Summary
Optik biosensor teknikleri canlı hücrelerin içindeki plazma zarının hemen yakınındaki kütlesinde değişiklikleri algılar ve bir tek hücre ve hücre popülasyonları hem de hücresel yanıtları takip izin verebilir. Bu protokol, bu yaklaşımı kullanarak sağlam hücrelerdeki G-protein bağlı reseptörler ile potasyum kanallarının modülasyonu algılanmasını anlatacağız.
Abstract
İyon kanalları seçici iyonları, plazma zarının 1 akmasına izin vererek, nöronlar ve diğer uyarılabilir hücre tiplerinin elektrik özelliklerini kontrol eder. Nöronal uyarılabilirliği düzenlemek için, iyon kanallarının biyofiziksel özellikleri çoğu zaman bir heteromerik kompleks kanal 2,3 oluşturmak için kanallar kendilerini bağlayan protein ve sinyal molekülleri tarafından modifiye edilir. Canlı hücrelerde etkileşimler zaman süreci hakkında az bilgi sağlarken kanalları ve düzenleyici proteinleri arasındaki etkileşimi incelemek geleneksel deneyler, potansiyel olarak proteinin davranışını değiştirebilir ve hedefin fizyolojik önemi düşürebilir dışsal etiket gerektirir. Örneğin X-BODY Bıoscıences BIND Tarayıcı sistem olarak optik biyosensörler, rezonans değişiklikleri algılamak için, yeni bir etiket içermeyen teknoloji, rezonans dalga boyu ızgara (RWG) optik biyosensör kullanmak biyosensör yakın ışık yansır. Bu deney sağlar: göreceli algılamahücre yapışmasında ligand bağlı değişiklikler ve yayılma, toksisite, proliferasyon ve plazma zarı yakın protein-protein etkileşimleri değişikliklerden kaynaklanan biyosensör yüzeyine yapışık canlı hücre alt kısmı içinde kütle olarak değiştirin. RWG'nin optik biyosensörler G-protein bağlı reseptörler (GPCR'ler), reseptör tirozin kinazlar ve diğer hücre yüzeyi reseptörlerinin aktivasyonu takiben hücrelerin plazma zarı yakın kütle değişiklikleri tespit etmek için kullanılmıştır. Iyon kanalı-protein etkileşimleri Ligand ile uyarılan değişiklikler de bu tahlil kullanılarak incelenebilir. Bu yazıda, Slack-B sodyum-potasyum aktive GPCRs tarafından (K Na) kanalları modülasyonu algılamak için kullanılan deneysel prosedür anlatacağız.
Introduction
Bunların fizyolojik olarak ilgili bağlamda canlı hücrelerin incelenmesi, hücresel hedefler biyolojik fonksiyonları anlamak için çok önemlidir. Bununla birlikte, kanal ve bu coimmunoprecipitation tahlilleri gibi düzenleyici sitoplazmik proteinler arasındaki etkileşimi incelemek tahliller, genel olarak, canlı hücrelerde etkileşimler zaman süreci ile ilgili çok az bilgi sağlar. Mevcut hücre bazlı deneylerde büyük bir çoğunluğu bu ilgi bir floresan etiketli proteinin translokasyon gibi belirli bir hücresel etkinlik, ölçün. Bu deneyler, potansiyel proteinin davranışını değiştirebilir ve hedefin fizyolojik önemi azaltabilir, ilgi konusu proteinlerin modifikasyonları gerektirir. , Sistemin işleme gerektiren hücresel aktivite sürekli bir ölçümünü sağlar ve en uygun durumda fizyolojik olarak 4 hücre çalışmaları izin vermez invaziv olmayan hücre bazlı deneyler,.
Optik biyosensörler üretmek için tasarlanmıştırsensör yüzeyine birleştirilmiş olan bir ışık karakteristik bir değişiklik ölçülebilir. Yüzey plazmon rezonansı (SPR) ile rezonans dalgaboyu ızgara (RWG) teknikler kaybolan dalgalar kullanan optik biyosensörler, öncelikle sensör yüzeyi üzerinde hareketsizleştirilmiş biyolojik reseptörlerine bağlanma moleküllerinin afinite ve kinetik tespit etmek için kullanılmıştır. Daha yakın zamanda, ticari olarak temin edilebilir RWG biyosensörler yüksek uzamsal çözünürlük (en fazla 3.75 mikron / piksel) 5 de sensor yüzeyine yapışık hücre alt kısmı içinde kütlesindeki nispi değişimin saptanmasına olanak tanınması için geliştirilmiştir. Bu biyosensörler, hücre yapışması ve yayılması, toksisite, çoğalması ve G-protein bağlı reseptörler (GPCR'ler) de dahil olmak üzere hücre yüzeyi reseptörlerinin çeşitli tarafından ortaya çıkarılan sinyal yollarının olarak uyarılması sonucu canlı hücreler, plazma zarı yakın kütle değişiklikleri saptayabilir 6 . İÇG biyosensörler göreli chan tespitbiyosensör 7, 150 nm olan kütlesindeki nispi değişimin bir fonksiyonu olarak kırılma endeksi ge. Hücreler biyosensör için kaplama zaman, kırılma endeksi, bu değişiklik, biyosensör için hücresel yapışma içinde değişimden ortaya çıkan hücrenin plazma zarının yakın kütle değişimi yansıtır. Bu protokol RWG'nin biyosensörler kullanarak kanal-protein etkileşimlerinin algılama tartışılacaktır.
RWG'nin veri toplama sistemleri birçok bileşenden oluşur. X-BODY Bıoscıences BIND Tarayıcı Bu deneyler için kullanılan Çünkü, biz bir plaka okuyucu, ilişkili biyosensör, BIND Tarama toplama yazılımı ve BIND Görünüm analiz yazılımı 8 oluşan bu özel sistem için bileşenleri ifade eder. Fotonik kristal biyosensörler, optik biyosensörler değinilmektedir, bir periyodik düzenlemesi oluşan belirli bir ışığın ilerlemesini önler 2 ya da 3 boyutlu olarak ve dielektrik malzemedalga boyları ve yönleri. Fotonik kristal yapılar Wood'un anomali denilen bir olgu dayanmaktadır. İlk olarak 1902 yılında Wood tarafından keşfedilen, anormallikler, özellikle kırılma siparişinin yoğunluğunda hızlı değişimler belirli dar bir frekans bantlarında meydana optik kırılma ızgarası ile yansıtılan ışığın spektrumunda gözlenen etkileri vardır. 1962 yılında, Hessel ve Oliner sonlu dönemi ızgara ayakta rezonans dalga boyu 9 oluşturduğu, Wood'un anomalilerin yeni bir teori sundu. Burada tarif edilmiş olan optik biyosensör olarak, Wood anomalileri beyaz ışık ile uyarıldığında dalga boyu, sadece çok dar bir bant (tipik olarak 850-855 nm) yansıttığı bir RWG'nin biyosensör üretmek için kullanılır.
Bireysel biyosensörler yüksek kırılma dielektrik malzemesi titanyum dioksit (TiO 2) ince bir tabaka ile kaplanmış olan bir periyodik bir yüzey yapısına sahip, düşük kırılma indeksli bir plastik malzemeden oluşur. Ne biosensveya Fotonik kristallerin optik ızgara BIND Tarayıcı bir spektrofotometre ile ölçülür ışığın dalga boyu dar bir aralık yansıtan geniş bir dalga boyu ışık kaynağı ile aydınlatılır. Yansıyan dalga boyunda (tepe değer Dalga boyu veya PWV) zirve yoğunluğu daha sonra sinyalden hesaplanır. Biosensor yüzeyin yakınlık içinde kütlesinde bir artış veya azalma (~ 150 nm) bir sonucu olarak kırılma indisindeki bir değişiklik, üzerine hafif kaymaların PWV. Optik biyosensörler Biyomoleküler Sciences için standart Derneği (SBS), bu deneylerde kullanılan deneyleri için 384 oyuklu mikro-plaka içine dahil edilmiştir.
RWV biyosensörler hücreleri 10 oturma eksojen sinyallerinin eklenmesi üzerine değişiklikleri tespit etmek için kullanılır. Hücreler doğrudan RWG'nin biyosensör yüzeyi üzerine kültürlenir ve kırılma yerel endeksinin değişimi belli bir uyarana ile işlenmesi üzerine izlenir. Biosensör kütle değişikliği yön olabilirYerel biosensör yakın kütlesinde bir artış kırılma endeksi ve sonuç olarak bir artış PWV bir artış olarak ölçülür, çünkü belirlenmiştir. Tersine kütlesinde bir azalma PWV bir düşüş üretir. Tespit PWV değişiklik hücre yapışması değişiklikler, protein işe / serbest bırakılması, endositoz ve geri dönüşüm, ekzositoz, apoptoz ve hücre iskeleti yeniden düzenlenmesi de dahil olmak üzere çok sayıda hücresel olaylar, neden olabilir. Örneğin, tahlil, potasyum kanallarını ve diğer sitoplazmik ya da hücre iskelet yapısı arasında kanal-protein etkileşimleri değişiklikleri tespit edilebilir. Olay, ancak, biosensör yakın ~ 150 nm saptama bölgesi içinde meydana gelir ve plazma zarı yakın bağlı bir hücrenin, söz konusu olmalıdır. Hücresel tepkilerin kazanılması BIND Scan yazılımı ile gerçekleştirilir ve SBS levhadaki 384 kuyu her bir görüntü gösterimi oluşturulur. Bu sistem tek bir hücre içinde olayların tespitine olanak sağlayan, en fazla 3.75 mm / piksel çözünürlüğe sahip ve(örneğin, HEK293 ya da CHO hücreleri gibi) hücre hatları ile birlikte ya da daha fazla fizyolojik olarak uygun primer ya da hücreleri ile kullanılabilir. BIND görüntüle, yazılımı ile görüntü analizi ve bireysel hücre popülasyonları hem de hücresel yanıtları saptanmasını sağlar. Biyosensörler mikro 384 oyuklu standart SBS dahil edilir olarak, sistem, yüksek verimli tarama (HTS) için kolayca uyarlanabilir.
Rezonans-dalga boyu ızgara optik biyosensörler önce GPCRs 11 aktivasyonu, aşağıdaki hücrelerin plazma zarı yakın kütle değişiklikleri tespit etmek için kullanılmıştır. Bizim laboratuvar iki sodyum-aktif (K Na) potasyum kanalları, Slack-B ve Slick 12 klonlanmış oldu. Her iki B-Fren ve kaygan kanallarının aktivitesi çok güçlü bir protein kinaz C (PKC) aktivasyonu 13 doğrudan etkilenmiş olduğu gösterilmiştir. Bu tür muskarinik M1 reseptör ve mGluR1 metabotropik glutamat olarak R Gα q protein bağlı reseptörler, aktivasyonuçifti donörlüğü, kuvvetli PKC aktivasyonu yoluyla kanal aktivitesini düzenler. Bu K, Na kanal tutmalı uyarılması esnasında nöronal uyum katkı ve eylem zamanlama hassasiyeti 14 potansiyeller düzenler. Slack kanalları FMRP, Fragile X Zihinsel Engelliler protein 15,16 dahil sitoplazmik sinyal molekülleri, çeşitli etkileşim bilinmektedir. Bebeklik (MMPSI), ağır gelişme geriliği 17 sonuçları epilepsi erken başlangıçlı formu Çoklu Geçiş Kısmi Yakalanan Gevşek sonucu mutasyonlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Hücre Kültürü (Fleming ve Kaczmarek 18 uyarlanmıştır)
- 2 'den büyük, fakat 10'dan daha az ifadeler, bu deneyde kullanmadan önce uygun ortam içinde kültür hücreleri. Kararlı biçimde sıçan Slack-B proteini ifade Transfekte edilmemiş HEK-293 hücreleri ve HEK-293 hücreleri, Leibovitz L-15 Orta% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu ve antibiyotikler ile takviye edilmiş bir yarım Dulbecco'nun Modifiye edilmiş Eagle ortamında ve bir yarısı yetiştirilmektedir. 500 ug / ml Geneticin (G418) sabit bir şekilde Slack kanalının sentezlenmesi için seçmek üzere Slack-B ifade eden HEK-293 hücrelerine ilave edilir. % 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi ile kaplarından ayrışma ile% 70-90 izdiham Geçiş hücreleri.
2. Fibronektin ve Ovalbumin ile TiO2 384-Optik Biosensor Plate Ekstrasellüler Matriks (ECM) Kaplama
- Fibronektin ECM karışımına ovalbümin bloke çözeltisinin hazırlanması
- Fibronect bir çalışma çözeltisi hazırlayın20.0 ml PBS içinde fibronektinin 5 ug / ml 'lik bir son konsantrasyon ile fosfat tamponlu tuzlu su (PBS). Bir 1.0 mg / ml stok konsantrasyonu, bir 200-kat seyreltme için 20.0 ml PBS ile 100 ul ekle. Fibronektin çalışma çözeltisi hazırlandıktan sonra, numune alınır ve -20 ° C'de muhafaza edilebilir.
- , Steril su içinde ısı ile inaktive edilmiş ovalbümin% 5 stok çözelti hazırlayın. % 5 çözeltisi ve steril doku kültürü dereceli su içinde ovalbümin seyreltin, 60 ° C'de 30 dakika süre ile ısı ile inaktive Oda sıcaklığı ile steril filtre çözelti çözüm soğutun. 4 ° C'de% 5 ovalbümin çözeltisi ve mağaza alikotu
- PBS içinde% 5 stok çözelti seyreltilerek ovalbümin% 2 çalışma çözeltisi hazırlayın. Örneğin, 30.0 ml 'lik bir son hacim için PBS 18.0 ml% 5 ovalbümin stok çözeltisinin 12.0 ml.
- 384 oyuklu optik biyosensör plaka kaplaması
- 20.0 ul / kuyu ile TiO2 plakasını hidrat15 dakika için steril doku kültürü dereceli su. Aşağıdaki adımlar 16 kanallı bir pipet ile yapılmalıdır.
- Kuyu başına 50.0 ul PBS ile plaka 1x yıkayın.
- Her çukuruna fibronektin çalışma çözeltisinin 20.0 ul ekleyin ve ECM'yi oluşturmak için oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe edilir.
- Kuyu başına 50.0 ul PBS ile plaka 1x yıkayın.
- Her bir oyuğa ovalbümin çalışma çözeltisinin 40.0 ul ekleyin ve plaka engellemek için 4 ° C'de gece boyunca inkübe edilir.
- Kuyu başına 50.0 ul PBS ile plaka 3x yıkayın. ECM ile kaplanmış levhalar kadar 48 saat boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
3. 384-de optik biyosensör Plate üzerine Hücrelerinin tohumlama
- Hücrelerden büyüme ortamı çıkarın ve plaka hücreleri çıkarmak için tripsin ekleyin. Hücreleri toplamak ve 1 dakika boyunca 1.000 xg'de santrifüj. Büyüme ortamı içinde tripsin ortam ve hücreler tekrar süspansiyon çıkarın.
- Hemasitometre veya otomatik kullanmahücre sayacı, hücrelerin konsantrasyonunu belirler.
- Inkübasyon sırasında buharlaşma etkisini en aza indirmek için, oyuk başına büyüme ortamı 50.0 ul kullanılacaktır. Hücreler büyüme ortamı 50.0 | il hacminde göz başına hücrelerin istenen sayıda elde etmek için seyreltilmelidir. Bu deneyler için, 1,000 hücre / çukur biyosensör üzerine kaplandı.
- Serpilen hücreleri, hava /% 5 CO2 altında 37 ° C'de büyüme ortamı içinde bir gece boyunca inkübe izin verin.
4. RWG'nin Optik Biosensor Testi için Biosensor ve Bileşik Plakaların hazırlanması
- Inkübatör plaka kaldırmak ve hücrelerden büyüme ortamı çıkarın. Hücreler Hanks Dengelenmiş Tuz Çözeltisi (HBSS) ile 1x yıkayın. Her bir oyuğa HBSS 25.0 ul ekleyin.
- BIND Tarayıcı üzerinde biyosensör plakayı ve hücreler, 1-2 saat boyunca oda sıcaklığında dengelenmeye bırakın.
- Ilgi ligandları reklam olacak ayrı bir bileşik tabak hazırlayıntahlil sırasında biyosensör plakasına ded. Bu deneyler için, çözelti içeren bileşiğin 25.0 ul 50.0 ul toplam hacim için biyosensör plaka üzerinde her bir oyuğa ilave edildi. Bu nedenle, çözelti içinde 2x bileşikler, arzu edilen nihai konsantrasyon hazırlanmıştır.
5. RWG'nin Optik Biosensor Testi gerçekleştirin
- Iyi BIND Tarama yazılımını kullanarak her merkezi 1.5 mm için 3.75 mm / piksel maksimum çözünürlük kullanılarak kuyu A1-P12 (SBS 384-plaka yarısı) için Scanner sistemi ile temel ölçü almak. Bu temel tarama yaklaşık 30 dakika sürer.
- Kuyu A1-P12 için her bir oyuğa bileşik çözümler 25.0 ul ekleyin.
- Kuyular A13-P24 bir temel ölçü almak.
- Kuyu A13-P24 için her bir oyuğa bileşik çözümler 25.0 ul ekleyin.
- Kuyular A1-P12 için bir post bileşik ilave ölçüm alın ve kuyular A13-P24 için tekrarlayın.
6. ABIND Manzaralı Deneyi Veri nalysis
- Windows başlangıç ölçümü için BIND tahlil verileri açın ve hücre seçimi etkinleştirmek için "Izgara Editör" butonuna tıklayın. Yazılım kullanıcı tarafından tanımlanan ilgi ölçümleri hesaplamak olacaktır.
- "Hücre Finder" ve "baseliner" fonksiyonu vardır "Plug-ins", açın. "Hücre Finder" set parametreler hücreler biyosensör kökenli ayırt böylece.
- Bazal ölçüm için "Hücre Finder" verileri içeren hücre harita dosyası ihracat.
- Tekrar sonrası bileşik ilave veriler için 6,1-6,2 adımları.
- "Baseliner" plug-in açın ve taban ölçümünün hücre harita ithalat. Yazılım plan ve sonrası bileşik veri arasındaki PWV yılında vardiya hesaplamak olacaktır.
- Hücreler için PWV yılında ortalama vardiya çıkışı için "Δ Cep Mean" seçeneğini seçin. Veriler daha sonra Microsoft Exc ihraç edilebilirdaha fazla analiz için el.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Slack-B kararlı biçimde HEK-293 hücreleri transfekte edilmiş ve kontrol transfekte HEK-293 hücreleri de 384, ECM kaplanmış RWG biyosensör plakalar üzerinde 1000 hücre / tohumlanmıştır. Biyosensör merkezi 1.5 mm 2 Görüntüler 3.75 mm / piksel çözünürlükte (Şekil 1) kaydedildi. Kütlenin yoğunluk gradyan haritaları önceden oluşturulan ve BIND Scan yazılımı ile 30 dakika sonrası bileşik ilave edildi. BIND View yazılımı temel PWV gelen PWV sonrası bileşik ek çıkarılarak GPCR'dir agonist ilavesi üzerine PWV olarak kayması belirlemek için kullanılmıştır.
Endojen M1 muskarinik reseptör agonisti carbamoylcholine klorür (karbakol) 19 sabit olarak HEK-293 hücreleri PWV pozitif bir artış (Şekil 2A) ile sonuçlanmıştır ifade eden transfekte HEK-293 kontrol ve sıçan Slack-B hem de uygulandı. Ölçümler, 30 dakika sonra alınmış ve sinyalleri (HBSS) Additi sadece tampon normalleştirildiüzerinde. Kontrol hücreleri ile karşılaştırıldığında, Slack-B ile transfekte edilmiş hücrelerin PWV pik kayması daha büyük bir artış göstermiştir. SFLLR-NH2 trifloroasetat tuzu (SFLLR), endojen GPCR proteaz aktive olan reseptör 1 (PAR1) karşı agonist aktivite sergileyen bir N-terminal TRAP pentapeptit, aynı zamanda transfekte edilmemiş ve Slack-B transfekte edilmiş hücreler (şekil 2B) farklı yanıtlar göstermiştir. Bu sonuçlar, Slack-B kanalının bulunması önemli HEK hücrelerinde endojen GPCRs aktivasyonu üzerine cereyan PWV olarak kayması artar ve kanal-protein etkileşimleri incelemek için bu deney kullanılarak uygulanabilirliğini göstermek göstermektedir.
Şekil 1. BIND View Hücresel Yanıtları Analizi. BINDScanner d Temsilcisi görüntüleri ata Slack-B stabil transfekte HEK-293 hücrelerinde A) BIND View yazılımı "Hücre Finder" plug-in ile görüntü analizi sonra) önce ve B. Eşikleri elle "Hücre Finder" plug-in background. B hücreleri tanımlamak için) hücreleri ve sarı hatlarına ait olduğu tespit pikselleri temsil kırmızı gösterilen alanlar gri plaka arka PWV içinde. C) kayma hücreleri ayırt kullanılarak kuruldu SFLLR eklenmesi üzerine hücreler kırmızı PWV ve mavi olumlu bir değişimi temsil eder, bir renk degrade, gösterdiği için herhangi bir değişiklik gösterir. Ölçek çubuğu 100 mikron temsil eder. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
00px "/>
Şekil 2. Slack-B ekspresyonu GPCRs. A) M1 muskarinik reseptör agonisti karbakol (500 uM) kontrol HEK-293 hücrelerinden daha Slack-B ile transfekte olmuş hücrelerde genlik büyüktür PWV bir kayma üretilen aktivasyonu aşağıdaki PWV olarak kayma (değiştirir SFLLR (10 uM), GPCR endojen proteaz ile aktive edilen reseptör 1 (PAR1) karşı agonist aktivite sergileyen bir N-terminal TRAP pentapeptitten P <0.0001, N = 16 kuyu / durumu). B) Uygulama, PWV yanıt olarak üretilen bir kayma bu kontrol grubuna göre Slack-B-transfekte olmuş hücrelerde genlik HEK-293 hücreleri (P <0.0001, N = 16 kuyu / durumu) daha fazladır. Ölçümler 30 dakika sonrası bileşik ek kaydedildi ve ligand cevabı sadece tampon kontrol normalize edildi. Hata çubukları ± SEM vardır. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Z ana (Z ') faktör yüksek verimli bir tarama deneyinde 20 kalitesini ölçmek için yaygın istatistiksel bir yöntemdir, ve bu tahlilde GPCR agonistlerinin tarama bir SBS uyumlu bir 384 tahlilinde oluştuğu için, mükemmel bir sağlar Bu deneyde 21 sağlamlık ve geçerlilik ölçüsü. 1 AZ 'değeri varolmayan standart sapmalar ile veri noktaları sonsuz sayıda bir teorik ideal bir tahlil gösterir. 0.5 'in altında bir marjinal bilgi deney dikkate ile 0,5-1 arasında bulunan AZ' değeri, yüksek verimli tarama amaçları için mükemmel bir tahlil olarak kabul edilir. Bu veri seti için, pozitif bir kontrol olarak bir SFLLR karbakol kullanılarak hesaplanan Z 'değeri, bu deney, son derece sağlamdır ve elde edilen sonuçların oldukça önemli olan gösteren, sırasıyla 0.79 ve 0.81 olan.
384 oyuklu optik biyosensör levha, hücre tohumlama ve bileşim ek olarak hücre dışı matris kaplamaBu deneylerde, 16 kanallı Finnpipette (5-50 ul) ile el ile gerçekleştirildi. Bu tahlil, bir SBS bir plak üzerinde gerçekleştirildi gibi, daha gelişmiş robot sıvı taşıma sistemleri, yüksek verimli tarama olarak kullanılabilir. Sıvı taşıma enstrümantasyon sistemlerinin uyarlanması Ancak, bakımı bu biyosensör zarar verir gibi bu pipet uçları biyosensör yüzeyine dokunmayın sağlamak için dikkat edilmelidir.
DMSO içinde çözülmüş bileşikleri eklenirken deney ortamı içinde nihai DMSO konsantrasyonu, hücreye bağlı DMSO toksisiteye PWV bir değişikliği ("DMSO şoku") önlemek için sabit tutulur, böylece deney gerçekleştirilmelidir. Farklı hücre çizgileri bu tahlilde DMSO'ya farklı olarak duyarlı olmakla birlikte, DMSO'nun nihai konsantrasyonu, hacimce% 0.1-0.2 oranında geçmemesi önerilir. Hücreler Solvent önlemek için bu protokol, sıcaklık dengeleme aşaması esnasında deney tamponu içinde nihai DMSO konsantrasyonu inkübe edilmelidirPWV t kaynaklı geçer.
Her bir hücre hattı için tahlilinin optimizasyonu gerçekleştirilmelidir, ancak, birincil hücreler dahil, hücrelerin, çok çeşitli, bu deneyde ile incelenebilir. Farklı hücre tipleri kullanırken, hücreler ve hücre-dışı matris biyosensör yüzey kaplamaları sayısının optimizasyonu yapılmalıdır. Hücreler 1,000-15,000 hücre / göz arasında çeşitli yoğunluklar tohumlanır ve en yüksek Z 'üreten yoğunluğu belirlemek için bilinen bir reseptör agonisti ile tedavi edilmelidir. Dahil olmak üzere, ancak tek başına ya da kombinasyon halinde, fibronektin, kolajen ve laminin ile sınırlı değildir çeşitli ECM yüzey kaplamaları, hücreler, deney sırasında biyosensör yapışık kalmasını sağlamak için test edilmelidir. Hücre açlık (serum eksikliği) bu deneyde hücre yanıtı etkileyebilir ve bu deneyler, ilk deney optimizasyonu amaçlı serumsuz ve serum ihtiva eden bir ortam içinde gerçekleştirilebilir edilebilir. Olabilir BIND Tarayıcı etiketi ücretsiz yüksek çözünürlüklühücresel yanıtların analizi, hücreler ile temas yalnızca piksel ile sınırlı olabilir çünkü tespit düşük hücre yoğunluğunda sayısal olarak tepki ölçümleri sağlar. Buna ek olarak, heterojen bir karışımı içindeki hücrelerin altgrupları kapılı (boyut ve hücre yapışmasının gücü dahil) çok sayıda parametrelere dayalı olabilir ve tek tek hücre yanıtları için ölçülmüştür. Birlikte ele alındığında, bu yetenekleri birincil kültür hücreleri içeren deneyleri için BIND Tarayıcı idealdir.
BIND Tarayıcı sistemi ölçümleri belirli bir zaman boyunca alınacak ve bu nedenle PWV değişikliklerin time-lapse ölçümleri kaydedilebilir verir. Bu hücre çoğalması, hücre bölünmesi ve hücre göçü de dahil olmak üzere kanal-protein etkileşimleri nedeniyle daha uzun bir zaman dilimi boyunca meydana hücre davranış değişiklikleri ölçmek için özellikle yararlıdır. BIND görüntüle, yazılım gibi hücresel tepkilerin analizi için sağlar ve çok sayıda Paramete sayısal olarak, hücre yapışma değişiklikler, hücre hacmindeki değişiklikler, ve hücre hareketinde değişiklikler dahil olmak üzere kantitatif analizi ve bu olayların zaman atlamalı görüntüleme hem de sağlayan hücre yapısında değişiklikler, rs. Örneğin, bu sistem fibroblastlar iyi bir birey üzerinde hücre göçü oranını takip ederek sinyal büyüme faktörü yanıt oranını belirlemek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Steven M. Shamah X-BODY Biyobilimlerdeki bir çalışanıdır.
Acknowledgments
Yazarlar stabil sıçan Slack-B proteini ifade HEK293 hücrelerin cömert bağış için Yale Üniversitesi'nden Dr Fred Sigworth laboratuvarında Dr Yangyang Yan minnettarız. Ayrıca yazarlar Video tanıtımı görüntülenen Slack kriyo-elektron mikroskopisi homoloji modeli için Dr Sigworth minnettarız. Bu araştırma LKK NIH Hibe DH067517 ve NS073943 tarafından desteklenmiştir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, High Glucose | Life Technologies | 11965-092 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Geneticin G-418 Sulfate | American Bioanalytical | AB05057 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-092 | |
| Fibronectin from human plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Albumin from chicken egg white | Sigma-Aldrich | A5378 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-6 | |
| Carbamoylcholine chloride | Sigma-Aldrich | C4382 | |
| SFLLR-NH2 trifluoroacetate salt | Sigma-Aldrich | S8701 | |
| Finnpipette (5-50 µl) | Thermo Scientific | 4662090 | |
| BIND Scanner System | X-BODY Biosciences | N/A | |
| 384-well TiO2 coated plates | X-BODY Biosciences | TiO-96-CM |
References
- Hille, B. Ion Channels of Excitable Membranes. , Sinauer Associates. (1992).
- Kaczmarek, L. K. Non-conducting functions of voltage-gated ion channels. Nat. Rev. Neurosci. 7, 761-771 (2006).
- Levitan, I. B. Signaling protein complexes associated with neuronal ion channels. Nat. Neurosci. 9, 305-310 (2006).
- Shamah, S. M., Cunningham, B. T. Label-free cell-based assays using photonic crystal optical biosensors. Analyst. 136, 1090-1102 (2011).
- Cunningham, B. T., Laing, L. M. icroplate-based label-free detection of biomolecular interactions: applications in proteomics. Expert Rev. Proteomics. 3, 271-281 (2006).
- Peters, M. F., Vaillancourt, F., Heroux, M., Valiquette, M., Scott, C. W. Comparing label-free biosensors for pharmacological screening with cell-based functional assays. Assay Drug Dev. 8, 219-227 (2010).
- Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing. Biophys. J. 91, 1925-1940 (2006).
- Cunningham, B. T., et al. Label-free assays on the BIND system. J. Biomol. Screen. 9, 481-490 (2004).
- Hessel, A. aO., A, A. A New Theory of Wood's Anomalies on Optical Gratings. Appl. Optics. 4, 1275-1297 (1965).
- Cunningham, B. T., Laing, L. G. Advantages and application of label-free detection assays in drug screening. Expert Opin. Drug Discov. 3, 891-901 (2008).
- Lee, P. H. Label-free optical biosensor: a tool for G protein-coupled receptors pharmacology profiling and inverse agonists identification. J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 146-153 (2009).
- Bhattacharjee, A., Kaczmarek, L. K. For K+ channels, Na+ is the new Ca2. Trends Neurosci. 28, 422-428 (2005).
- Santi, C. M., et al. Opposite regulation of Slick and Slack K+ channels by neuromodulators. J. Neurosci. 26, 5059-5068 (2006).
- Yang, B., Desai, R., Kaczmarek, L. K. Slack and Slick K(Na) channels regulate the accuracy of timing of auditory neurons. J. Neurosci. 27, 2617-2627 (2007).
- Brown, M. R., et al. Fragile X mental retardation protein controls gating of the sodium-activated potassium channel. 13, 819-821 (2010).
- Zhang, Y., et al. Regulation of neuronal excitability by interaction of fragile X mental retardation protein with slack potassium channels. J. Neurosci. 32, 15318-15327 (2012).
- Barcia, G., et al. De novo gain-of-function KCNT1 channel mutations cause malignant migrating partial seizures of infancy. Nat. Genet. 44, 1255-1259 (2012).
- Fleming, M. R., Kaczmarek, L. K. Use of optical biosensors to detect modulation of Slack potassium channels by G protein-coupled receptors. J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 173-181 (2009).
- Nelson, C. D., et al. Targeting of diacylglycerol degradation to M1 muscarinic receptors by beta-arrestins. Science. 315, 663-666 (2007).
- Zhang, J. H. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Gribbon, P., et al. Evaluating real-life high-throughput screening data. J. Biomol. Screen. 10, 99-107 (2005).
