Abstract
Protocollen voor het genereren van populaties van cardiomyocyten uit pluripotente stamcellen zijn ontwikkeld, maar deze leveren in het algemeen cellen gemengd fenotypes. Onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het nastreven van studies met specifieke myocyten subtypen vereisen een meer gerichte differentiatie aanpak. Door behandeling van muis embryonale stam (ES) cellen met Grem2, een uitgescheiden BMP antagonist die nodig is voor atriale perskamer in vivo is, kan een groot aantal hartcellen een atriale fenotype worden gegenereerd. Het gebruik van de gemanipuleerde Myh6-DsRed-Nuc pluripotente stamcellen lijn zorgt voor identificatie, selectie en zuivering van hartspiercellen. In dit protocol embryo lichamen worden gegenereerd uit Myh6-DsRed-Nuc cellen met behulp van de opknoping neerzetten en in suspensie gehouden tot differentiatie dag 4 (D4). Bij d4 cellen worden behandeld met Grem2 en uitgeplaat op met gelatine beklede platen. Tussen d8-d10 grote aanbestedende gebieden worden waargenomen in de culturen en verder uit te breiden en mtuur door middel van d14. Moleculair, histologische en electrophysiogical duidt cellen in Grem2 behandelde cellen verwerven atriale-achtige kenmerken verschaffen een in vitro model om de biologie van atriale cardiomyocyten en hun reactie op verschillende farmacologische middelen te bestuderen.
Introduction
Pluripotente stamcellen zijn een krachtig hulpmiddel voor het genereren en het bestuderen van cellen van een groot aantal moeilijk bereikbare weefsels voor fundamenteel onderzoek en preklinische studies, vooral bij de mens 1-5. Juiste modulatie van ontwikkelings signaalwegen kan de differentiatie van pluripotente stamcellen direct naar het gewenste fenotypische lot. Veel protocollen ontwikkeld om cardiomyocyten (CM) van pluripotente stamcellen 6-14 genereren. Deze protocollen omvatten in het algemeen modulatie van TFGβ superfamilie (activine, BMP en TGFp) en Wnt paden in getimede additie van exogene groeifactoren en / of kleine moleculen 10,12-15. Deze protocollen zijn in het algemeen effectief in het verhogen van het percentage van cellen die CM geworden, maar missen specificiteit, waardoor een gemengde populatie van cellen die atriale ventriculaire en knooppunten / geleidingssysteem lijnen. Teneinde specifieke cardiale onderzoeken subtypes een gerichte differentiatie voorkomendach vereist.
Gremlin2 (Grem2, ook wel Protein Dan en Cerberus of PRDC kortweg E) is een afgescheiden BMP antagonist die nodig zijn voor een goede cardiale differentiatie en atriale formatie kamer is tijdens de ontwikkeling van het hart in de zebravis 16. Het behandelen van differentiërende embryonale stamcellen met Grem2 op differentiatie dag 4, net na de piek expressie van mesodermale markers T-Brachyury en Cerberus zoals 1, verhoogt de opbrengst van CMS en genereert een pool van cellen voornamelijk uit de atriale lijn 14.
Recombinant Grem2 wordt gebruikt om de differentiërende cellen te behandelen en kan met behulp van standaard eiwit productietechnieken 17 worden gemaakt of kunnen commercieel worden aangeschaft. Het is zeer oplosbaar in waterige oplossingen en kunnen exogeen aan kweken wordt toegevoegd op het gewenste tijdstip.
Differentiatie kan worden gevolgd met behulp van RT-qPCR om de expressie van markers representatief te kwantificerenvan hart- en voorouders, cardiale voorlopercellen, en betrokken CMS. Immunofluorescentie kan ook worden gebruikt voor het identificeren en visualiseren ruimtelijke verdeling van cardiale celtypen.
Toepassingen die pure bevolking nodig zijn gemakkelijker uitgevoerd bij gebruik van een reporter-systeem voor het identificeren en isoleren van CMS. Hiervoor hebben we introduceerde de αMHC-DsRedNuc construct in de muis CGR8 ES-cellijn 14. CGR8 cellen groeien en blijven pluripotent zonder voedingscellen, vergemakkelijken expansie en differentiatie assays 18. De ES-cellijn bevat een DsRed fluorescent eiwit coderende sequentie met een nucleair lokalisatie signaal onder de cardiale-specifieke alfa-myosine zware keten (a Mhc of Myh6) gen promoter. Met behulp van deze cellen, kunnen CM gemakkelijk worden geïdentificeerd en geïsoleerd voor kwantificering celsortering, elektrofysiologie, drug schermen en studie van mechanismen atriale differentiatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van celkweekmedia, oplossingen en reagentia.
- Bereid 500 ml van de muis embryonale stamcellen (mES) media door het mengen en steriele filtering (0,2 urn poriegrootte) 445 ml Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM), 50 ml door warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), 5 ml 100X geconcentreerd L- glutamine vervanging, 5 gl recombinant muis Leukemie Remmende Factor (LIF) en 1 x 10 7 eenheden per ml en 1,43 ul ß-mercaptoethanol (eindconcentratie 50 uM). Bewaren bij 4 ° C tot gebruik.
- Bereid 500 ml embryoiden lichaam (EB) differentiatie media door mengen en steriele filtering 391 ml Iscove's gemodificeerd Dulbecco Medium (IMDM), 100 ml hitte geïnactiveerd FBS, 5 ml 100X geconcentreerd L-glutamine vervangen, 5 ml 100X geconcentreerde niet-essentiële aminozuren (NEAA) en 2,86 pi ß-mercaptoethanol (eindconcentratie 100 uM). Bewaren bij 4˚ C tot gebruik.
- Bereid 0,2% w/ v oplossing van gelatine door het mengen van 1 g varkenshuid gelatine poeder met 500 ml gefiltreerd gedestilleerd H2O Steriliseren in autoclaaf. Merk op dat de gelatine niet volledig oplosbaar in water kunnen zijn bij kamertemperatuur. Na autoclaveren de gelatine moet volledig worden opgelost. Bewaar bij KT totdat klaar voor gebruik.
- Bereid Grem2 recombinant eiwit aliquots door oplossen van 50 g pellet gevriesdroogd Grem2 in 100 pl fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) aangevuld met 0,1% BSA een 0,5 ug / ul voorraadoplossing te maken. Aliquot 20 ul van deze voorraad oplossing in vijf steriele 1,5 ml centrifugebuizen en bewaar bij -80˚ C tot gebruik.
- Bereid PBS volgens de gepubliceerde protocollen of aankoop als een 10x voorraad en verdun 01:10 met gefilterd, gedistilleerd H 2 O tot een 1X het werken verdunning 19. Steriliseren PBS autoclaaf vóór gebruik. Bewaar bij KT totdat klaar voor gebruik. In sommige stappen DPBS zonder Ca2 + en Mg2 + wordt gebruikt. Dit is purchased als 1X oplossing. Bestelinformatie wordt in de tabel van de reagentia.
2. Bereiding van gelatine beklede 10 cm weefselkweekplaten
- In een gesteriliseerde weefselkweek kap voeg 5 ml 0,2% gelatine-oplossing in elk 10 cm weefselkweekplaat voor coating. De vaat moet incubator bij 37 ° C gedurende ten minste 30 minuten of tot 4 dagen.
3. Bereiding van gelatine beklede 6-putjes weefselkweekplaten
- In een gesteriliseerd weefselkweek kap voeg 1 ml van 0,2% gelatine aan elk putje van een 6-well weefselkweek plaat. Plaats platen in incubator bij 37 ° C gedurende ten minste 30 minuten of tot 4 dagen.
4. embryonale stamcel Cultuur
- ontdooien mESCs
- Bereid mES media door opwarming tot kamertemperatuur in een gesteriliseerd weefselkweek kap. Voeg 10 ml RT media een gelatine gecoate 10 cm schaal.
- Verwijderen 1 flacon mESCs die ongeveer 1 x 10 6 cellen uitcryo. Holding cryovial met een tang, plaats in een 37 ° C waterbad. Zwenk totdat celsuspensie ontdooid is en slechts een klein ijskristal blijft in het midden van de flacon. Droog flacon met een wegwerp-pluizende af te vegen en te steriliseren met 70% EtOH.
- In een steriele weefselkweek kap verwijderen ontdooide cellen met behulp van een P1000 tip van cryovial en over te dragen aan 10 cm gerecht bereid in 4.1.1).
- Breng 10 cm schotel in 37 ° C bevochtigde celcultuur incubator met 5% CO 2 en gelijkmatig te verdelen cellen door zachtjes bewegen van de plaat voor naar achter, dan van links naar rechts. Laat cellen te hechten aan plaat O / N of ten minste 6 uur.
- Het eerste wat de volgende ochtend check cellen voor bevestiging met behulp van een helder veld microscoop. Sommige celafval en dode cellen worden waargenomen in de media. Dit is normaal. Aspireren media van gerechten en te vervangen door 10 ml vers mES media.
- Blijven media veranderen cellen elke dag om differentiatie te voorkomen.
- Passage cellen bij 60-70% confluent. Bereid cellen voor passage door opzuigen media en spoelen met 5 ml steriel 1X DPBS zonder MgCl2 en CaCl2. Voeg 2 ml 0,05% trypsine-EDTA-oplossing. Plaatsen incubator bij 37 ° C gedurende 5 min.
- Terwijl cellen incuberen Bereid nieuwe 10 cm schaal door opzuigen gelatineoplossing en 10 ml RT mES media. Na 5 min controleer de cellen voor onthechting. Als cellen blijven zitten, blijven incuberen bij 37 ° C gedurende 2 minuten in tot volledig los.
- Quench trypsine-EDTA door het toevoegen van 3 ml mES media. Transfer celsuspensie aan een 15 ml centrifugebuis en centrifugeren bij 200 xg gedurende 5 minuten tot pellet. Aspireren media van pellet en resuspendeer in 10 ml mES media.
- Afhankelijk van de gewenste verdelingscoëfficiënt voeg 0,5-1,0 ml celsuspensie aan elk gerecht bereid in stap 4.2.2). Plaats de schotel in de incubator en gelijkmatig te verdelen cellen door voorzichtig bewegen terug naar voren dan van links naar rechts. Alleow cellen hechten O / N of gedurende ten minste 12 uur.
LET OP: Een split-verhouding van 1:10-01:20 is gebruikelijk voor de meeste mES lijnen. Deze verhouding kan variëren afhankelijk van de gebruikte lijn, passage nummer, en de gewenste samenvloeiing op de nieuwe schaal. Voor een 1:10 splitsingsverhouding breng 1 ml van celsuspensie in 9 ml mES media en plaat in een vers bereide gelatine gecoate 10 cm schotel.
5. Voorbereiding van de embryoiden Bodies
LET OP: Alle stappen behalve centrifugeren worden uitgevoerd in een steriele weefselkweek kap.
- Voorbereiding van de Cell Suspension in EB Media
- Bij 70% confluentie (meestal 24-48 uur na passage), gebruik maken van de cellen voor EB vorming. Bereid je cellen voor EB vorming door het losmaken en pelleteren volgens paragrafen 4.2.1) - 4.2.3).
Let op: (bijv., Zeer weinig celdood, geen verontreiniging, goede morfologie) Het beste is om passage cellen minstens één keer na de dooi en controleer op de gezondheid en robuuste groei (e.g., populatieverdubbelingen gezien eenmaal per 24-48 uur) vóór gebruik op het maken EBS. - Re-schorten pellet in 5 ml EB media. Tellen cellen met behulp van een hemocytometer of geautomatiseerde cel tegen te gaan.
- Verdunnen celsuspensie in benodigde volume EB media tot een uiteindelijke concentratie van 25 cellen / ul (of 2,5 x 10 3 cellen / ml) te maken. Merk op dat elk deksel van een petrischaal bevat ongeveer 60 EBS en vereist ongeveer 1,3 ml celsuspensie. Bij deze stap bereid voldoende hoeveelheid celsuspensie het gewenste aantal EBS genereren. Als bijvoorbeeld 240 EBS nodig voor experiment Bereid 5,2 ml bij 2,5 x 10 3 cellen / ml.
OPMERKING: mESCs die niet worden gebruikt voor EB vorming kan worden gebruikt voor toekomstige experimenten van stoppen met draaien, opnieuw suspenderen in mES media en plateren zoals beschreven in paragraaf 4.2.
- Bij 70% confluentie (meestal 24-48 uur na passage), gebruik maken van de cellen voor EB vorming. Bereid je cellen voor EB vorming door het losmaken en pelleteren volgens paragrafen 4.2.1) - 4.2.3).
- Oprichting van de embryoiden Bodies
- Bereid steriele 10 cm bacteriële petrischalen voor opknoping druppelvorming door toevoeging van 2 ml 1X PBS aan de onderzijde van each.
- Transfer EB suspensie van stap 5,1) in een steriele oplossing bekken.
- Verwijderen deksel uit voorbereide petrischaal en zorgvuldig deponeren zestig, 20 ul druppels EB suspensie op het binnenoppervlak. Doen dit efficiënt met behulp van een multi-channel pipet voorzien van 6 tips. Elke 20 ul druppel nu 500 cellen.
- Zachtjes vervangen deksel op de onderste helft van de bacteriële petrischaal, dat evenwel niet te verjagen opknoping druppels. Plaats gerechten in celkweek incubator bij 37˚ C. Na 2 dagen, de cellen zijn klaar om te spoelen, zoals beschreven in 5.3).
- Wash-down van de embryoiden Bodies
Opmerking: Alle spoelen beneden stappen worden uitgevoerd in een steriele weefselkweek kap.- Na 2 dagen van EB zijn klaar voor het wassen naar beneden en over te brengen naar 6 cm bacteriële petrischaaltjes. Pre-warm 3 ml EB media per petrischaal tot kamertemperatuur. Elke 6 cm bacteriële petrischaaltje effectief kan vasthouden 2 deksels ter waarde van opknoping druppels.
Opmerking: Zorg ervoor dat u een niet-gecoate petrischaal f gebruikenof deze stap (zie materialen tabel). Gebruik geen weefselkweek schotel of een ander oppervlak dat celadhesie stimuleert. EBS moet blijven gesuspendeerd in de media totdat klaar om te worden verzilverd zoals beschreven in hoofdstuk 6. - Verwijder 10 cm petri gerechten uit incubator en plaats in steriele weefselkweek kap. Verwijder voorzichtig deksel met EBS en kantelen in een hoek van 45 graden.
- Met een 5 ml serologische pipet met 3 ml RT EB media voorzichtig te wassen EBS in een zwembad bij de bodem van het deksel. Inspecteer zorgvuldig het deksel voor EBS die vastzitten aan het oppervlak en opnieuw te spoelen indien nodig.
- Na wassen alle EBS overdracht naar een 6 cm petrischaal.
- Herhaal stap 5.3.2) -5.3.4) voor alle EBS. Elke 6 cm petrischaal moet EBS bevatten twee 10 cm deksels. Plaats alle schotels terug in incubator bij 37 ° C gedurende twee dagen.
LET OP: EBS die te dicht bij elkaar in suspensie kan aan elkaar plakken en vormen grote aggregaten. Dit kan een negatieve invloed cardiale differentiatie efficiencyen aanzienlijke vermindering van het aantal beschikbare EBS. Om aggregatie te voorkomen, moeten EBS elke dag worden gecontroleerd en gescheiden door zachtjes heen en weer bewegen, dan van links naar rechts. Het gebruik van bacteriële schotels in de vroege differentiatie stappen moet EB bevestiging aan de schaal voorkomen en een EBS groeien in suspensie.
- Na 2 dagen van EB zijn klaar voor het wassen naar beneden en over te brengen naar 6 cm bacteriële petrischaaltjes. Pre-warm 3 ml EB media per petrischaal tot kamertemperatuur. Elke 6 cm bacteriële petrischaaltje effectief kan vasthouden 2 deksels ter waarde van opknoping druppels.
6. Plating en behandeling van EBS Met Grem2
- Bereid Grem2 behandeling medium met voldoende volume van de voorraad (0,5 ug / ul) het toevoegen Grem2 aan RT EB medium voor een uiteindelijke verdunning van 1-5 ug / ml.
OPMERKING: De effectieve concentratie voor behandeling van EBS varieert afhankelijk van de cellijn en de specifieke activiteit van de huidige veel Grem2. Aanbevolen wordt vóór de dosis gebruiken getitreerd om maximale doeltreffendheid te vinden. Voor de CGR8 mES lijn routinematig we gebruiken 3-5 ug / ml Grem2. Effectieve concentraties van Grem2 voor atriale myocyten generatie zal snel aanbestedende cellen tussen produceren7-8 dagen die zeer verspreid in elk goed. Als aanbestedende fenotype niet in behandelde culturen wordt waargenomen is het raadzaam dat de Grem2 dosis getitreerd worden binnen het aangegeven bereik. - Bereid 6-putjes weefselkweekplaten door opzuigen gelatinebekleding oplossing uit elk putje en het toevoegen van 2 ml RT Grem2 behandelingsmedia. Verwijder EBS uit incubator en plaats in steriele weefselkweek kap.
- Met een P1000 ingesteld op 100 gl overdracht 30 EBS van 6 cm petrischalen aan elk putje. Plaats EBS in de incubator en gelijkmatig verspreiden door voorzichtig te bewegen plaat achter naar voren dan van links naar rechts.
- Na EBS gelatine beklede putjes hebben gehecht, vervangt Grem2 media om de twee dagen tot dag 10. Na dag 10, staken de Grem2 behandeling en voeg verse EB media om de twee dagen aan gezonde cellen te behouden.
LET OP: Na het bevestigen, zal EBS afvlakken langs het oppervlak van de gecoate plaat.
- Na EBS gelatine beklede putjes hebben gehecht, vervangt Grem2 media om de twee dagen tot dag 10. Na dag 10, staken de Grem2 behandeling en voeg verse EB media om de twee dagen aan gezonde cellen te behouden.
7. Cel Dissociatie voor RT-qPCR Analyzus
- Cel dissociatie met trypsine-EDTA
- Aspireren media uit elk putje en spoel tweemaal met 1 ml per putje van steriele DPBS minus Ca 2+ en Mg 2+.
- Voeg 0,5 ml 0,25% steriel trypsine-EDTA-oplossing aan elk putje waaruit cellen worden verzameld.
- Plaats de plaat in de incubator bij 37 ° C gedurende 5 minuten.
- Na 5 min check cellen voor dissociatie. Als de cellen nog steeds blijven aan bodem van de put kraan voorzichtig los te maken. Als tikken geen cellen heeft los te maken, plaatst u terug in de incubator en te controleren om de 2 min totdat cellen volledig vrijstaand.
- Neutraliseren Trypsine-EDTA-oplossing door toevoeging van 0,5 ml EB medium aan elk putje.
- Transfer gehele 1 ml celsuspensie met een 1,5 ml microcentrifuge buis.
- Pellet cellen door het draaien in een tafelblad centrifuge gedurende 5 minuten bij 300 x g.
- Aspireren media van pellet en gaan naar lysis onmiddellijk of op te slaan pellet bij -70 ° C tot klaar voor lysis. Lange-term opslag van pellets wordt niet aanbevolen, omdat dit kan leiden tot afbraak van RNA.
- Cell Lysis and Molecular Analysis
- Op dit moment zijn de cellen klaar voor RNA-isolatie met een commerciële kolom extractie kit of door RNA-extractie reagens volgens de door de fabrikant geleverde protocollen (zie tabel van materialen). Eenmaal geïsoleerd reverse getranscribeerd RNA en cDNA gebruikt voor RT-qPCR analyse onder toepassing van standaardtechnieken 20, 21.
LET OP: Primers gebruikt door dit lab voor RT-qPCR worden opgesomd in tabel 1. atriale identiteit wordt bevestigd met behulp van een combinatie van RT-qPCR om te kijken naar de expressie van atriale en ventriculaire genen en elektrofysiologie tot recordhoogte actiepotentiaal duur (zie paragraaf 8). Een selectie van genen in dit protocol als voorbeeld van betrouwbare atriale en ventriculaire markers. Verdere informatie over atriale en ventriculaire genexpressie in de context van pluripotente stamcel differentiatie vinden in referentie 14. </ Li>
- Op dit moment zijn de cellen klaar voor RNA-isolatie met een commerciële kolom extractie kit of door RNA-extractie reagens volgens de door de fabrikant geleverde protocollen (zie tabel van materialen). Eenmaal geïsoleerd reverse getranscribeerd RNA en cDNA gebruikt voor RT-qPCR analyse onder toepassing van standaardtechnieken 20, 21.
8. Elektrofysiologische Analyse
- Cel Dissociatie met Collagenase
- Aspireren media uit elk putje en tweemaal spoelen met 1 ml per putje van steriele PBS.
- Voeg 0,5 ml van 1 mg / ml collagenase-oplossing aan elk putje.
- Plaats de plaat in de incubator bij 37 ° C gedurende 10 minuten.
- Na 5 min check cellen voor dissociatie. Als cellen nog blijven zitten aan elkaar of de bodem van de put kraan voorzichtig los. Verdere dissociëren de cellen door voorzichtig wrijven met een P1000.
OPMERKING: Om patch clamp opnames cellen te vergemakkelijken dient te worden aangewreven tot een single-cell suspensie wordt bereikt. - Voeg 0,5 ml EB media aan elk putje en meng door pipetteren.
- Transfer gehele 1 ml celsuspensie met een 1,5 ml microcentrifuge buis.
- Pellet cellen door het draaien in een tafelblad centrifuge gedurende 5 minuten bij 300 x g.
- Aspireren media van cel pellets.
- Resuspendeer cellen in 500gl PBS met 10% FBS, waarbij u vermaal in een enkele celsuspensie.
- Elektrofysiologische karakterisering.
LET OP: Vele uitstekende protocollen zijn gepubliceerd in dit tijdschrift over het gebruik van enkele cel patch clamp om celmembraan potentials meten. Voor gedetailleerde informatie over hoe om te presteren enkele cel patch clamp de beginnende lezer wordt verwezen naar deze protocollen 21-24. De volgende bevat specifieke informatie voor dit protocol, dat zal helpen de ervaren electrophysiologist voorbereiden en behandelen mES afgeleid CMS voor subtype karakterisering.- Bereid intracellulaire opname oplossing bestaande uit: 10 mM HEPES buffer, 5 mM MgATP, 2 mM EGTA, 110 mM kaliumglutamaat, 10 mM KCl en 10 mM NaCl. Passen oplossing tot een pH van 7,2 met behulp NaOH.
- Bereid extracellulaire (bad) oplossing bestaande uit: 2 mM HEPES, 10 mM glucose, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5,4 mM KCl en 137mM NaCl. Passen oplossing tot een pH van 7,4 met behulp NaOH.
- Bereid een glazen pipet die 2-5 MQ weerstand meet wanneer opgevuld met opname-oplossing met behulp van standaard borosilicaatglas met gloeidraad.
- Breng 100 ul van gesuspendeerde cellen in de opname kamer met extracellulaire oplossing om met een P200.
OPMERKING: Cellen kunnen worden hersteld in suspensie of, om het hanteren te vergemakkelijken en te gebruiken behandelingsdruk en / of perfusie assays kunnen worden gezaaid op een met gelatine beklede dekglaasje zoals in 8.2.5). - Bereid gelatine beklede dekglaasjes door het plaatsen van een diameter van 10 mm glas dekglaasje in elk putje van een 6-wells plaat en afdekken met gelatine-oplossing, zoals beschreven in paragraaf 3.1) van dit protocol.
- Na tenminste 30 min aspireren gelatineoplossing en voeg 100 ul van gesuspendeerde cellen direct dekglaasje en plaats gehele 6-wells plaat in de incubator gedurende ten minste 2 uur of totdat de cellen gevoegd. Nadat cellen zijn gehecht, remove dekglas en plaats in de opname kamer met extracellulaire oplossing.
LET OP: Als u de αMHC-DsRed fluorescerende cardiale reporter mES lijn, kunnen CM's worden geïdentificeerd door hun rode fluorescerende kernen. Als u geen cardiale reporter lijn, kan spontaan samentrekkende cellen worden geobserveerd en geïsoleerd voor metingen. Pluripotente stamcellen afkomstig van CM's zijn meestal kleiner en meer afgerond, ontbreekt de karakteristieke rechthoekige morfologie van volledig gevormde volwassen hartspiercellen.
- Na tenminste 30 min aspireren gelatineoplossing en voeg 100 ul van gesuspendeerde cellen direct dekglaasje en plaats gehele 6-wells plaat in de incubator gedurende ten minste 2 uur of totdat de cellen gevoegd. Nadat cellen zijn gehecht, remove dekglas en plaats in de opname kamer met extracellulaire oplossing.
- Maak alle opnamen bij 37 ° C. Patch enkele cellen met behulp van whole cell klem in de huidige-clamp-modus met een borosilicaatglas pipet van 2-5 MQ weerstand. Gebruik zachte negatieve druk op gigaohm seal voorafgaand aan het verkrijgen van volledige toegang cel te bereiken. Solliciteer snel negatieve druk op het membraan scheuren en krijgen volledige toegang cel voorafgaand aan de opname membraan potentials.
- Evoke actiepotentialen met behulp van 4 msec depolariserende huidige injecties.
NOTITIE:Voor PSC-afgeleide CM de hoeveelheid stroom vereist om reproduceerbare activeren actiepotentialen kan variëren. Om een optimale drempelstroom vinden vanaf een betrekkelijk lage stroom en toename triggering amplitude stapsgewijs tot reproduceerbare actiepotentialen verkregen.
OPMERKING: actiepotentiaal duur voor Grem2 geïnduceerde atriale myocyten gewoonlijk in het bereik van 20-40 ms en missen een plateaufase (figuur 6B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voorafgaand aan differentiatie, moet pluripotente stamcellen compact en vrij spontane differentiatie. De in figuur 1A cellen klaar voor singularized en gebruikt voor opknoping dalingen punt 5.1 van de sectie protocol. De in figuur 1B cellen spontaan differentiëren en mogen niet worden gebruikt voor de bereiding van druppels opknoping.
De panelen in figuur 2 tonen succes gevormd EBS differentiatiepoging dag 2. Kwaliteit EBS vormen in het algemeen best in gelijkmatig verdeelde, mooie ronde hangende druppels zie figuur 2. Bij differentiatie dag 2, EBS moet zichtbaar zijn voor het blote oog als bolvormige regelingen differentiëren stamcellen aan de uiteinden van de hangende druppels (figuur 2). Deze EBS zijn klaar voor wash-down, zoals beschreven in 5.3 van de sectie protocol.
Tijdens de dagen 2-4, moet gewassen-down EBS in suspensie blijven groeien in omvang. Op dag 4, moet goed gevormde EBS vrij zwevende, homogeen in grootte en vorm (figuur 3) zijn. De in figuur 3 EBS gereed zijn overgebracht naar vooraf beklede platen en behandeld met Grem2 zoals beschreven in de sectie van 6,1-6,3 protocol.
Eenmaal bedekt moet EBS afvlakken als cellen migreren vanuit het EB op het oppervlak van de weefselkweekplaat. Getoond in Figuur 4 zijn voorbeelden van goed bevestigd EBS differentiatiepoging dagen 8 (linker paneel) en 10 (rechter paneel). Cellen moeten blijven dagelijks worden gecontroleerd om zeker te zijn dat ze bevestigd blijven en te controleren op cardiale differentiatie zoals hieronder beschreven.
Aanbestedende cellen, waaruit de aanwezigheid van CM, kunnen worden waargenomen zo vroeg als de dag6 en zo laat dag 9. Kenmerkend zal verdragsluitende cellen aanwezig op dag 8 van differentiatie. De aantallen van de aanbesteding van de cellen in elk putje moet blijven verhogen door middel van differentiatie dag 14. In de niet-behandelde controle wells kleine, langzaam aanbestedende patches zijn waargenomen (Video S1), terwijl in Grem2 behandeld wells grote vlekken met een relatief snelle aanbestedende rate zijn vaak ( video S2). Soms cardiale differentiatie uitblijft. In dergelijke gevallen kan de timing van Grem2 behandeling de activiteit van het eiwit, en de toestand van de cellen voorafgaand aan differentiatie opnieuw worden geëvalueerd om te zorgen dat elk van deze voorwaarden geoptimaliseerd zoals beschreven in dit protocol (zie bespreking).
Figuur 5 toont resultaten typisch Grem2 behandelde culturen en onbehandelde controles. RT-qPCR analyse van genexpressie in cellen verzameld en gelyseerd zoals beschreven in de sectie van 7,1-7,2 protocol kenmerkend onthullen high levels van cardiale structurele en regulerende genen in Grem2 behandelde kweken (figuur 5A). Als de αMHC-DsRed-Nuc cellijn wordt gebruikt, kan de verhoogde opbrengst van CM visueel worden waargenomen als hogere aantallen DsRed-gemerkte kernen in Grem2 behandelde putjes (Figuur 5B, onderste paneel).
Naast het genereren van een groter aantal CM, Grem2 behandeling voorspant ook differentiatie naar een atriale fenotype. De atriale fenotype wordt meestal bevestigd op twee manieren. Eerst, RT-qPCR analyse van cellen verzameld zoals beschreven in de sectie van 7,1-7,2 protocol moet uitwijzen dat genen kenmerkend atriale CM opgereguleerd tijdens ventriculaire genen neerwaarts gereguleerd (figuur 6A). Tweede patch clamp metingen van cellulaire actiepotentiaalduur (zoals beschreven in de sectie van 8,1-8,2 protocol) blijkt dat een korte, atriale-achtige actiepotentiaal overheerst bij Grem2 treate d cellen (Figuur 6B).
Figuur 1. Representatieve muis embryonale stamcellen (mESCs). Pluripotent muis embryonale stamcellen voorafgaand aan de EB formatie met kenmerkende grote kern, compact-kolonievormende morfologie (A, zwarte pijlen), en wit fase grenzen (A, oranje pijlen). Spontane differentiatie van muis ES-cellen wordt aangeduid door grotere, enkele cellen gescheiden van kolonies (B, zwarte pijlen) en het verlies van de eerste fase rand rond kolonies (B, oranje pijl). Beelden die zijn vastgelegd met behulp van een omgekeerde fase contrast microscoop. Schaal bars vertegenwoordigen 50 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. embryoiden organen (EBS) op dag 2 van differentiatie. Opknoping druppels opgehangen aan een petrischaal deksel (links, schaal bar is 2 cm) worden gelijkmatig verdeeld en homogeen in grootte. EBS in opknoping druppels worden waargenomen als compacte bolletjes in het midden van elke druppel (rechts, schaal bar is 1 mm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. EBS in suspensie op dag 4 van differentiatie. Ideaal EBS moet homogeen in grootte en vorm met minimale hechting aan elkaar of de onderkant van de plaat. Beelden werden opgenomen met een dissectie scope onder steriele omstandigheden. Schaal bar vertegenwoordigt 100 urn.load / 53919 / 53919fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Typische EB morfologie na plating. Plated EBS op dag 8 (links) en 10 (rechts) van differentiatie. Als EBS hechten aan gegelatineerd borden, ze plat uit en verschijnen als dichte centra omgeven door een steeds confluente monolaag van cellen. Kleine zakken van de aanbestedende cellen worden algemeen waargenomen rond differentiatie dagen 6-8 in de buurt van het centrum van de EB. Deze zakken blijven groeien tijdens de differentiatie protocol van platen verdragsluitende cellen in het omringende monolagen vormen. Beelden die zijn vastgelegd met behulp van een omgekeerde fase contrast microscoop en. Schaal bars vertegenwoordigen 200 urn. Klik hier voor een grotere weergave versie van deze figuur.
Figuur 5. Cardiac differentiatie Grem2 behandelde en niet-behandelde controles. QPCR analyse van hartmarkers wijst op een toename van de cardiale genexpressie in EBS behandeld met Grem2 al op dag zes en voortgezet tot dag 10 van differentiatie (A). De gemanipuleerde αMHC-DsRed-Nuc cellijn blijkt uit grote pools van DsRed-gelabelde CM's in kweken behandeld met Grem2 (B, onder) versus niet-behandelde controles (B, boven). Cijfers aangepast met toestemming van 14. Fout balken geven SEM van ten minste 3 repliceren experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
6 "src =" / files / ftp_upload / 53919 / 53919fig6.jpg "/>
Figuur 6. Karakterisering van atriale-achtige cardiaal fenotype. QPCR analyse geeft een toename in de expressie van genen atriale en downregulatie van genen geassocieerd met ventriculaire CM in Grem2-behandelde monsters (A). Controleculturen produceren CMS actiepotentiaalduur kenmerk van atriale en ventriculaire cellen, terwijl behandeling met Grem2 genereert celpopulaties met de korte actiepotentiaalduur kenmerk atriale myocyten (B). Monsters werden vergeleken met behulp van Student's t-test. *, P <0,05; *** P <0,001 Cijfers aangepast met toestemming van 14. Fout balken geven SEM van ten minste 3 repliceren experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Video S1. Niet-behandelde controle wells (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden). Kleine, langzaam-aanbestedende zakken of patches van hartspiercellen rond de omtrek van de EB (witte pijlen). Video werd genomen op differentiatie dag 10.
Video S2. Grem2-behandelde wells (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden) . Typische resultaten waargenomen in Grem2-behandelde cellen. Grote stukken snel aanbestedende cellen worden waargenomen in de hele vergulde EB. Video werd genomen op differentiatie dag 10.
| Gen | | Omgekeerde primer (5 'naar 3') | |
| actine | CTACGAGGGCTATGCTCTCCC | CCGGACTCATCGTACTCCTGC |
| GAPDH | CTCACTCAAGATTGTCAGCAATG | GAGGGAGATGCTCAGTGTTGG |
| GATA4 | ACAAGGTCCAAGCCTACTCCA | CTGCGATGTCTGAGTGACAGG |
| Gja1 | ACAAGGTCCAAGCCTACTCCA | CCGGGTTGTTGAGTGTTACAG |
| Gja5 | ATAACAGTGGGCAGTTGAACAGCAG | TACCCAATAACGAATGTGGGAGATG |
| Myh6 | TACACTCTTCTCTACCTATGCTTCT | CACTATCTTCTTGAACTCAATGC |
| Myl2 | AGAGATCGATGAAATGATCAAAGAG | CAGAGCCAAGACTTCCTGTTTATT |
| Myl7 | AAATCAGACCTGAAGGAGACCTATT | CAGAGAGACTTGTAGTCAATGTTGC |
| Nkx2.5 | GTCTCAATGCCTATGGCTAC | CTACGTCAATAAAGTGGGATG |
| TNNT2 | CAGAGGAGGCCAACGTAGAAG | CTCCATCGGGGATCTTGGGT |
Tabel 1. Lijst van qPCR primersequenties. Primer sequenties zijn alfabetisch gerangschikt op naam gen. Sequenties worden verschaft 5 'naar 3' voor alle genen in figuren 5 en 6 geanalyseerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol maakt routinematig kweken met een hoog percentage CM die kenmerkend voor de atriale afkomst zijn. Zoals bij elke differentiatie protocol, moet de kwaliteit van de mESCs voorafgaand aan differentiatie bijzondere aandacht worden besteed. mESCs moeten regelmatig gecontroleerd worden op de juiste morfologie (figuur 1A). Spontane differentiatie die plaatsvindt voorafgaand aan vorming van EBS zal sterk de efficiëntie van cardiogenese beperken en moeten worden verwijderd voordat passage (Figuur 1B). EB grootte heeft ook invloed op cardiogenese. Startcel getallen tussen 200 en 1000 per EB getest en 500 cellen per EB produceert gewoonlijk het hoogste aantal CM. Cellen die zijn gepasseerd de dag voor EB vorming neigen ook efficiënter differentiëren.
De "opknoping drop" methode wordt gebruikt om EBS genereren dit protocol 25. Andere werkwijzen voor het maken EBS gebruikt voor cardiale differentiatie have gerapporteerd 26-29. De "opknoping drop" methode is eenvoudig en goedkoop, gemakkelijk in een laboratorium met gemeenschappelijke celkweek apparatuur en materialen vastgesteld en kan worden uitgevoerd door iemand met ervaring celkweek. Het is veelzijdig, EBS produceren die gemakkelijk kunnen worden gemanipuleerd, overgedragen, geplateerd of verzameld voor RNA analyses volgens de behoeften van de onderzoekers. Het is ook schaalbaar, productie van kleine of grote aantallen EBS behoefte.
Het protocol bepaalt de beplating van EBS op gelatine beklede platen op dag 4 van differentiatie. Deze stap zet differentiëren EBS in de meer typische monolaag format gemeen weefselkweek. In sommige gevallen kan het handiger en of noodzakelijk zijn om de EBS in suspensie plaats plating verlaten. Als suspensie EBS de voorkeur voor verdere toepassingen de cellen kan blijven suspensie tijdens het differentiatieproces plaats van uitgeplaat op dag 4. Bij behandeling with Grem2, worden de EBS in 1,5 ml centrifugebuizen geplaatst en bezinken door de zwaartekracht. Het medium wordt vervolgens zorgvuldig verwijderd met een P1000, waardoor een kleine hoeveelheid achter aspiratie van de EBS voorkomen, en 1,5 ml Grem2 medium wordt toegevoegd aan de buis. Deze suspensie wordt vervolgens overgebracht in een 6 cm petrischaaltje teruggeplaatst bij 37 ° C. De media wordt gewijzigd met de micro centrifugebuis bovenstaande methode om de twee dagen aangegeven.
Differentiatie dag 4 werd gekozen voor de behandeling van cellen met Grem2 gebaseerd op expressie analyse van genen algemeen geassocieerd met grote ontwikkelingsgebeurtenissen. Toevoeging van Grem2 piek na expressie van de merkergenen gastrulatie T Brachyury en Cerberus zoals 1 en bij het begin van expressie van cardiale voorlopercellen merkers zoals Nkx2-5 is essentieel voor zowel cardiogenese en atriale specificatie. Vanwege piek expressie van deze genen enigszins onder cellijnen variabel wordt aanbevolen om de expressie van deze genen controleren tijdens differentiation optimale timing voor Grem2 toevoeging te bepalen. Van de geteste dit protocol lijnen meeste reageerden op behandeling met Grem2 tussen dag 4 en 5 van differentiatie.
Zoals bij elk recombinant eiwit de activiteit van Grem2 varieert van partij tot partij. Het wordt daarom aanbevolen dat Grem2 uit dezelfde partij wordt gebruikt voor elke reeks experimenten om de consistentie te behouden. Wanneer een nieuwe partij wordt gekocht, kan de effectiviteit worden bepaald door het titreren van de dosis in het bereik van 1-5 ug / ml. Dit protocol levert CM's uit de atriale lijn van voldoende aantal voor analyse en cultuur. Cellen die met dit protocol kan worden geanalyseerd via stroomcytometrie, elektrofysiologie, RT-qPCR, of opnieuw gekweekt voor gebruik in live cell assays. Om de identificatie en isolatie van CM's te vergemakkelijken na de cultuur van de αMHC-DsRed-Nuc reporter lijn is ontwikkeld en wordt regelmatig gebruikt door onze laboratorium.
Dit protocol maakt gebruik van serum om gezond te houden cell culturen over de hele differentiatie proces. Hoewel dit protocol routinematig produceert robuuste, atriale-achtige cardiale differentiatie, gebruik van serum introduceert een ongedefinieerd element om de differentiatie proces. Dit kan van nut het protocol wanneer een gedefinieerd medium nodig beperken. Als een bepaalde media voorbereiding nodig is, kan het serum worden vervangen door KnockOut Serum Vervangende 30. Bij het omschakelen naar een gedefinieerde kweekmedia wordt aanbevolen timing en concentratie van Grem2 behandeling opnieuw worden geoptimaliseerd reeds in deze paragraaf beschreven.
RT-qPCR gebruikt om de expressie van specifieke atriale en ventriculaire myocyten genen te kwantificeren. Grem2 behandeling leidt tot een inductie van atriale specifieke genen tijdens het naar beneden reguleren of niet de uitdrukking van ventriculaire genen die van invloed. Dit resultaat is kenmerkend voor Grem2 geïnduceerde CM. Een voorgestelde set van genen voor het beoordelen van atriale identiteit is opgenomen in dit protocol. Een uitgebreide set van gens en een bespreking van hun relevantie te vinden in werken verwezen door dit protocol 14,16. Als het veld blijft evolueren en ons begrip van cardiale differentiatie verbetert is het aanbevolen dat deze lijst van atriale en ventriculaire identiteit markers wordt geëvalueerd en herzien als nodig is.
Het genereren van homogene culturen van CM zal klinisch onderzoek inspanningen gericht op ziekten die bekend is om specifieke cardiale subtypes van invloed zijn en zorgen voor een modelsysteem voor fundamenteel onderzoek gericht op het begrijpen van de mechanismen van de kamer specificatie in gewervelde harten te vergemakkelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH subsidies HL083958 en HL100398 (AKH) en 2T32HL007411-33 "Program in Cardiovascular Mechanismen: Trainen in Investigation '(JB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GMEM | Life Technologies | 11710 | |
| FBS | Life Technologies | 10082 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050 | |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
| ß-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Non-Essential Amino Acids | Sigma | M7145 | |
| 10 cm Tissue Culture Plates | Sarstedt | 83.3902 | |
| 10 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-342 | |
| 6 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-092 | |
| 6-well tissue culture plates | Sarstedt | 83.3920 | |
| Gremlin 2 recombinant protein | R&D Systems | 2069-PR-050 | |
| Sterile filter units | Thermo Fisher | 09-741-02 | |
| Gelatin (from porcine skin) | Sigma | G1890 | |
| 10X PBS, Sterile | Sigma | P5493 | |
| BSA | Sigma | 5470 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA solution | Life Technologies | 25300054 | |
| DPBS, no Calcium, no Magnesium | Life Technologies | 14200 |
References
- Loya, K., Eggenschwiler, R., et al. Hepatic differentiation of pluripotent stem cells. Biological Chemistry. 390 (10), 1047-1055 (2009).
- Narazaki, G., Uosaki, H., et al. Directed and systematic differentiation of cardiovascular cells from mouse induced pluripotent stem cells. Circulation. 118 (5), 498-506 (2008).
- Zhang, Y., Pak, C., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Park, I. H., Arora, N., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Golos, T. G., Giakoumopoulos, M., Garthwaite, M. A. Embryonic stem cells as models of trophoblast differentiation: progress, opportunities, and limitations. Reproduction. 140 (1), 3-9 (2010).
- Boheler, K. R., Czyz, J., Tweedie, D., Yang, H. T., Anisimov, S. V., Wobus, A. M. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells Into cardiomyocytes. Circulation Research. 91 (3), 189-201 (2002).
- Burridge, P. W., Anderson, D., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25 (4), 929-938 (2007).
- Cai, C. L., Liang, X., et al. Isl1 Identifies a cardiac progenitor population that proliferates prior to differentiation and contributes a majority of cells to the heart. Developmental Cell. 5 (6), 877-889 (2003).
- Fujiwara, M., Yan, P., et al. Induction and enhancement of cardiac cell differentiation from mouse and human induced pluripotent stem cells with Cyclosporin-A. PLoS ONE. 6 (2), e16734 (2011).
- Rai, M., Walthall, J. M., Hu, J., Hatzopoulos, A. K. Continuous antagonism by Dkk1 counter activates canonical wnt signaling and promotes cardiomyocyte differentiation of embryonic stem cells. Stem Cells and Development. (1), 54-66 (2012).
- Burridge, P. W., Matsa, E., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Lian, X., Zhang, J., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Zhang, J., Klos, M., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Tanwar, V., Bylund, J. B., et al. Gremlin 2 promotes differentiation of embryonic stem cells to atrial fate by activation of the JNK signaling pathway. Stem Cells. 32 (7), 1774-1788 (2014).
- Kattman, S. J., Witty, A. D., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
- Müller, I. I., Melville, D. B., et al. Functional modeling in zebrafish demonstrates that the atrial-fibrillation-associated gene GREM2 regulates cardiac laterality, cardiomyocyte differentiation and atrial rhythm. Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 332-341 (2013).
- Kattamuri, C., Luedeke, D. M., Thompson, T. B. Expression and purification of recombinant protein related to DAN and cerberus (PRDC). Protein Expression and Purification. 82 (2), 389-395 (2012).
- Schulz, H., Kolde, R., et al. The FunGenES Database: A genomics resource for mouse embryonic stem cell differentiation. PLoS ONE. 4 (9), e6804 (2009).
- Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using Real-Time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Beck, H., Semisch, M., Culmsee, C., Plesnila, N., Hatzopoulos, A. K. Egr-1 regulates expression of the glial scar component phosphacan in astrocytes after experimental stroke. American Journal of Pathology. 173 (1), 77-92 (2008).
- Graham, E. L., Balla, C., Franchino, H., Melman, Y., del Monte, F., Das, S. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
- Sachinidis, A., Fleischmann, B. K., Kolossov, E., Wartenberg, M., Sauer, H., Hescheler, J. Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).
- Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 862-869 (1995).
- Höpfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Volume 2: molecular embryo analysis, live imaging, transgenesis, and cloning. Methods in Molecular Biology. , 254-279 (2004).
- Ao, A., Williams, C. H., Hao, J., Hong, C. C. Modified mouse embryonic stem cell based assay for quantifying cardiogenic Induction Efficiency. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
- Antonchuk, J., Gassmann, M., Desbaillets, I. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWell™ plates. Basic Cell Culture Protocols. 946, 523-533 (2013).
- Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells. Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).
