Summary
Optiska biosensortekniker kan detektera ändringar i massa nära plasmamembranet i levande celler och tillåta en att följa cellulära svar i både enskilda cellerna och populationer av celler. Detta protokoll kommer att beskriva detektion av den modulering av kaliumkanaler av G-proteinkopplade receptorer i intakta celler med användning av detta tillvägagångssätt.
Abstract
Jonkanaler styra de elektriska egenskaperna hos nervceller och andra exciterbara celltyper genom att selektivt låta joner flöda genom plasmamembranet 1. För att reglera neuronala retbarhet är de biofysiska egenskaper jonkanaler modifieras av signalproteiner och molekyler, som ofta binder till kanalerna själva för att bilda en hete kanal komplex 2,3. Traditionella analyser som undersöker samspelet mellan kanaler och regulatoriska proteiner kräver exogena etiketter som potentiellt kan förändra proteinets beteende och minska den fysiologiska betydelsen av målet, samtidigt som den ger lite information om tidsförloppet av interaktioner i levande celler. Optiska biosensorer, till exempel X-BODY Biosciences BIND Scanner systemet, använd en ny etikett-fri teknik, resonans våglängd galler (RWG) optiska biosensorer, för att upptäcka förändringar i resonans reflekterat ljus nära biosensor. Denna analys möjliggör detektion av den relativaförändring i massa inom den nedre delen av levande celler adherenta till biosensorytan till följd av ligand-inducerade förändringar i cellvidhäftning och spridning, toxicitet, proliferation, och förändringar i protein-proteininteraktioner nära plasmamembranet. RWG optiska biosensorer har använts för att detektera förändringar i massan nära plasmamembranet av celler efter aktivering av G-proteinkopplade receptorer (GPCR), receptortyrosinkinaser och andra cellytreceptorer. Ligand-inducerade förändringar i jonkanal-proteininteraktioner kan också studeras med användning av denna analys. I detta dokument kommer vi att beskriva den experimentella proceduren användes för att detektera moduleringen av Slak B natrium aktiverade kalium (K Na) kanaler från GPCR.
Introduction
Undersöka levande celler i sin fysiologiskt relevant sammanhang är avgörande för att förstå de biologiska funktionerna hos cellulära mål. Men analyser som undersöker samspelet mellan kanaler och regulatoriska cytoplasmaproteiner såsom coimmunoprecipitation analyser, vanligtvis ger lite information om tidsförloppet av interaktioner i levande celler. Majoriteten av nuvarande cellbaserade analyser mäta en specifik cellulär händelse, såsom translokation av ett fluorescensmärkta proteinet av intresse. Dessa analyser kräver modifieringar av de proteiner av intresse, vilka potentiellt kan förändra proteinets beteende och minskar den fysiologiska relevansen av målet. Noninvasive cellbaserade analyser, vilka inte kräver manipulation av systemet, ger en kontinuerlig mätning av cellulär aktivitet och tillåter studier av celler i deras mest fysiologiskt relevant tillstånd 4.
Optiska biosensorer är utformade för att produceraen mätbar förändring i en egenskap hos det ljus, som är kopplad till sensorytan. Optiska biosensorer som använder flyktiga vågor, som inkluderar ytplasmonresonans (SPR) och resonansvåglängd galler (RWG) tekniker, har i första hand används för att upptäcka de tillhörighet och kinetik av molekyler som binder till sina biologiska receptorer immobiliserade på sensorytan. Mer nyligen har kommersiellt tillgängliga RWG biosensorer utvecklats för att tillåta detektering av den relativa förändringen av massan i den nedre delen av celler vidhäftande till sensorytan vid hög rumslig upplösning (upp till 3,75 ^ m / pixel) 5. Dessa biosensorer kan detektera förändringar i massa nära plasmamembranet hos levande celler, som resulterar från stimulering, såsom celladhesion och spridning, toxicitet, proliferation och signalvägar som framkallas av en mängd olika cellytereceptorer inklusive G-proteinkopplade receptorer (GPCR) 6 . RWG biosensorer detekterar den relativa chanGE i brytningsindexet som en funktion av den relativa förändringen av massan inom 150 nm från biosensorn 7. När celler stryks på biosensor, denna förändring i brytningsindex återspeglar förändringen i massa nära plasmamembranet av cellen till följd av en förändring i cellulär vidhäftning till biosensorn. Detta protokoll kommer att diskutera upptäckten av kanal-proteininteraktioner med hjälp RWG biosensorer.
RWG datainsamlingssystem består av flera komponenter. Eftersom X-BODY Biosciences BIND Scanner användes för dessa experiment kommer vi att hänvisa till komponenterna för detta särskilda system, som består av en plattläsare, associerade biosensorer, BIND Scan förvärv programvara och BIND View analysprogram 8. De fotoniska kristaller i biosensorer, som nedan kallas optiska biosensorer, är sammansatta av ett periodiskt arrangemang av ett dielektriskt och material i två eller tre dimensioner, vilket förhindrar spridning av ljus vid specifikavåglängder och riktningar. Fotoniska kristallstrukturer är baserade på ett fenomen som kallas Woods anomali. Först upptäcktes av Wood i 1902, är dessa anomalier är effekter som observeras i spektrumet för ljus som reflekteras av optiska diffraktionsgitter där snabba variationer i intensiteten hos särskilda diffraktionsordningar uppstår i vissa smala frekvensband. År 1962, Hessel och Oliner presenterade en ny teori om Woods avvikelser där ändlig period galler genererar en stående resonansvåglängd 9. I de optiska biosensorer som beskrivs här, är Woods avvikelser används för att producera en RWG biosensor som när de stimuleras med vitt ljus reflekterar bara väldigt smalt band av våglängder (vanligtvis mellan 850-855 nm).
Enskilda biosensorer bestå av en låg brytningsindex plastmaterial med en periodisk ytstruktur som är belagd med ett tunt skikt av det höga brytnings dielektriskt material titandioxid (TiO 2). När BIOSENSeller är upplyst med en bred våglängds ljuskälla, det optiska gittret av fotoniska kristaller reflekterar ett smalt spektrum av våglängder av ljus som mäts med en spektrofotometer i BIND Scanner. Den toppintensiteten hos de reflekterade våglängder (Toppvåglängd Standard eller PWV) beräknas sedan från signalen. The PWV på ljuset går på en förändring i brytningsindex som ett resultat av en ökning eller minskning av massan inom närhet (~ 150 nm) av den biosensorytan. Optiska biosensorer är införlivade i en standard Society for Biomolecular Sciences (SBS) 384-brunnars mikroplatta för de analyser som användes i dessa experiment.
RWV biosensorer används för att detektera förändringar vid tillsats av exogena signaler i levande celler 10. Celler direkt odlas på ytan av en RWG biosensor och förändringen i det lokala brytningsindex övervakas vid behandling med specifika stimuli. Riktningen av förändring i massa vid biosensorn kan varabestämmas, eftersom en ökning av det lokala brytningsindex är resultatet av en ökning av massan i närheten av biosensorn och mäts som en ökning av PWV. Omvänt en minskning i massa ger en minskning av PWV. Förändringen av detekterade PWV kan bero på många cellulära händelser, inklusive förändring i cell adhesion, protein rekrytering / release, endocytos och återvinning, exocytos, apoptos, och cytoskeletal ombildning. Till exempel kan analysen detektera förändringar i kanal-proteininteraktioner mellan kaliumkanaler och andra cytoplasmiska eller cytoskelettala komponenter. Händelsen måste emellertid ske inom de ~ 150 nm detekteringszon nära biosensorn, och i fallet med en ansluten cell, nära plasmamembranet. Förvärv av cellulära svar sker med BIND Scan-programvara och en bildrepresentation av var och en av 384 brunnar i SBS plattan alstras. Detta system har en upplösning på upp till 3,75 um / pixel, vilket möjliggör detektion av händelser i enskilda celler, ochkan användas antingen med cellinjer (såsom HEK293-eller CHO-celler,) eller med flera fysiologiskt relevanta primära celler. Bildanalys med BIND View programvara gör det möjligt att upptäcka cellulära svar på både individ-och populationer av celler. Eftersom de biosensorer införlivas i standard SBS 384-brunnars mikroplattor, är systemet lätt kan anpassas till högeffektiv screening (HTS).
Resonans-våglängd trall optiska biosensorer har tidigare använts för att upptäcka förändringar i massa nära plasmamembranet av celler efter aktiveringen av GPCR 11. Vårt laboratorium har klonat två natrium-aktiverad (K Na) kaliumkanaler, Slack-B och Slick 12. Aktiviteten för båda Slak B och slick kanaler har visat sig vara mycket starkt påverkas av direkt aktivering av proteinkinas C (PKC) 13. Aktivering av Ga q proteinkopplade receptorer, såsom M1 muskarinreceptor och mGluR1 metabotropa glutamat receptor, reglerar potent kanal aktivitet genom PKC aktivering. Dessa K Na-kanaler bidrar till neuronal anpassning under ihållande stimulans och reglera noggrannheten i timingen av aktionspotentialer 14. Bromskanaler är kända för att interagera med en mängd olika cytoplasmiska signalmolekyler, inklusive FMRP den fragil X utvecklingsstörning protein 15,16. Mutationer i Slack resultat i flera Migrera partiella anfall hos spädbarn (MMPSI), en tidig debut av epilepsi, som resulterar i svår utvecklingsförsening 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cell Culture (Anpassad från Fleming och Kaczmarek 18)
- Kultur celler i lämpliga medier för mer än 2 men mindre än 10 passager innan de används i denna analys. Icke-transfekterade HEK-293-celler och HEK-293-celler som stabilt uttrycker rått-Slak B-protein odlas i ett halv Dulbeccos modifierade Eagles medium och en halv Leibovitz L-15-medium kompletterat med 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum och antibiotika. 500 | ig / ml geneticin (G418) sätts till HEK-293-celler som stabilt uttrycker slack-B för att selektera för expression av den slack kanal. Passage celler vid 70-90% sammanflödet genom dissociation av rätter med en 0,25% trypsin-EDTA-lösning.
2. Extracellulär matrix (ECM) Beläggning av TiO 2 384-väl optisk Biosensor Platta med fibronektin och Ovalbumin
- Beredning av fibronektin ECM blandningen och ovalbumin blockeringslösning
- Bered en arbetslösning av fibronectin i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med en slutkoncentration av 5 | ig / ml fibronektin i 20,0 ml PBS. Från en 1,0 mg / ml förrådskoncentration, tillsätt 100 | il till 20,0 ml PBS under en 200-faldig utspädning. Brukslösningen av fibronektin kan alikvoter och lagrades vid -20 ° C efter beredning.
- Bered en 5% förrådslösning av värmeinaktiverat ovalbumin i sterilt vatten. Späd ovalbumin i steril vävnadskulturgrad vatten för en 5%-ig lösning och värmeinaktivering i 30 min vid 60 ° C. Kyl lösningen till rumstemperatur och steril filtrering av lösningen. Alikvotera 5% ovalbumin-lösning och förvara vid 4 ° C.
- Bered en 2% arbetslösning av ovalbumin genom att späda 5% stamlösning i PBS. Till exempel lägga till 12,0 ml av 5% ovalbumin stamlösning till 18,0 ml PBS till en slutlig volym av 30,0 ml.
- 384-väl optisk biosensor platta beläggning
- Fukta TiO 2 platta med 20,0 l / brunnsterilt vävnadskulturgrad vatten i 15 min. Följande steg skall utföras med en 16-kanals pipett.
- Tvätta plattan 1 x med 50,0 pl PBS per brunn.
- Lägg 20,0 ul av fibronektin arbetslösning till varje brunn och inkubera i 2 h vid rumstemperatur för att skapa ECM.
- Tvätta plattan 1 x med 50,0 pl PBS per brunn.
- Lägg 40,0 ul av ovalbumin arbetslösning till varje brunn och inkubera över natten vid 4 ° C för att blockera plattan.
- Tvätta plattan 3 x med 50,0 pl PBS per brunn. ECM-belagda plattorna kan lagras vid 4 ° C i upp till 48 timmar.
3. Sådd av celler på 384-brunnars optisk biosensor Plate
- Avlägsna tillväxtmedium från cellerna och lägga till trypsin för att lossa cellerna från plattan. Samla cellerna och centrifugera vid 1000 xg under 1 min. Avlägsna de trypsinliknande media och återsuspendera cellerna i tillväxtmediet.
- Med användning av en hemocytometer eller en automatiseradcellräknare, bestämma koncentrationen av cellerna.
- För att minimera effekterna av avdunstning under inkubation kommer 50,0 | il av tillväxtmedium per brunn användas. Celler bör spädas för att uppnå det önskade antalet celler per brunn i en volym av 50,0 | il av tillväxtmedium. För dessa experiment var 1000 celler / brunn ströks ut på biosensorn.
- Låt de ympade cellerna att inkubera över natten i tillväxtmedium vid 37 ° C under luft / 5% CO2.
4. Beredning av Biosensors och Sammansatta Plattor för RWG Optiska Biosensor analys
- Avlägsna plattan från kuvösen och ta bort tillväxtmedier från cellerna. Tvätta cellerna 1 x med Hanks balanserade saltlösning (HBSS). Lägg till 25,0 l av HBSS till varje brunn.
- Placera biosensor plattan på BIND skanner och låta cellerna komma i jämvikt till rumstemperatur under 1-2 timmar.
- Förbered en separat förening platta som ligander av intresse kommer att vara added på biosensorplattan under analysen. För dessa analyser, var 25,0 ^ il av lösningen innehållande föreningen tillsätts till varje brunn på biosensorplatta för en total volym av 50,0 | il. Som sådana har föreningarna i lösning framställd i 2 x den önskade slutkoncentrationen.
5. Utför RWG Optiska Biosensor analys
- Ta en nollmätning med skannersystemet för brunnar A1-P12 (hälften av SBS 384-brunnar) med en maximal upplösning på 3,75 um / pixel för central 1,5 mm för varje brunn med hjälp av programvaran BIND Scan. Denna baslinje scan kommer att ta cirka 30 minuter.
- Lägg till 25,0 l av de sammansatta lösningar till varje brunn för brunnar A1-P12.
- Ta ett utgångsvärde på brunnar A13-P24.
- Lägg till 25,0 l av de sammansatta lösningar till varje brunn för brunnar A13-P24.
- Ta ett inlägg förening tillägg mätning för brunnar A1-P12, och upprepa för brunnar A13-P24.
6. ETTNALYS av analysdata med BIND View
- Öppna BIND analysuppgifter för den beräknade referensnivån i Windows, och klicka på knappen "Grid Editor" för att aktivera val cell. Mjukvaran beräknar metrics av intresse som definieras av användaren.
- Öppna "Plug-ins", som omfattar "Cell Finder" och "Baseliner"-funktion. Ställ in parametrarna i "Cell Finder" så att celler kan skiljas från bakgrunden av biosensor.
- Exportera cell map-fil som innehåller de "Cell Finder" data för mätning baslinjen.
- Upprepa steg från 6,1 till 6,2 för post förening additionsuppgifter.
- Öppna "Baseliner" plug-in och importera cellkartan från baslinjemätningen. Programmet kommer att beräkna förskjutningen i PWV mellan uppgifterna bakgrunden och efter sammansatta.
- Välj "Δ Cell Mean" för utsignalen från medelvärdesdifferens i PWV för celler. Uppgifterna kan sedan exporteras till Microsoft Excel för vidare analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Slak B stabilt transfekterade HEK-293-celler och styr otransfekterade HEK-293-celler såddes med 1000 celler / brunn på 384-brunn, ECM belagd RWG biosensor plattor. Bilder från den centrala 1,5 mm 2 i biosensor registrerades med en upplösning på 3,75 um / pixel (Figur 1). Densitet toningskartor massgenererades före och 30 minuter efter förening tillägg med programvaran BIND Scan. BIND View mjukvara användes för att bestämma förskjutningen i PWV på GPCR-agonist tillägg genom att subtrahera PWV post förening tillägg från baslinjen PWV.
Den endogena M1 muskarinreceptor agonist carbamoylcholine klorid (karbakol) 19 anbringades på båda otransfekterade kontroll HEK-293-och rått Slak B stabilt uttryckande HEK-293-celler resulterade i en positiv ökning av PWV (Figur 2A). Mätningar gjordes vid 30 min och signaler normaliserades till endast buffert (HBSS) additividare. Jämfört med kontrollceller, de Slack-B-transfekterade celler hade en större ökning av toppskifte i PWV. SFLLR-NH 2 trifluoracetatsalt (SFLLR), en N-terminal TRAP pentapeptid som uppvisar agonistaktivitet mot den endogena GPCR proteaset aktiverad receptor 1 (PAR1), visade också differential svar i otransfekterade och Slak B-transfekterade celler (Figur 2B). Dessa resultat visar att förekomsten av Slack-B-kanal den ökar väsentligt skifte i PWV som sker vid aktivering av endogena GPCR i HEK-celler, och visa att det är möjligt att använda denna analys för att studera kanal-proteininteraktioner.
Figur 1. Analys av cellulära svaren i BIND View. Representativa bilder av BINDScanner d ata för Slack-B stabilt transfekterade HEK-293 celler A) före och B) efter bildanalys med BIND View programvara "Cell Finder" plug-in. Trösklar ades manuellt utnyttja "Cell Finder" plug-in för att identifiera celler från bakgrunden. B) Områden som visas i rött i representerar pixlar som identifieras som tillhörande celler och gula linjer skilja celler från den grå plattan bakgrunden. C) Förskjutningen i PWV för celler vid SFLLR Dessutom visas med en färgtoning, där rött står för en positiv förändring i PWV och blått representerar ingen förändring. Skalan stapel representerar 100 ìm. Klicka här för att visa en större bild .
00px "/>
Figur 2. Uttryck av Slack-B förändrar förskjutning i PWV efter aktivering av GPCRs. A) Den M1 muskarin receptoragonist karbakol (500 M) producerade en förskjutning i PWV som är större i amplitud i Slack-B-transfekterade celler än kontroll HEK-293 celler ( P <0,0001, N = 16 brunnar / tillstånd). B) Applicering av SFLLR (10 pM), en N-terminal TRAP pentapeptid som uppvisar agonistaktivitet mot GPCR endogena proteaset aktiverad receptor 1 (PAR1), producerade en förändring i PWV respons som är större i amplitud i Slak B-transfekterade celler än i kontroll HEK-293-celler (p <0,0001, N = 16 brunnar / tillstånd). Mätningar registrerades 30 minuter efter förening dessutom och ligand svar normaliserades att buffra bara kontroll. Felstaplar är ± SEM. Klicka här för att visa en större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Z-prime (Z ') faktorn är en vanlig statistisk metod för att kvantifiera kvaliteten på en höghastighets-screening assay 20, och eftersom screening av GPCR-agonister i denna analys skedde i en SBS-kompatibel 384-well assay ger en utmärkt mått på robusthet och giltigheten i denna analys 21. AZ-värde på 1 anger en teoretiskt idealisk analys med ett oändligt antal datapunkter med icke existerande standardavvikelser. AZ-värde på mellan 0,5-1 anses vara en utmärkt analys för high-throughput screening, med under 0,5 anses vara ett marginellt informativ analys. För denna uppsättning data, är den beräknade Z "värde använder karbakol en SFLLR som positiva kontroller 0,79 och 0,81, vilket indikerar denna analys är mycket robust och de erhållna resultaten är av stor betydelse.
Extracellulärmatrix beläggning av 384 brunnar optisk biosensorplatta, cellsådd, och föreningen dessutomi dessa experiment genomfördes manuellt med en 16-kanals Finnpipette (5-50 ^ il). Eftersom denna analys utförs på en SBS-platta, kan mer avancerade robotsystem för hantering av flytande användas i high throughput screening. Men vid anpassningen av systemen för flytande instrumenthantering, försiktighet bör iakttas för att säkerställa att pipettspetsar inte röra biosensorytan eftersom detta kommer att orsaka skador på biosensor.
När tillsats av föreningar lösta i DMSO, måste analysen utföras så att den slutliga koncentrationen av DMSO i analysmedia hålles konstant för att undvika en förskjutning av PWV grund DMSO toxicitet för cellen ("DMSO chock"). Trots att olika cellinjer är differentiellt reagerar för DMSO i denna analys, rekommenderar vi att den slutliga koncentrationen av DMSO inte överskrider 0,1 till 0,2 volym%. Celler bör inkuberas i den slutliga koncentrationen av DMSO i analysbuffert under temperaturjämvikt steget i detta protokoll för att undvika solvent-inducerade förändringar i PWV.
Ett brett urval av celler, inklusive primära celler, kan studeras med denna analys, även om optimering av analysen för varje cellinje måste utföras. Vid användning av olika celltyper, ska ske en optimering av antalet celler och extracellulära matrixbiosensor ytbeläggningar. Celler bör ympas vid olika densiteter mellan 1,000-15,000 celler / brunn och behandlas med en känd receptoragonist för att bestämma vilken densitet ger den högsta Z '. Olika ECM ytbeläggningar, inklusive men inte begränsat till fibronektin, kollagen och laminin, antingen ensamma eller i kombination, bör testas för att säkerställa att cellerna förblir anhängare till biosensor under analysen. Cell svält (avsaknad av serum) kan påverka cellulär respons vid denna analys, och som sådana experiment kan utföras i serumfritt och seruminnehållande medium för initiala analysen optimering ändamål. Den höga upplösningen på BIND Scanner etikett gratisupptäckt möjliggör mätningar svars kvantifieras vid låg celltäthet, eftersom analysen av cellulära svar kan begränsas till endast de pixlar som kontaktats av celler. Dessutom kan underpopulationer av celler i en heterogen blandning grindas baserat på flera parametrar (inklusive storlek och styrka av cellvidhäftning) och mättes med avseende individuella cellulära svar. Sammantaget ger dessa funktioner gör BIND Scanner idealisk för analyser som involverar primära odlade celler.
BIND Scanner systemet tillåter mätningar som ska vidtas under en angiven tid-kurs, och kan därför spelas in time-lapse mätningar av förändringar i PWV. Detta är särskilt användbart för att mäta förändringar i cellens beteende som sker över längre tidsperioder än de som beror på kanal-proteininteraktioner, inklusive celltillväxt, celldelning och cellmigration. BIND View mjukvara möjliggör analys av sådana cellulära svar, och kan kvantifiera många parameters av förändringar i cellstrukturen, bland annat förändringar i cell följsamhet, förändringar i cellvolymen, och förändringar i cellrörelse, som medger både kvantitativ analys och time-lapse avbildning av dessa händelser. Till exempel kan systemet användas för att bestämma den takt som fibroblaster svarar på tillväxtfaktor signalering genom att spåra graden av cellmigration över en enskild brunn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Steven M. Shamah är anställd i X-BODY Biosciences.
Acknowledgments
Författarna är tacksamma till Dr Yangyang Yan i laboratoriet av Dr Fred Sigworth vid Yale University för den generösa donationen av HEK293 celler som stabilt uttrycker råtta Slack-B-protein. Dessutom författarna är tacksamma till Dr Sigworth för kryo-elektronmikroskopi homologimodell av Slack visas i videon införa. Fick Denna forskning stöds av NIH bidrag DH067517 och NS073943 till LKK
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM, High Glucose | Life Technologies | 11965-092 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Geneticin G-418 Sulfate | American Bioanalytical | AB05057 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-092 | |
| Fibronectin from human plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Albumin from chicken egg white | Sigma-Aldrich | A5378 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-6 | |
| Carbamoylcholine chloride | Sigma-Aldrich | C4382 | |
| SFLLR-NH2 trifluoroacetate salt | Sigma-Aldrich | S8701 | |
| Finnpipette (5-50 µl) | Thermo Scientific | 4662090 | |
| BIND Scanner System | X-BODY Biosciences | N/A | |
| 384-well TiO2 coated plates | X-BODY Biosciences | TiO-96-CM |
References
- Hille, B. Ion Channels of Excitable Membranes. , Sinauer Associates. (1992).
- Kaczmarek, L. K. Non-conducting functions of voltage-gated ion channels. Nat. Rev. Neurosci. 7, 761-771 (2006).
- Levitan, I. B. Signaling protein complexes associated with neuronal ion channels. Nat. Neurosci. 9, 305-310 (2006).
- Shamah, S. M., Cunningham, B. T. Label-free cell-based assays using photonic crystal optical biosensors. Analyst. 136, 1090-1102 (2011).
- Cunningham, B. T., Laing, L. M. icroplate-based label-free detection of biomolecular interactions: applications in proteomics. Expert Rev. Proteomics. 3, 271-281 (2006).
- Peters, M. F., Vaillancourt, F., Heroux, M., Valiquette, M., Scott, C. W. Comparing label-free biosensors for pharmacological screening with cell-based functional assays. Assay Drug Dev. 8, 219-227 (2010).
- Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing. Biophys. J. 91, 1925-1940 (2006).
- Cunningham, B. T., et al. Label-free assays on the BIND system. J. Biomol. Screen. 9, 481-490 (2004).
- Hessel, A. aO., A, A. A New Theory of Wood's Anomalies on Optical Gratings. Appl. Optics. 4, 1275-1297 (1965).
- Cunningham, B. T., Laing, L. G. Advantages and application of label-free detection assays in drug screening. Expert Opin. Drug Discov. 3, 891-901 (2008).
- Lee, P. H. Label-free optical biosensor: a tool for G protein-coupled receptors pharmacology profiling and inverse agonists identification. J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 146-153 (2009).
- Bhattacharjee, A., Kaczmarek, L. K. For K+ channels, Na+ is the new Ca2. Trends Neurosci. 28, 422-428 (2005).
- Santi, C. M., et al. Opposite regulation of Slick and Slack K+ channels by neuromodulators. J. Neurosci. 26, 5059-5068 (2006).
- Yang, B., Desai, R., Kaczmarek, L. K. Slack and Slick K(Na) channels regulate the accuracy of timing of auditory neurons. J. Neurosci. 27, 2617-2627 (2007).
- Brown, M. R., et al. Fragile X mental retardation protein controls gating of the sodium-activated potassium channel. 13, 819-821 (2010).
- Zhang, Y., et al. Regulation of neuronal excitability by interaction of fragile X mental retardation protein with slack potassium channels. J. Neurosci. 32, 15318-15327 (2012).
- Barcia, G., et al. De novo gain-of-function KCNT1 channel mutations cause malignant migrating partial seizures of infancy. Nat. Genet. 44, 1255-1259 (2012).
- Fleming, M. R., Kaczmarek, L. K. Use of optical biosensors to detect modulation of Slack potassium channels by G protein-coupled receptors. J. Recept. Signal Transduct. Res. 29, 173-181 (2009).
- Nelson, C. D., et al. Targeting of diacylglycerol degradation to M1 muscarinic receptors by beta-arrestins. Science. 315, 663-666 (2007).
- Zhang, J. H. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Gribbon, P., et al. Evaluating real-life high-throughput screening data. J. Biomol. Screen. 10, 99-107 (2005).
