達遅滞17になりてんかんの早期発症フォームの複数の移行部分発作のたるみ結果に突然変異。
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Protocol
1。細胞培養（フレミングとカツマレク18より）
- このアッセイにおける使用の前に2より大きく10未満の継代のための適切なメディアでの培養細胞。安定的にラットスラック-Bタンパク質を発現する非トランスフェクトHEK-293細胞およびHEK-293細胞を、リーボビッツL-15培地、10％熱不活化ウシ胎児血清および抗生物質を補充した半分のダルベッコ変法イーグル培地および半分で増殖させる。 500μg/ mlのジェネテシン（G418）を安定的にスラックチャネルの発現のために選択することスラック-Bを発現するHEK-293細胞に添加する。 0.25％トリプシン-EDTA溶液で皿から解離して70％〜90％のコンフルエンスで継代細胞。
2。フィブロネクチンおよび卵白アルブミンを用いたTiO 2の 384ウェル光学バイオプレートの細胞外マトリックス（ECM）コーティング
- フィブロネクチンECM混合物およびオボブロッキング溶液の調製
- fibronectのワーキング溶液を調製します20.0 mlのPBS中のフィブロネクチンの5μg/ mlの終濃度でリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中。 1.0 mg / mlのストック濃度から、200倍希釈のために20.0ミリリットルのPBSに100μLを加える。フィブロネクチンの使用液を調製後、等分し-20℃で保存することができます。
- 滅菌水中熱不活性化オボアルブミンの5％原液を準備します。 5％の溶液と無菌組織培養グレードの水にオボアルブミンを希釈し、60℃で30分間熱不活性化室温および滅菌フィルター溶液に溶液を冷却。 4℃で5％のオボアルブミン溶液及びストアを分取
- PBSに5％の原液を希釈することにより、オボアルブミンの2％ワーキング溶液を調製する。例えば、30.0ミリリットルの最終容量のPBS 18.0ミリリットルに5％卵白アルブミン原液を12.0ミリリットルを追加。
- 384ウェル光学バイオセンサープレートコーティング
- 20.0μL/ウェルとTiO 2のプレートを水和15分間の滅菌組織培養グレードの水。以下の手順では、16チャンネルピペッターを用いて行われるべきである。
- ウェルあたり50.0μlのPBSで洗浄プレート1X。
- 各ウェルにフィブロネクチン作業溶液の20.0μLを加え、ECMを作成するために、室温で2時間インキュベートする。
- ウェルあたり50.0μlのPBSで洗浄プレート1X。
- 各ウェルにオボアルブミン作業溶液の40.0μlを加え、プレートをブロックするために4℃で一晩インキュベートする。
- ウェルあたり50.0μlのPBSでプレート3回洗浄します。 ECMコーティングされたプレートは、最大48時間、4℃で保存することができる。
3。 384ウェル光学バイオプレートに細胞を播種
- 細胞から増殖培地を除去して、プレートから細胞を取り除くために、トリプシンを追加します。細胞を収集し、1分間の千×gで遠心する。増殖培地中のトリプシンのメディア再懸濁細胞を除去。
- 血球計数器または自動化を使用してセルカウンター、細胞の濃度を決定する。
- インキュベーション中の蒸発の影響を最小限に抑えるために、ウェル当たり増殖培地の50.0μlを用い説明する。細胞は、成長培地の50.0100μlの容量でウェル当たりの細胞の所望の数を達成するために希釈されるべきである。これらの実験のために、1,000細胞/ウェルを、バイオセンサー上にプレーティングした。
- 播種した細胞は、空気/ 5％CO 2下、37℃で増殖培地中で一晩インキュベートすることを可能にする。
4。 RWG光バイオアッセイのためのバイオセンサーと化合物プレートの調製
- インキュベーターからプレートを取り外して、細胞から増殖培地を除去します。細胞はハンクス平衡塩溶液（HBSS）で1×洗浄します。各ウェルにHBSSの25.0を添加する。
- BINDスキャナーでバイオセンサープレートを置き、細胞を1〜2時間室温に平衡化させる。
- 関心のあるリガンドは広告元となる別々の化合物プレートを準備しますアッセイ中にバイオセンサープレートにDED。これらのアッセイについては、化合物を含有する溶液の25.0μlを50.0μlの総容積のためのバイオセンサープレートに各ウェルに添加した。このように、溶液中の化合物を、2×所望の最終濃度で調製した。
5。 RWG光バイオアッセイを実施
- ウェルBINDスキャンソフトウェアを用いて各々の中心1.5ミリメートルのために3.75ミクロン/ピクセルの最大解像度を用いてウェルA1-P12（SBS 384ウェルプレートの半分）用のスキャナシステムを用いてベースライン測定値を取る。このベースラインスキャンは約30分かかります。
- 井戸A1-P12のために各ウェルに化合物溶液の25.0を添加する。
- ウェルA13-p24のベースライン測定を行う。
- ウェルA13-P24のために各ウェルに化合物溶液の25.0を添加する。
- 井戸A1-P12のためのポスト化合物添加の測定を行い、ウェルのA13-P24のために繰り返します。
6。 ABINDビューを用いたアッセイデータのnalysis
- Windowsでのベースライン測定のためのBINDアッセイデータを開き、セル選択を可能にするために「グリッド·エディタ」ボタンをクリックしてください。ソフトウェアは、ユーザによって定義された関心のあるメトリックを計算する。
- 「セルファインダー」と「ベースライナー」機能が含まれ、「プラグイン」を開きます。 「セルファインダー」に設定されたパラメータの細胞は、バイオセンサーのバックグラウンドと区別されるようにします。
- ベースライン測定のための「セル·ファインダー」は、データを含むセルのマップファイルをエクスポートします。
- 繰り返します、ポスト化合物添加·データの6.1から6.2を繰り返します。
- 「ベースライナー」プラグインを開いて、ベースライン測定からセルマップをインポートします。ソフトウェアは、背景とポスト複合データ間のPWVのシフトを計算します。
- 細胞に対するPWVの平均シフトの出力は、「Δセル平均」を選択します。データはその後、Microsoft Excのにエクスポートすることができますさらなる分析のためのEL。
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Representative Results
スラック-Bを安定してHEK-293細胞にトランスフェクトし、コントロール非トランスフェクトHEK-293細胞を、ウェル、384ウェル、ECMコーティングされたRWGバイオセンサプレートに1,000細胞/ウェルで播種した。バイオセンサーの中心1.5ミリメートル2からのイメージは、3.75ミクロン/ピクセルの解像度（ 図1）で記録した。塊の密度勾配マップは、予め生成され、BINDスキャンソフトウェアで30分後に化合物を添加した。 BIND Viewソフトウェアは、ベースラインからのPWV PWVポスト化合物の添加を減算することにより、GPCRアゴニスト添加時のPWVシフトを決定するために利用した。
内因性ムスカリン性M1受容体アゴニストcarbamoylcholineクロリド（カルバコール）19を安定して発現するHEK-293細胞PWVにおける正の増加（ 図2A）が得られたトランスフェクトしていない対照HEK-293およびラットスラック-Bの両方に適用した。測定は、30分に採取した信号は、（HBSS）additiだけをバッファリングするために標準化した上。対照細胞と比較して、スラック-Bトランスフェクトされた細胞はPWVのピークシフトが大きく増加した。 SFLLR-NH 2トリフルオロ酢酸塩（SFLLR）、内因性GPCRプロテアーゼ活性化受容体1（PAR1）に対するアゴニスト活性を呈するN-末端TRAPペンタペプチドもまた、トランスフェクトされていないとスラック-Bトランスフェクト細胞（ 図2B）に異なった応答を示した。これらの結果は、スラック-Bチャネルの存在が著しくHEK細胞における内因性GPCRの活性化の際に発生したPWVのシフトが大きくなり、チャネル - タンパク質相互作用を研究するために、このアッセイを使用することの実現可能性を実証示す。
図1。 BINDのViewの細胞応答の解析。BINDScanner dの代表的な画像 BINDのViewソフトウェア「セルファインダー」プラグインを使用して画像解析後のスラック-BのATA安定にトランスフェクトされたHEK-293細胞A）の前およびB）。しきい値は、手動で「セルファインダー」プラグインの背景から細胞を識別するために利用することとした。B）に赤で示される領域が、細胞に属すると黄色のラインがグレーのプレートの背景から細胞を区別するように識別された画素を表す。C）PWVのシフトをSFLLRの添加時に細胞を赤色PWVにおける正のシフトを表し、青色は変化がないことを表す色勾配によって示されている。スケールバーは、100μmを表しています。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
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図2。スラック-Bの発現は、GPCRの活性化に続いてPWVのシフトを変更します。A）、M1ムスカリン受容体作動薬であるカルバコール（500μM）は、制御HEK-293細胞（よりスラック-Bトランスフェクションした細胞では振幅が大きく、PWVのシフトをもたらしたSFLLR（10μM）、GPCRの内因性プロテアーゼ活性化受容体1（PAR1）に対するアゴニスト活性を呈するN-末端TRAPペンタペプチドのP <0.0001、N = 16ウェル/条件）。B）アプリケーションは、PWV応答のシフトを生じたすなわち、制御HEK-293細胞（P <0.0001、N = 16ウェル/条件）に比べスラック-B-トランスフェクト細胞における振幅が大きくなる。測定は、30分後、化合物添加を記録し、リガンド応答が制御のみをバッファするために標準化した。エラーバーは±SEMである。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
Z素数（Z '）因子は、ハイスループットスクリーニングアッセイ20の品質を定量化するための一般的な統計的方法であり、このアッセイにおけるGPCRアゴニストのスクリーニングは、SBS互換性のある384ウェルアッセイにおいて発生したため、優れを提供このアッセイ21の堅牢性と妥当性の尺度。 1のAZ 'の値は、存在しない標準偏差を持つデータポイントの数が無限で、理論的に理想的なアッセイを示している。 0.5を下回るわずかに有益と考えアッセイで0.5〜1の間のAZ '値は、ハイスループットスクリーニングの目的のための優れたアッセイと考えられる。このデータセットでは、陽性対照としてSFLLRカルバコールを利用して計算Z '値は、このアッセイは、非常に堅牢であり、得られた結果は非常に重要であることを示す、それぞれ0.79と0.81である。
384ウェル光学バイオプレート、細胞播種および化合物添加の細胞外マトリックスコーティングこれらの実験で16チャンネルのフィンピペット（5〜50μl）を用いて手動で行った。このアッセイは、SBSプレート上で行われるように、より高度なロボット液体ハンドリングシステムは、ハイスループットスクリーニングに用いることができる。液体処理計装のためのシステムを適応させるところが、ケアは、これは、バイオセンサーへの故障の原因になりますので、そのピペットチップは、バイオセンサー表面に触れないようにするために行使しなければならない。
DMSOに溶解した化合物を添加する際にアッセイ培地中のDMSOの最終濃度は、セル（「DMSOショック」）のDMSO毒性に対するPWVのシフトを回避するために一定に保持されるように、アッセイが行われなければならない。異なる細胞株は、このアッセイでは、DMSOに差動的に応答するが、我々は、DMSOの最終濃度が体積0.1から0.2パーセントを超えないようにすることをお勧めします。細胞はsolvenを避けるために、このプロトコルの温度平衡工程中に、アッセイ緩衝液中のDMSOの最終濃度でインキュベートされるべきであるPWV中のT-誘起シフト。
各細胞株についてのアッセイの最適化が実行されなければならないが、一次細胞を含む、多様な範囲は、このアッセイを用いて研究することができる。異なる細胞型を使用する場合、細胞と細胞外マトリックスバイオセンサー表面コーティングの数の最適化が行われるべきである。細胞は、1,000〜15,000細胞/ウェルの間に種々の密度で播種し、最も高いZ 'を生成する濃度を決定するための公知の受容体アゴニストで治療すべきである。を含むが、単独または組み合わせで、フィブロネクチン、コラーゲン、およびラミニンに限定されない種々のECM表面コーティングは、細胞がアッセイの間、バイオセンサに付着したままであることを保証するためにテストされるべきである。細胞飢餓（血清の欠如）は、このアッセイにおいて細胞応答に影響を与えることができ、そのような実験は、最初のアッセイの最適化のために無血清および血清含有培地で行うことができるように。 BINDスキャナのラベルの無料の高分解能細胞応答の分析は、細胞によって接触画素のみに制限することができるので、検出は、低い細胞密度で定量すべき応答測定を可能にする。加えて、不均一混合物内の細胞の亜集団は、（細胞接着の大きさと強さを含む）複数のパラメータに基づいてゲート制御することができ、個々の細胞応答を測定した。まとめると、これらの機能は、初代培養細胞を含むアッセイ用のBINDスキャナに最適です。
BINDスキャナシステムは、測定値が指定された時間にわたってとられるべきではなく、従って、PWVの変化を経時的に測定値を記録することができる可能にする。これは、細胞増殖、細胞分裂、および細胞遊走を含むチャネル - タンパク質相互作用に起因するものよりも長い期間にわたって起こる細胞挙動の変化を測定するために特に有用である。 BIND Viewソフトウェアは、そのような細胞応答の分析を可能にする、数多くの中のパラメータを定量化することができ定量分析し、これらのイベントのタイムラプスイメージングの両方を可能にする細胞接着の変化、細胞体積の変化、および細胞移動の変化を含む細胞構造の変化、のrsは、。例えば、このシステムは、線維芽細胞は、個々のウェルを横切っての細胞移動の速度を追跡することにより増殖因子シグナル伝達に応答する速度を決定するために使用することができる。
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Disclosures
スティーブンM. Shamahは、X-BODY Biosciences社の従業員である。
Acknowledgments
著者らは、 安定的にラットスラック-Bタンパク質を発現する HEK293細胞の寛大な寄付のためのエール大学の博士フレッドSigworthの研究室で博士襄陽ヤンに感謝しています。さらに著者らは、ビデオ紹介に表示スラックの低 温電子顕微鏡相同性モデル博士Sigworthに感謝しています。この研究は、LKKにNIHの助成DH067517とNS073943によってサポートされていました
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, High Glucose | Life Technologies | 11965-092 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Geneticin G-418 Sulfate | American Bioanalytical | AB05057 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-092 | |
| Fibronectin from human plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Albumin from chicken egg white | Sigma-Aldrich | A5378 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-6 | |
| Carbamoylcholine chloride | Sigma-Aldrich | C4382 | |
| SFLLR-NH2 trifluoroacetate salt | Sigma-Aldrich | S8701 | |
| Finnpipette (5-50 µl) | Thermo Scientific | 4662090 | |
| BIND Scanner System | X-BODY Biosciences | N/A | |
| 384-well TiO2 coated plates | X-BODY Biosciences | TiO-96-CM |
References
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