Abstract
Protokoller til frembringelse populationer af cardiomyocytter fra pluripotente stamceller er blevet udviklet, men disse giver i almindelighed celler i blandede fænotyper. Forskere interesseret i at forfølge undersøgelser med specifikke myocyt undertyper kræver en mere rettet differentiering tilgang. Ved at behandle mus embryonale stamceller (ES-celler) med Grem2, et udskilt BMP-antagonist, der er nødvendig for atriekammer dannelse in vivo, kan genereres et stort antal hjerteceller med en atrial fænotype. Anvendelse af det konstruerede Myh6-dsRed-Nuc pluripotente stamcelle linje muliggør identifikation, udvælgelse og oprensning af cardiomyocytter. I denne protokol embryoide legemer genereres fra Myh6-dsRed-Nuc celler ved hjælp af den hængende dråbe metoden og holdes i suspension indtil differentiering dag 4 (d4). Ved d4 celler behandles med Grem2 og udpladet på gelatineovertrukne plader. Mellem d8-D10 store ordregivende områder er observeret i de kulturer, og fortsætte med at ekspandere og mstemet gennem d14. Molekylær, histologiske og electrophysiogical analyser indikerer celler i Grem2-behandlede celler erhverver atrial-lignende egenskaber tilvejebringer en in vitro-model til at studere biologi atrielle cardiomyocytter og deres reaktion på forskellige farmakologiske midler.
Introduction
Pluripotente stamceller er et kraftfuldt værktøj til at generere og studere celler fra et væld af svært tilgængelige væv for grundforskning og prækliniske studier, især hos mennesker 1-5. Korrekt modulering af udviklingsmæssige signalveje kan dirigere differentiering af pluripotente stamceller til den ønskede fænotypiske skæbne. Mange protokoller er blevet udviklet til at generere cardiomyocytter (CMS) fra pluripotente stamceller 6-14. Disse protokoller generelt involverer modulering af TFGβ superfamilien (Activin, BMP, og TGFp) og Wnt veje gennem timet tilsætning af exogene vækstfaktorer og / eller små molekyler 10,12-15. Disse protokoller er generelt effektive til at øge procentdelen af celler, der bliver CMS men mangler specificitet, frembringelse af en blandet population af celler, der repræsenterer atrial, ventrikulær og nodal / ledningssystem afstamninger. For at studere specifikke hjertefunktion undertyper en mere rettet differentiering releACH er påkrævet.
Gremlin2 (Grem2, også kaldet Protein Relateret til Dan og Cerberus eller PRDC for korte) er en udskilt BMP-antagonist, der er nødvendig for korrekt hjerte-differentiering og atriekammer dannelse under hjerte-udvikling i zebrafisk 16. Behandling differentierende embryonale stamceller med Grem2 på differentiering dag 4, lige efter peak udtryk for mesodermale markører T-Brachyury og Cerberus ligesom en, øger udbyttet af CMS og genererer en pulje af celler overvejende af atrial afstamning 14.
Rekombinant Grem2 anvendes til behandling af de differentierende celler og kan fremstilles ved anvendelse af standard protein produktionsteknikker 17 eller kan købes kommercielt. Det er meget opløseligt i vandige opløsninger og kan tilsættes eksogent til kulturer på det ønskede tidspunkt.
Differentiering kan spores ved hjælp af RT-qPCR at kvantificere ekspressionen af markører repræsentantaf cardiovaskulære progenitorer, hjerteglykosider progenitorer og engageret CMS. Immunofluorescens kan også anvendes til at identificere og visualisere rumlige fordeling af kardiale celletyper.
Applikationer, der kræver rene populationer er lettere udføres ved brug af et reporter-system til at identificere og isolere CMS. Til dette formål har vi indført αMHC-DsRedNuc konstruere i musen CGR8 ES cellelinje 14. CGR8 celler vokser og forbliver pluripotente uden fødeceller, lette ekspansion og differentieringsfaktorer assays 18. ES-cellelinien indeholder en dsRed fluorescerende protein-kodende sekvens med et kernelokaliseringssignal under hjertets-specifikt a Myosin tung kæde (a Mhc eller Myh6) genpromotor. Ved hjælp af disse celler, kan CM let identificeres og isoleres til kvantificering, cellesortering, elektrofysiologi, lægemiddelscreeninger, og studere mekanismer for atrial differentiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af celledyrkningsmedier, opløsninger og reagenser.
- Forbered 500 ml Mouse embryonale stamceller (Mesc) medier ved blanding og steril filtrering (0,2 um porestørrelse) 445 ml Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM), 50 ml varmeinaktiveret kalvefosterserum (FBS), 5 ml 100X koncentreret L- glutamin udskiftning, 5 pi rekombinant muse leukæmi inhibitorisk faktor (LIF) ved 1 x 10 7 enheder pr ml og 1,43 pi ß-mercaptoethanol (slutkoncentration er 50 uM). Opbevar ved 4 ˚C indtil den er klar til brug.
- Forbered 500 ml embryoide organ (EB) differentiering medier ved blanding og steril filtrering 391 ml Iscoves modificerede Dulbecco medium (IMDM), 100 ml varmeinaktiveret FBS, 5 ml 100X koncentreret L-Glutamin udskiftning, 5 ml 100X koncentreret Ikke-essentielle aminosyrer (NEAA), og 2,86 pi ß-mercaptoethanol (slutkoncentration 100 uM). Opbevares ved 4˚ C, indtil klar til brug.
- Forbered 0,2% w/ v opløsning af Gelatine ved at blande 1 g svinehud gelatinepulver med 500 ml filtreret destilleret H2O Der steriliseres i autoklave. Bemærk, at gelatinen kan være delvis opløselig i vand ved stuetemperatur. Efter autoklavering af gelatine bør helt opløst. Opbevar ved RT indtil den er klar til brug.
- Forbered Grem2 rekombinant protein alikvoter ved at opløse 50 ug pellet lyofiliseret Grem2 i 100 pi phosphatpufret saltvand (PBS) suppleret med 0,1% BSA for at gøre en 0,5 pg / pl stamopløsning. Portion 20 pi af denne stamopløsning i fem sterile 1,5 ml centrifugerør og opbevares ved -80˚ C, indtil klar til brug.
- Forbered PBS ifølge offentliggjorte protokoller eller køb som en 10X lager og fortyndes 1:10 med filtreret, destilleret H2O at lave en 1X arbejder fortynding 19. Sterilisere PBS ved autoklavering før anvendelse. Opbevar ved RT indtil den er klar til brug. I nogle trin, DPBS uden Ca2 + og Mg2 + anvendes. Dette er purchased som en 1X opløsning. Bestilling oplysninger er indeholdt i tabellen af reagenser.
2. Fremstilling af gelatineovertrukne 10 cm vævskulturskåle
- I en steriliseret vævskultur hætte tilsættes 5 ml 0,2% gelatine-opløsning til hver 10 cm vævskulturskål til belægning. Placer retter i inkubator ved 37 C i mindst 30 minutter eller op til 4 dage.
3. Fremstilling af gelatineovertrukne 6-brønds vævskulturplader
- I en steriliseret vævskultur hætte tilsættes 1 ml 0,2% gelatine til hver brønd i en 6-brønds vævskulturplade. Place plader i inkubator ved 37 C i mindst 30 minutter eller op til 4 dage.
4. embryonale stamceller Culture
- optøning mESCs
- Forbered Mesc medier ved opvarmning til RT i en steriliseret vævskultur hætte. Der tilsættes 10 ml RT medier til en gelatine-coatede 10 cm skål.
- Fjern 1 hætteglas mESCs indeholder ca. 1 x 10 6 celler fracryostorage. Holding kryoglas med tænger, sted i en 37 C vandbad. bland forsigtigt indtil cellesuspension er tøet og kun en lille iskrystal forbliver i midten af hætteglasset. Tør hætteglas med en engangs fnugfri tørre og sterilisere med 70% EtOH.
- I en steril vævskultur hætte fjerne optøede celler ved hjælp af en P1000 tip fra kryohætteglas og overføre til 10 cm skål udarbejdet i 4.1.1).
- Placer 10 cm skål i 37 ˚C befugtet cellekultur inkubator med 5% CO2 og jævnt celler ved forsigtigt at bevæge pladen for til bag, for derefter side til side. Tillad celler til at vedhæfte til tallerken O / N eller mindst 6 timer.
- Første ting næste morgen kontrol celler til fastgørelse ved hjælp af et lyst felt mikroskop. Nogle cellerester og døde celler vil blive observeret i medierne. Dette er normalt. Aspirer medier fra fade og erstatte med 10 ml frisk Mesc medier.
- Fortsætte med at ændre medier på celler dagligt for at undgå differentiering.
- Passage celler, når 60-70% sammenflydende. Forbered celler til passage ved sugning medier og skylning med 5 ml steril 1X DPBS uden MgCI2 og CaCI2. Tilsæt 2 ml 0,05% trypsin-EDTA-opløsning. Placer i inkubator ved 37 C i 5 min.
- Mens celler inkubering, forberede nye 10 cm skål ved sugning gelatineopløsning og tilsætning af 10 ml RT Mesc medier. Efter 5 min kontrollere cellerne for løsrivelse. Hvis celler forbliver fastgjort, fortsat at inkubere ved 37 C i 2 min ad gangen, indtil fuldstændigt fritstående.
- Quench trypsin-EDTA ved tilsætning 3 ml Mesc medier. Overførsel cellesuspension til et 15 ml centrifugerør og centrifugering ved 200 xg i 5 min for at pelletere. Aspirer medier fra pillen og re-suspenderes i 10 ml Mesc medier.
- Afhængigt af den ønskede delingsforholdet, tilsættes 0,5-1,0 ml cellesuspension til hver skål fremstillet i trin 4.2.2). Placer fadet i kuvøse og jævnt distribuere celler ved forsigtigt at flytte tilbage til forsiden og derefter side til side. AlleOW celler at vedhæfte O / N eller i mindst 12 timer.
BEMÆRK: Et split-forhold på 1:10 til 1:20 er fælles for de fleste Mesc linjer. Dette forhold kan variere afhængigt af anvendt linje, passage nummer, og ønsket sammenløb på ny skål. For en 1:10 delingsforholdet overføres 1 ml cellesuspension i 9 ml Mesc medier og pladen i en frisk fremstillet gelatineovertrukket 10 cm skål.
5. Udarbejdelse af embryoide Bodies
BEMÆRK: Alle trin undtagen centrifugering udføres i en steril vævskultur hætte.
- Fremstilling af cellesuspension i EB Media
- Ved 70% sammenflydning (normalt 24-48 timer efter passage), bruge cellerne til EB-dannelse. Forbered celler til EB-dannelse ved at afmontere og pelletering efter §§ 4.2.1) - 4.2.3).
Note: (. Fx meget lidt celledød, ingen forurening, ordentlig morfologi) Det er bedst at passage celler mindst én gang efter tø og kontrollere for sundhed og robust vækst (e.g., at populationsfordoblinger forekommer hver 24-48 timer) før brug for at gøre EB'er. - Re-suspendere pellet i 5 ml EB medier. Tæl celler ved hjælp af et hæmocytometer eller automatisk celletæller.
- Fortynd cellesuspension i nødvendige mængde EB medier at foretage en endelig koncentration på 25 celler / pi (eller 2,5 x 10 3 celler / ml). Bemærk, at hver låget på en petriskål indeholde omkring 60 EB'er og kræver omkring 1,3 ml cellesuspension. I dette trin forberedes tilstrækkelig volumen cellesuspension for at generere det ønskede antal EB'er. For eksempel, hvis 240 EB'er er nødvendige for eksperimentet, forberede 5,2 ml ved 2,5 x 10 3 celler / ml.
BEMÆRK: mESCs, der ikke anvendes til EB-dannelse kan bruges til fremtidige eksperimenter ved at dreje ned, re-suspension i Mesc medier og plating som beskrevet i afsnit 4.2.
- Ved 70% sammenflydning (normalt 24-48 timer efter passage), bruge cellerne til EB-dannelse. Forbered celler til EB-dannelse ved at afmontere og pelletering efter §§ 4.2.1) - 4.2.3).
- Oprettelse af embryoide Bodies
- Fremstille sterile 10 cm bakterielle petriskåle til ophæng dråbedannelse ved tilsætning af 2 ml 1X PBS til bunden af each.
- Overfør EB suspension fra trin 5.1) til en steril opløsning bassin.
- Fjern låget på den færdige petriskål og omhyggeligt deponere tres, 20 pi dråber af EB suspensionen på den indre overflade. Opnå dette effektivt ved hjælp af en multi-kanal pipette monteret med 6 tips. Hver 20 pi dråbe har nu 500 celler.
- Forsigtigt erstatte låg på nederste halvdel af den bakterielle petriskål, og pas på ikke at løsne hængende dråber. Placer retter i cellekultur inkubator ved 37˚ C. Efter 2 dage celler er klar til at vaske ned som beskrevet i 5.3).
- Wash-down af embryoide Bodies
Bemærk: Alle vaske-down trin udføres i et sterilt vævskultur hætte.- Efter 2 dage EB s er klar til vask ned og overføre til 6 cm bakterielle petriskåle. Pre-varme 3 ml EB medier pr petriskål til RT. Hver 6 cm bakteriel petriskål effektivt kan holde 2 låg værd af hængende dråber.
Bemærk: Sørg for at bruge en ikke-belagt petriskål feller dette trin (se materialer tabel). Brug ikke en vævskulturskål eller anden overflade, der fremmer celleadhæsion. EB'er bør fortsat være suspenderet i medierne indtil den er klar til at blive forgyldt, som beskrevet i afsnit 6. - Fjern 10 cm petriskåle fra inkubatoren og anbringes i sterile vævskultur hætte. Fjern forsigtigt låget med EB'er og vippe i en 45 graders vinkel.
- Anvendelse af en 5 ml serologisk pipette indeholdende 3 ml RT EB medier, forsigtigt vaske EB'er i en pulje i bunden af låget. Kontrollér omhyggeligt låget for EB, der hænger fast på overfladen og re-skyl om nødvendigt.
- Efter vask alle EB'er overførsel til en 6 cm petriskål.
- Gentag trin 5.3.2) -5.3.4) for alle EB'er. Hver 6 cm petriskål bør indeholde EB'er fra to 10 cm låg. Placer alle retter tilbage i inkubator ved 37 C i to dage mere.
BEMÆRK: EB, der er for tæt sammen i suspension kan holde sammen og danne store aggregater. Dette kan have en negativ indvirkning hjertedifferentiering effektivitetsamt reducere antallet af tilgængelige EB. At forhindre aggregering, bør EB kontrolleres hver dag og adskilt ved forsigtigt at bevæge sig frem og tilbage, for derefter side til side. Brugen af bakterielle retter i de tidlige differentieringsfaktorer trin er nødvendigt at forhindre EB fastgørelse til skålen og tillade EB at vokse i suspension.
- Efter 2 dage EB s er klar til vask ned og overføre til 6 cm bakterielle petriskåle. Pre-varme 3 ml EB medier pr petriskål til RT. Hver 6 cm bakteriel petriskål effektivt kan holde 2 låg værd af hængende dråber.
6. Plating og Behandling af EB'er Med Grem2
- Forbered Grem2 behandling medium ved tilsætning af tilstrækkeligt volumen af lager (0,5 pg / pl) Grem2 til RT EB medium for en slutfortynding på 1-5 ug / ml.
BEMÆRK: Den effektive koncentration til behandling af EB'er varierer afhængigt af cellelinjen og specifik aktivitet af det aktuelle masse Grem2. Det anbefales, at før anvendelse dosis titreres til at finde maksimal effektivitet. For CGR8 Mesc linje, vi rutinemæssigt bruger 3-5 ug / ml Grem2. Effektive koncentrationer af Grem2 for atrial myocyt generation vil producere hurtigt ordregivende celler mellemdag 7-8, som er udbredt i hele hver brønd. Hvis ordregivende fænotype ikke er observeret i behandlede kulturer anbefales det, at Grem2 dosis titreres inden for intervallet angivet. - Forbered 6-brønds vævskulturplader ved sugning gelatineovertræk opløsning fra hver brønd og tilsætte 2 ml RT Grem2 behandling medier. Fjern EB'er fra inkubatoren og anbringes i sterile vævskultur hætte.
- Ved hjælp af en P1000 sat til 100 pi overføre 30 EB'er fra 6 cm petriskåle til hver brønd. Place EB'er i inkubator og jævnt dispergere ved forsigtigt at bevæge pladen tilbage til forsiden derefter side til side.
- Efter EB har knyttet til gelatine brønde, erstatte Grem2 medier hver anden dag indtil dag 10. Efter dag 10, afbryde Grem2 behandling og tilføje frisk EB medier hver to dage for at opretholde sunde celler.
BEMÆRK: Efter fastgørelse vil EB'er flade ud langs overfladen af den overtrukne plade.
- Efter EB har knyttet til gelatine brønde, erstatte Grem2 medier hver anden dag indtil dag 10. Efter dag 10, afbryde Grem2 behandling og tilføje frisk EB medier hver to dage for at opretholde sunde celler.
7. Cell Dissociation til RT-qPCR Analysis
- Celledissociering med Trypsin-EDTA
- Aspirer medier fra hver brønd og skylles to gange med 1 ml per brønd sterilt DPBS minus Ca2 + og Mg2 +.
- Tilsæt 0,5 ml 0,25% steril Trypsin-EDTA-opløsning til hver brønd, hvorfra celler vil blive opsamlet.
- Placere pladen i inkubatoren ved 37 ° C i 5 min.
- Efter 5 min kontrol celler til dissociation. Hvis celler stadig blive siddende på bunden af brønden hanen forsigtigt at løsne. Hvis aflytning ikke løsne celler, placere tilbage i inkubatoren og overvåge hver 2 min, indtil cellerne er helt løsrevet.
- Neutralisere trypsin-EDTA-opløsning ved tilsætning af 0,5 ml EB medier til hver brønd.
- Overfør hele 1 ml cellesuspension til et 1,5 ml mikrocentrifuge rør.
- Udpelleter celler ved centrifugering i en table-top centrifuge i 5 minutter ved 300 x g.
- Aspirer medier fra pellet og gå videre til lyse straks eller opbevares pellet ved -70 ˚C indtil den er klar til lyse. Lang-term opbevaring af piller anbefales ikke, da dette kan føre til nedbrydning af RNA.
- Cellelyse og molekylær analyse
- På dette tidspunkt celler er klar til RNA-isolering under anvendelse af et kommercielt kolonne ekstraktionskit eller anvendelse af RNA ekstraktion reagens ifølge protokollerne leveret af producenterne (se tabel af materialer). Efter isolering revers transkriberet RNA og anvende cDNA for RT-qPCR analyse under anvendelse af standardteknikker 20, 21.
BEMÆRK: Primere anvendes af dette laboratorium for RT-qPCR er anført i tabel 1. Atriel identitet er bekræftet ved hjælp af en kombination af RT-qPCR at se på udtryk for atriale og ventrikulære gener og elektrofysiologi til rekord handling potentiale varighed (se afsnit 8). Et udvalg af gener er medtaget i denne protokol som et eksempel på pålidelige atrielle og ventrikulære markører. Yderligere information om atrial og ventrikulær genekspression i forbindelse med pluripotente stamceller celledifferentiering findes i henvisning 14. </ Li>
- På dette tidspunkt celler er klar til RNA-isolering under anvendelse af et kommercielt kolonne ekstraktionskit eller anvendelse af RNA ekstraktion reagens ifølge protokollerne leveret af producenterne (se tabel af materialer). Efter isolering revers transkriberet RNA og anvende cDNA for RT-qPCR analyse under anvendelse af standardteknikker 20, 21.
8. Elektrofysiologiske Analyse
- Celledissociering med collagenase
- Aspirer medier fra hver brønd og skylles to gange med 1 ml per brønd sterilt PBS.
- Tilsæt 0,5 ml 1 mg / ml collagenase opløsning til hver brønd.
- Placere pladen i inkubatoren ved 37 ° C i 10 min.
- Efter 5 min kontrol celler til dissociation. Hvis celler stadig blive siddende på hinanden eller i bunden af brønden hanen forsigtigt at løsne. Yderligere dissociere cellerne ved forsigtig triturering med en P1000.
BEMÆRK: For at lette patch clamp optagelser celler skal findelt, indtil en enkelt-celle suspension er opnået. - Tilsæt 0,5 ml EB medier til hver brønd, og bland ved pipettering.
- Overfør hele 1 ml cellesuspension til et 1,5 ml mikrocentrifuge rør.
- Udpelleter celler ved centrifugering i en table-top centrifuge i 5 minutter ved 300 x g.
- Aspirer medier fra cellepellets.
- Re-suspendere celler i 500pi PBS med 10% FBS, og Sørg for at tritureres til en enkelt cellesuspension.
- Elektrofysiologisk karakterisering.
BEMÆRK: Mange gode protokoller er blevet offentliggjort i dette tidsskrift om brug enkelt celle patch clamp at måle cellemembran potentialer. For detaljeret information om, hvordan du udfører enkelt celle patch klemme den uerfarne læseren henvises til disse protokoller 21-24. Følgende indeholder specifikke oplysninger om denne protokol, som vil hjælpe den erfarne elektrofysiolog forberede og håndtere Mesc afledte CMS til undertype karakterisering.- Forbered intracellulær optagelse opløsning bestående af følgende: 10 mM HEPES buffer, 5 mM MgATP, 2 mM EGTA, 110 mM kalium glutamat, 10 mM KCl og 10 mM NaCl. Juster opløsning til en pH på 7,2 under anvendelse af NaOH.
- Forbered ekstracellulære optagelse (bad) opløsning sammensat af følgende: 2 mM HEPES, 10 mM glucose, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5,4 mM KCI, og 137mM NaCl. Juster opløsningen til en pH på 7,4 under anvendelse af NaOH.
- Forbered et glas pipette, der måler 2-5 MOhm modstand, når genfyldt med optagelse løsning ved hjælp af standard borosilikatglas med glødetråd.
- Overfør 100 ul suspenderede celler i optagelsen kammer indeholdende ekstracellulær optagelse løsning med en P200.
BEMÆRK: Celler kan blive lappet i suspension eller, at håndtering og anvendelse til behandling og / eller perfusion analyser, kan podes på en gelatine belagt dækglas som skitseret i 8.2.5). - Forbered gelatineovertrukne dækglas ved at placere en 10 mm diameter dækglas i hver brønd af en 6-brønds plade og dække med gelatine løsning som beskrevet i afsnit 3.1) i denne protokol.
- Efter mindst 30 min aspirat gelatine og der tilsættes 100 pi af suspenderede celler direkte til dækglas og placere hele 6-brønds plade i inkubator i mindst 2 timer eller indtil cellerne er vedlagt. Efter cellerne er bundet, reFlyt dækglas og sted i optagelsen kammer med ekstracellulær optagelse løsning.
BEMÆRK: Hvis du bruger αMHC-DsRed fluorescerende cardiac reporter Mesc linje, kan CMS identificeres ved deres røde fluorescerende kerner. Hvis du ikke bruger en hjerte reporter linje, kan spontant ordregivende celler iagttages og isoleres til målinger. Pluripotente stamcelle afledt CMS sædvanligvis mindre og mere afrundede, mangler den karakteristiske rektangulære morfologi fuldt dannet voksne hjertemyocytter.
- Efter mindst 30 min aspirat gelatine og der tilsættes 100 pi af suspenderede celler direkte til dækglas og placere hele 6-brønds plade i inkubator i mindst 2 timer eller indtil cellerne er vedlagt. Efter cellerne er bundet, reFlyt dækglas og sted i optagelsen kammer med ekstracellulær optagelse løsning.
- Gør alle optagelser ved 37 ˚C. Patch enkelte celler ved hjælp af hel celle klemme i strøm-clamp-mode med en borosilikatglas pipette af 2-5 MOhm modstand. Brug blid undertryk for at opnå gigaohm tætning før få helcelle adgang. Påfør hurtig undertryk til at sprænge membranen og få helcelle adgang forud for optagelse membranpotentialer.
- Fremkalde aktionspotentialer anvendelse af 4 msek depolariserende aktuelle injektioner.
NOTE:For PSC-afledte CM den mængde strøm der kræves for at reproducerbart udløse aktionspotentialer kan variere. For at finde den optimale tærskelværdi strøm, starter ved en relativ lav strøm og forøgelse udløser strømamplitude på en trinvis måde, indtil der opnås reproducerbare aktionspotentialer.
BEMÆRK: Action potentielle varighed for Grem2-inducerede atriale myocytter er sædvanligvis i området på 20-40 ms og mangler et plateau fase (figur 6B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Forud for differentiering, bør pluripotente stamceller være kompakt og fri for spontan differentiering. De i figur 1A celler er klar til at blive singularized og anvendes til at hænge dråber som beskrevet i 5.1 i protokollen sektion. De i fig 1B celler spontant at differentiere og bør ikke anvendes til fremstilling af hængende dråber.
Panelerne inkluderet i figur 2 viser held dannet EB'er på differentiering dag 2. Kvalitet EB'er generelt danner bedst inden jævnt fordelt, godt afrundet hængende dråber som vist i figur 2. Ved differentiering dag 2, bør EB'er være synlige for det blotte øje som sfæriske arrangementer differentiere stamceller ved spidserne af de hængende dråber (figur 2). Disse EB'er er klar til vask-ned, som beskrevet i 5.3 i protokollen sektion.
Under dag 2-4, bør vaskes-down EB'er i suspension fortsætte med at vokse i størrelse. På dag 4, bør velformede EB'er være fritflydende og homogene i størrelse og form (figur 3). De i figur 3 EB'er er klar til at blive overført til præ-coatede plader og behandlet med Grem2 som beskrevet i 6.1-6.3 af protokollen sektion.
Når belagte, bør EB'er flade som celler migrerer ud fra EB på overfladen af vævskulturpladen. Vist i figur 4 er eksempler på korrekt vedhæftede EB'er på differentiering dag 8 (venstre panel) og 10 (højre panel). Celler bør fortsat overvåges dagligt for at være sikker på at de blive siddende og at kontrollere for hjerte-differentiering som beskrevet nedenfor.
Kontraherende celler, hvilket indikerer tilstedeværelsen af CMS kan observeres så tidligt som dag6 og så sent som dagen 9. Typisk vil ordregivende celler være til stede på dag 8 i differentiering. Antallet af ordregivende celler i hver brønd bør fortsætte med at stige gennem differentiering dag 14. I ikke-behandlede kontrolbrønde små, langsomt ordregivende patches er observeret (Video S1), mens i Grem2 behandlede brønde store pletter med en relativt hurtig ordregivende rate er almindelige ( video S2). Lejlighedsvis, hjertedifferentiering ikke forekomme. I sådanne tilfælde timingen af Grem2 behandling, aktiviteten af proteinet, og staten af cellerne før differentiering bør revurderes for at være sikker på, at hver enkelt af disse betingelser er optimeret som beskrevet i denne protokol (se diskussionen).
Figur 5 viser resultater typisk af Grem2-behandlede kulturer og ubehandlede kontroller. RT-qPCR-analyse af genekspression i celler, der indsamles og lyseret som beskrevet i 7,1-7,2 af protokollen sektion typisk afslører høj levels af kardiale strukturelle og regulerende gener i Grem2-behandlede kulturer (figur 5A). Hvis der bruges den αMHC-DsRed-Nuc cellelinje, kan observeres øget udbytte CMS visuelt som højere antal DsRed-mærkede kerner i Grem2-behandlede brønde (figur 5B, nederste panel).
Ud over at generere et forøget antal CMS Grem2 behandling forspænder også differentiering mod en atrial lignende fænotype. Den atrial fænotype er normalt bekræftet på to måder. Først RT-qPCR-analyse af celler, der er indsamlet som beskrevet i 7,1-7,2 af protokollen afsnit bør afsløre, at gener er karakteristiske for atrieflimren CMS opreguleres mens ventrikulære gener nedreguleres (figur 6A). Sekund, patch clamp målinger af cellulære virkningspotentialevarighed (som beskrevet i 8,1-8,2 af protokoltjenesten) afslører, at en kort, atrial-lignende aktionspotentiale fremherskende blandt Grem2 treate D-celler (figur 6B).
Figur 1. Repræsentative muse embryonale stamceller (mESCs). Pluripotente muse embryonale stamceller før EB-dannelse med karakteristiske store kerne, kompakt kolonidannende morfologi (A, sorte pile), og hvide fase grænser (A, appelsin pile). Spontan differentiering af muse-ES-celler er angivet ved større, enkelte celler adskilt fra kolonier (B, sorte pile) og tab af fase kant omkring kolonier (B, orange pil). Billeder taget med et omvendt fasekontrastmikroskop. Scale søjler repræsenterer 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. embryoide organer (EBS) på dag to af differentiering. Hanging dråber suspenderet fra en petriskål låg (venstre, skala bar er 2 cm) er jævnt fordelt og homogen størrelse. EB'er i hængende dråber observeres som kompakte kugler i midten af hver dråbe (højre, skala bar er 1 mm). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. EB'er i suspension på dag 4 af differentiering. Ideal EB'er bør være homogen i størrelse og form med minimal vedhæftning til hinanden eller bunden af pladen. Billeder blev taget med et dissektionsmikroskop under sterile betingelser. Scale bar repræsenterer 100 um.belastning / 53919 / 53919fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Typisk EB morfologi efter plating. Plated EB'er på dagen 8 (til venstre) og 10 (højre) af differentiering. Som EB'er tillægger gelatinerede plader, de flade ud og fremstå som tætte centre omgivet af en stadig konfluent monolag af celler. Små lommer af kontraherende celler generelt overholdes omkring differentieringsfaktorer dage 6-8 nær centrum af EB. Disse lommer fortsætte med at udvide hele differentiering protokollen til at danne større plader af ordregivende celler i de omkringliggende monolag. Billeder taget med et omvendt fasekontrastmikroskop og. Scale søjler repræsenterer 200 um. Klik her for at se et større version af denne figur.
Figur 5. Cardiac differentiering i Grem2-behandlede og ikke-behandlede kontrolbrønde. QPCR analyse af hjertemarkører indikerer en stigning i hjerte- genekspression i EB'er behandlet med Grem2 så tidligt som dag seks og fortsættende til dag 10 i differentiering (A). Den konstruerede αMHC-DsRed-Nuc cellelinje viser store puljer af DsRed-mærket CMS kulturer behandlet med Grem2 (B, nederst) vs. ikke-behandlede kontroller (B, øverst). Tal tilpasset med tilladelse fra 14.. Fejl søjler repræsenterer SEM fra mindst 3 replikat eksperimenter. Klik her for at se en større version af dette tal.
6 "src =" / files / ftp_upload / 53919 / 53919fig6.jpg "/>
Figur 6. Karakterisering af atrial-lignende kardial fænotype. QPCR analyse indikerer en stigning i ekspression af atrielle gener og nedregulering af gener associeret med ventrikulære cm i Grem2-behandlede prøver (A). Kontrolkulturer producere CMS med virkningspotentialevarighed karakteristisk for atrielle og ventrikulære celler, mens behandling med Grem2 genererer cellepopulationer med den korte virkningspotentialevarighed karakteristisk for atriale myocytter (B). Prøver blev sammenlignet ved anvendelse Students t-test. *, P <0,05; ***, P <0,001 Tal tilpasset med tilladelse fra 14.. Fejl søjler repræsenterer SEM fra mindst 3 replikat eksperimenter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Video S1. Ikke-behandlede kontrolbrønde (Højreklik for at downloade). Small, langsomt-kontraherende lommer eller pletter af hjertemyocytter omkring periferien af EB (hvide pile). Video blev taget på differentiering dag 10.
Video S2. Grem2-behandlede brønde (Højreklik for at downloade) . Typiske resultater observeret i Grem2-behandlede celler. Store pletter af hurtigt ordregivende celler observeres hele forgyldt EB. Video blev taget på differentiering dag 10.
| Gene | | Reverse primer (5 'til 3') | |
| actin | CTACGAGGGCTATGCTCTCCC | CCGGACTCATCGTACTCCTGC |
| GAPDH | CTCACTCAAGATTGTCAGCAATG | GAGGGAGATGCTCAGTGTTGG |
| Gata4 | ACAAGGTCCAAGCCTACTCCA | CTGCGATGTCTGAGTGACAGG |
| Gja1 | ACAAGGTCCAAGCCTACTCCA | CCGGGTTGTTGAGTGTTACAG |
| Gja5 | ATAACAGTGGGCAGTTGAACAGCAG | TACCCAATAACGAATGTGGGAGATG |
| Myh6 | TACACTCTTCTCTACCTATGCTTCT | CACTATCTTCTTGAACTCAATGC |
| Myl2 | AGAGATCGATGAAATGATCAAAGAG | CAGAGCCAAGACTTCCTGTTTATT |
| Myl7 | AAATCAGACCTGAAGGAGACCTATT | CAGAGAGACTTGTAGTCAATGTTGC |
| Nkx2.5 | GTCTCAATGCCTATGGCTAC | CTACGTCAATAAAGTGGGATG |
| Tnnt2 | CAGAGGAGGCCAACGTAGAAG | CTCCATCGGGGATCTTGGGT |
Tabel 1. Liste over qPCR primersekvenserne. Primer sekvenser er listet alfabetisk efter gen-navn. Sekvenser billede 5 'til 3' for alle gener analyseret i figur 5 og 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol rutinemæssigt producerer kulturer med en høj procentdel af CMS, der er karakteristiske for atrial afstamning. Som med enhver differentiering protokol, bør kvaliteten af de mESCs før differentiering være særlig opmærksom. mESCs bør overvåges rutinemæssigt for korrekt morfologi (figur 1A). Enhver spontan differentiering, som finder sted før dannelsen af EB'er vil alvorligt begrænse effektiviteten af cardiogenese og bør fjernes før passage (figur 1B). EB størrelse påvirker også cardiogenese. Start celle numre mellem 200 og 1000 pr EB er blevet testet og 500 celler pr EB rutinemæssigt producerer det højeste antal CMS. Celler, der er passeret dagen før EB-dannelse også en tendens til at differentiere mere effektivt.
Metoden "hængende dråbe" anvendes til at generere EB'er i denne protokol 25. Andre fremgangsmåder til fremstilling af EB'er anvendes til hjertedifferentiering have været rapporteret 26-29. Metoden "hængende dråbe" er enkel og billig, let vedtaget i alle laboratorier med fælles cellekultur udstyr og materialer, og kan udføres af alle med cellekultur oplevelse. Det er også alsidig, producerer EB, som let kan manipuleres, overført, forgyldt eller indsamles til RNA analyser i henhold til de behov, som efterforskerne. Det er også skalerbar, producerer små eller store antal af EB'er efter behov.
Protokollen dikterer klædningen af EB'er på gelatine coatede plader på dag 4 af differentiering. Dette trin omdanner differentiere EB'er ind i mere typiske monolag format fælles for vævskultur. I nogle tilfælde kan det være mere praktisk og eller nødvendigt at forlade EBS i suspension i stedet plating. Hvis suspension EB foretrækkes til downstream-applikationer cellerne kan efterlades i suspension i hele differentiering processen i stedet for at blive belagt på dag 4. Ved behandling af with Grem2 er EBS placeret i 1,5 ml centrifugerør og tilladt at bosætte af tyngdekraften. Mediet derpå forsigtigt fjernet med en P1000, efterlader en lille mængde tilbage for at forhindre aspiration af EBS, og 1,5 ml Grem2 medium tilsættes til røret. Denne suspension overføres derefter til en 6 cm petriskål og stilles tilbage ved 37 ° C. Mediet ændres ved hjælp af micro centrifugerør metode anført ovenfor hver anden dag.
Differentiering dag 4 blev valgt til behandling af celler med Grem2 baseret på ekspression analyse af gener generelt forbindes med store udviklingsmæssige begivenheder. Tilsætning af Grem2 efter topekspression af gastrulation markørgener T Brachyury og Cerberus gerne 1 og ved begyndelsen af ekspression af kardiale stamceller markører, såsom Nkx2-5 er kritisk for både cardiogenese og atrial specifikation. Fordi peak ekspression af disse gener kan variere en smule blandt cellelinjer anbefales det at overvåge ekspression af disse gener under differentiation at bestemme optimal timing for Grem2 tilsætning. Af de testede for denne protokol linjer, mest reageret på behandling med Grem2 mellem dag 4 og 5 i differentiering.
Som ethvert andet rekombinant protein, aktiviteten af Grem2 varierer fra parti til parti. Det anbefales derfor, at Grem2 fra det samme parti anvendes for hvert sæt af eksperimenter at bevare sammenhængen. Når en ny vare er købt, kan effektiviteten vurderes ved at titrere dosis i området på 1-5 ug / ml. Denne protokol giver CMS fra atrial afstamning af tilstrækkeligt antal til analyse og kultur. Celler produceret ved hjælp af denne protokol kan analyseres via flowcytometri, elektrofysiologi, RT-qPCR, eller re-dyrket til brug i levende celle assays. For at lette identifikation og isolering af CMS efter kultur αMHC-DsRed-Nuc reporter linje blev udviklet og anvendes rutinemæssigt af vores laboratorium.
Denne protokol bruger serum til at opretholde en sund cell kulturer hele differentiering proces. Mens denne protokol rutinemæssigt producerer robust, atrial-lignende hjerte-differentiering, brug af serum introducerer en udefineret element til differentiering proces. Dette kan begrænse nytten af protokollen i tilfælde, hvor der kræves en mere defineret medie. Hvis en mere defineret præparat medier er påkrævet, kan serum erstattes af KnockOut Serum Udskiftning 30. Ved skift til en defineret dyrkningsmedium anbefales det, at timing og koncentration af Grem2 behandling re-optimeret som allerede beskrevet i dette afsnit.
RT-qPCR anvendes til at kvantificere ekspressionen af gener specifikke for atrielle og ventrikulære myocytter. Grem2 behandling fører til en induktion af atrielle specifikke gener, mens ned kontrollering eller ikke påvirker ekspressionen af ventrikulære gener. Dette resultat er typisk for Grem2-inducerede CMS. En foreslået sæt af gener til vurdering atrial identitet er inkluderet i denne protokol. En udvidet sæt af gens og en diskussion af deres relevans kan findes i værker der henvises til denne protokol 14,16. Som feltet fortsætter med at udvikle sig og vores forståelse af hjerte-differentiering forbedrer anbefales det, at denne liste over atrielle og ventrikulære identitetsmarkører vurderes og revideres efter behov.
Generering homogene kulturer CMS vil lette kliniske forskning fokuseret på sygdomme vides at påvirke bestemte hjerte-undertyper og give en model for grundforskning fokuseret på at forstå mekanismerne i kammerets specifikation i hvirveldyr hjerter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud HL083958 og HL100398 (AKH) og 2T32HL007411-33 "Program i Kardiovaskulære Mekanismer: Træning i Investigation" (JB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GMEM | Life Technologies | 11710 | |
| FBS | Life Technologies | 10082 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050 | |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
| ß-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Non-Essential Amino Acids | Sigma | M7145 | |
| 10 cm Tissue Culture Plates | Sarstedt | 83.3902 | |
| 10 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-342 | |
| 6 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-092 | |
| 6-well tissue culture plates | Sarstedt | 83.3920 | |
| Gremlin 2 recombinant protein | R&D Systems | 2069-PR-050 | |
| Sterile filter units | Thermo Fisher | 09-741-02 | |
| Gelatin (from porcine skin) | Sigma | G1890 | |
| 10X PBS, Sterile | Sigma | P5493 | |
| BSA | Sigma | 5470 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA solution | Life Technologies | 25300054 | |
| DPBS, no Calcium, no Magnesium | Life Technologies | 14200 |
References
- Loya, K., Eggenschwiler, R., et al. Hepatic differentiation of pluripotent stem cells. Biological Chemistry. 390 (10), 1047-1055 (2009).
- Narazaki, G., Uosaki, H., et al. Directed and systematic differentiation of cardiovascular cells from mouse induced pluripotent stem cells. Circulation. 118 (5), 498-506 (2008).
- Zhang, Y., Pak, C., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Park, I. H., Arora, N., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Golos, T. G., Giakoumopoulos, M., Garthwaite, M. A. Embryonic stem cells as models of trophoblast differentiation: progress, opportunities, and limitations. Reproduction. 140 (1), 3-9 (2010).
- Boheler, K. R., Czyz, J., Tweedie, D., Yang, H. T., Anisimov, S. V., Wobus, A. M. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells Into cardiomyocytes. Circulation Research. 91 (3), 189-201 (2002).
- Burridge, P. W., Anderson, D., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25 (4), 929-938 (2007).
- Cai, C. L., Liang, X., et al. Isl1 Identifies a cardiac progenitor population that proliferates prior to differentiation and contributes a majority of cells to the heart. Developmental Cell. 5 (6), 877-889 (2003).
- Fujiwara, M., Yan, P., et al. Induction and enhancement of cardiac cell differentiation from mouse and human induced pluripotent stem cells with Cyclosporin-A. PLoS ONE. 6 (2), e16734 (2011).
- Rai, M., Walthall, J. M., Hu, J., Hatzopoulos, A. K. Continuous antagonism by Dkk1 counter activates canonical wnt signaling and promotes cardiomyocyte differentiation of embryonic stem cells. Stem Cells and Development. (1), 54-66 (2012).
- Burridge, P. W., Matsa, E., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Lian, X., Zhang, J., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Zhang, J., Klos, M., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Tanwar, V., Bylund, J. B., et al. Gremlin 2 promotes differentiation of embryonic stem cells to atrial fate by activation of the JNK signaling pathway. Stem Cells. 32 (7), 1774-1788 (2014).
- Kattman, S. J., Witty, A. D., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
- Müller, I. I., Melville, D. B., et al. Functional modeling in zebrafish demonstrates that the atrial-fibrillation-associated gene GREM2 regulates cardiac laterality, cardiomyocyte differentiation and atrial rhythm. Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 332-341 (2013).
- Kattamuri, C., Luedeke, D. M., Thompson, T. B. Expression and purification of recombinant protein related to DAN and cerberus (PRDC). Protein Expression and Purification. 82 (2), 389-395 (2012).
- Schulz, H., Kolde, R., et al. The FunGenES Database: A genomics resource for mouse embryonic stem cell differentiation. PLoS ONE. 4 (9), e6804 (2009).
- Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using Real-Time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Beck, H., Semisch, M., Culmsee, C., Plesnila, N., Hatzopoulos, A. K. Egr-1 regulates expression of the glial scar component phosphacan in astrocytes after experimental stroke. American Journal of Pathology. 173 (1), 77-92 (2008).
- Graham, E. L., Balla, C., Franchino, H., Melman, Y., del Monte, F., Das, S. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
- Sachinidis, A., Fleischmann, B. K., Kolossov, E., Wartenberg, M., Sauer, H., Hescheler, J. Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).
- Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 862-869 (1995).
- Höpfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Volume 2: molecular embryo analysis, live imaging, transgenesis, and cloning. Methods in Molecular Biology. , 254-279 (2004).
- Ao, A., Williams, C. H., Hao, J., Hong, C. C. Modified mouse embryonic stem cell based assay for quantifying cardiogenic Induction Efficiency. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
- Antonchuk, J., Gassmann, M., Desbaillets, I. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWell™ plates. Basic Cell Culture Protocols. 946, 523-533 (2013).
- Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells. Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).
