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Developmental Biology

Differenziazione dei atriale cardiomiociti dalle cellule staminali pluripotenti utilizzando la BMP Antagonista Grem2

Published: March 10, 2016 doi: 10.3791/53919
Automatic Translation
1,2, 1,3
1Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Vanderbilt University School of Medicine, 2Department of Pharmacology, Vanderbilt University, 3Department of Cell & Developmental Biology, Vanderbilt University School of Medicine

Abstract

Protocolli per la generazione di popolazioni di cardiomiociti dalle cellule staminali pluripotenti sono state sviluppate, ma questi in genere produrre cellule di fenotipi misti. I ricercatori interessati a perseguire studi condotti su specifici sottotipi miociti richiedono un approccio più diretto differenziazione. Trattando staminali embrionali (ES) cellule di topo con Grem2, un antagonista BMP secreta che è necessario per la formazione camera atriale in vivo, un gran numero di cellule cardiache con un fenotipo atriale può essere generato. L'utilizzo della linea di cellule staminali pluripotenti Myh6-DsRed-Nuc ingegnerizzato permette l'identificazione, la selezione e la purificazione dei cardiomiociti. In questo protocollo corpi embrionali sono generati dalle cellule Myh6-DsRed-Nuc utilizzando il metodo goccia e mantenute in sospensione fino differenziazione giorno 4 (D4). A cellule d4 sono trattati con Grem2 e placcato su piastre rivestite di gelatina. Tra D8-D10 grandi aree contraenti si osservano nelle culture e continuano ad espandersi e mtura attraverso d14. Molecolare, analisi istologiche e electrophysiogical indicano le cellule in cellule Grem2-trattati acquisiscono caratteristiche atriale-like che forniscono un modello in vitro per studiare la biologia dei cardiomiociti atriali e la loro risposta a vari agenti farmacologici.

Introduction

Le cellule staminali pluripotenti sono un potente strumento per la generazione e lo studio delle cellule da una miriade di difficoltà ai tessuti di accesso per ricerche e studi pre-clinici di base, in particolare negli esseri umani 1-5. Una corretta modulazione delle vie di segnalazione di sviluppo in grado di dirigere la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti al destino fenotipica desiderata. Molti protocolli sono stati sviluppati per generare cardiomiociti (CMS) a partire da cellule staminali pluripotenti 6-14. Questi protocolli comportano generalmente la modulazione di TFGβ superfamiglia (Activin, BMP e TGFβ) e percorsi attraverso temporizzata aggiunta di fattori di crescita esogeni e / o piccole molecole Wnt 10,12-15. Questi protocolli sono generalmente efficace ad aumentare la percentuale di cellule che diventano CMs, ma mancano di specificità, generando una popolazione mista di cellule che rappresentano linee atriale, ventricolare e sistema nodale / conduzione. Al fine di studiare cardiaco specifico sottotipi A appro differenziazione più direttoè necessario ach.

Gremlin2 (Grem2, chiamato anche proteine ​​correlate a Dan e Cerberus o PRDC in breve) è un antagonista BMP secreto che è necessario per una corretta differenziazione cardiaca e la formazione da camera atriale durante lo sviluppo cardiaco in zebrafish 16. Trattare differenziazione delle cellule staminali embrionali con Grem2 alla differenziazione giorno 4, subito dopo picco di espressione di marcatori mesodermici T-brachyury e Cerberus come 1, aumenta la resa della CM e genera un pool di cellule prevalentemente del lignaggio atriale 14.

Ricombinante Grem2 viene usato per trattare le cellule differenziazione e può essere realizzato con proteine ​​standard di tecniche di produzione 17 o possono essere acquistati commercialmente. È altamente solubile in soluzioni acquose e possono essere aggiunte esogenamente per culture al punto di tempo desiderato.

La differenziazione può essere rintracciato tramite RT-qPCR per quantificare l'espressione di marcatori di rappresentantedei progenitori cardiovascolari, i progenitori cardiaci, e impegnato CMS. Immunofluorescenza può anche essere usato per identificare e visualizzare la distribuzione spaziale dei tipi di cellule cardiache.

Le applicazioni che richiedono popolazioni pure vengono più facilmente effettuate quando si utilizza un sistema reporter per identificare e isolare CM. A questo scopo, abbiamo introdotto il αMHC-DsRedNuc costrutto nella linea di cellule del mouse CGR8 ES 14. Cellule CGR8 crescono e restano pluripotenti senza cellule di alimentazione, facilitando saggi di espansione e differenziazione 18. La linea di cellule ES contiene una proteina fluorescente DsRed sequenza codificante con un segnale di localizzazione nucleare sotto l'alfa cardiaca-specifico miosina catena pesante (alfa Mhc o Myh6) promotore del gene. Utilizzando queste cellule, CMS può essere facilmente identificato e isolato per la quantificazione, l'ordinamento delle cellule, elettrofisiologia, schermi di droga, e lo studio dei meccanismi di differenziazione atriale.

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Protocol

1. Preparazione di cellule di coltura, soluzioni e reagenti.

  1. Preparare 500 ml di mouse sulle cellule staminali embrionali (Mesc) mezzi di miscelazione e filtrazione sterile (0,2 micron dimensione dei pori) 445 ml Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM), 50 ml di calore inattivato siero fetale bovino (FBS), 5 ml 100X concentrato L- sostituzione di glutammina, 5 ml ricombinante del mouse leucemia inibitorio Factor (LIF) a 1 x 10 7 unità per ml e 1,43 microlitri ß-mercaptoetanolo (concentrazione finale è di 50 micron). Conservare a 4 ° C fino al momento dell'uso.
  2. Preparare 500 ml di embrioidi corpo (EB) mezzi di differenziazione per miscelazione e sterile filtraggio 391 ml di Iscove Modified Dulbecco Medium (IMDM), 100 ml inattivati ​​al calore FBS, 5 ml 100X concentrato sostituzione L-Glutammina, 5 ml 100X concentrato aminoacidi non essenziali (NEAA), e 2,86 ml ß-Mercaptoethanol (concentrazione finale è 100 micron). Conservare a 4˚ C fino al momento dell'uso.
  3. Preparare 0,2% w/ v di gelatina mescolando 1 g suina gelatina in polvere pelle con 500 ml di filtrato, H 2 O distillata O. Sterilizzare in autoclave. Si noti che la gelatina non sia completamente solubile in acqua a temperatura ambiente. Dopo autoclave la gelatina deve essere completamente sciolto. Conservare a temperatura ambiente fino al momento dell'uso.
  4. Preparare Grem2 aliquote proteina ricombinante sciogliendo 50 mg di pellet di liofilizzato Grem2 in 100 ml tampone fosfato (PBS) integrato con 0,1% BSA per fare un / ml di soluzione 0,5 mg. Aliquota 20 ml di questa soluzione in cinque sterili provette da 1,5 ml centrifuga e conservare a -80˚ C fino al momento dell'uso.
  5. Preparare PBS secondo i protocolli pubblicati o acquisto come uno stock 10X e diluire 1:10 con filtrato, H 2 O distillata per fare un 1X di diluizione 19 di lavoro. Sterilizzare PBS in autoclave prima dell'uso. Conservare a temperatura ambiente fino al momento dell'uso. In alcuni passaggi, DPBS senza Ca 2+ e Mg 2+ utilizzato. Questo è purchased come una soluzione 1X. Informazioni per l'ordine è incluso nella tabella dei reagenti.

2. Preparazione di gelatina rivestito 10 cm Tissue Culture Piatti

  1. In una cappa coltura tissutale sterilizzato aggiungere 5 ml di soluzione di gelatina 0,2% per ogni 10 centimetri piatto di coltura tissutale per il rivestimento. Le stoviglie in incubatore a 37 ° C per almeno 30 minuti o fino a 4 giorni.

3. Preparazione di gelatina rivestito da 6 pozzetti tessuto piastre di coltura

  1. In una cappa coltura tissutale sterilizzato aggiungere 1 ml di 0,2% di gelatina a ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti di coltura tissutale. piastre posto in incubatore a 37 ° C per almeno 30 minuti o fino a 4 giorni.

4. embrionali cultura cellule staminali

  1. mESCs scongelamento
    1. Preparare supporti Mesc riscaldando a RT in una cappa di coltura di tessuti sterilizzati. Aggiungere 10 ml di mezzi RT ad un 10 centimetri piatto di gelatina rivestite.
    2. Rimuovere 1 fiala di mESCs contenente circa 1 x 10 6 cellule provenienti dacrioconservazione. Tenendo esageratamente con le molle, posto in un bagno d'acqua a 37 ° C. Agitare delicatamente fino sospensione cellulare è stato scongelato e solo un piccolo cristallo di ghiaccio rimane nel centro della fiala. Asciugare flaconcino con una usa e getta privo di lanugine pulire e sterilizzare con il 70% EtOH.
    3. In una cappa coltura di tessuti sterili rimuovere le cellule scongelate usando una punta P1000 da esageratamente e trasferimento a 10 centimetri piatto preparato in 4.1.1).
    4. Mettere 10 centimetri piatto in 37 ˚C coltura cellulare umidificata incubatore con 5% di CO 2 e di distribuire uniformemente le cellule muovendo delicatamente la parte anteriore piatto a quella posteriore, poi un lato all'altro. Consentono alle cellule di allegare al piatto O / N o almeno 6 ore.
    5. Per prima cosa i prossimi cellule di controllo mattina per il fissaggio usando un microscopio a campo chiaro. Alcuni detriti cellulari e cellule morte saranno osservati nei media. E 'normale. supporti Aspirare da piatti e sostituire con 10 ml supporti Mesc freschi.
    6. Continuare a cambiare i media sulle cellule ogni giorno per prevenire la differenziazione.
  2. cellule Passage quando il 60-70% confluenti. Preparare cellule per passaging aspirando media e risciacquo con 5 ml di sterile 1X DPBS senza MgCl 2 e CaCl 2. Aggiungere 2 ml di soluzione di 0,05% tripsina-EDTA. Mettere in incubatrice a 37 ° C per 5 minuti.
  3. Mentre le cellule sono incubazione preparare nuovo piatto 10 centimetri aspirando soluzione di gelatina e l'aggiunta di 10 ml di RT Mesc media. Dopo 5 minuti controllare le cellule per il distacco. Se le cellule rimangono attaccate, continuare a incubare a 37 ° C per 2 minuti alla volta fino completamente staccato.
  4. Quench tripsina-EDTA con l'aggiunta di 3 ml di Mesc media. Trasferimento sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 ml e centrifugare a 200 xg per 5 min a pellet. supporti Aspirare dal pellet e risospendere in 10 ml di mezzi Mesc.
  5. A seconda del rapporto di divisione desiderato, aggiungere 0,5-1,0 ml di sospensione cellulare per ogni piatto preparato in fase 4.2.2). Mettere piatto in incubatrice e distribuire uniformemente le cellule spostando leggermente posteriore a quella anteriore, allora una parte all'altra. Tutticellule ow per attaccare O / N o per almeno 12 ore.
    NOTA: Un rapporto di divisione di 1:10-01:20 è comune per la maggior parte delle linee Mesc. Questo rapporto può variare a seconda della linea utilizzato, il numero di passaggio, e confluenza desiderato sul nuovo piatto. Per un frazionamento 1:10 trasferimento rapporto 1 ml di sospensione cellulare in 9 ml mezzi Mesc e piatto in un preparato fresco di gelatina rivestita 10 centimetri piatto.

5. Preparazione di corpi embrionali

NOTA: Tutte le fasi tranne centrifugazione sono eseguite in una cappa sterile coltura di tessuti.

  1. Preparazione di cellule di sospensione in EB media
    1. Al 70% di confluenza (di solito 24-48 ore post-passaggio), utilizzare le cellule per la formazione EB. Preparare cellule per la formazione EB staccando e pellet in base alle sezioni 4.2.1) - 4.2.3).
      Nota: (es., Molto poco la morte delle cellule, nessuna contaminazione, la corretta morfologia) E 'meglio per le cellule di passaggio almeno un tempo di post-disgelo e verificare la salute e la crescita robusta (e.g., raddoppi di popolazione che si verificano ogni 24-48 ore) prima dell'uso per fare EBS.
    2. Risospendere pellet in 5 ml di EB media. Contare le cellule utilizzando un emocitometro o contatore di cellule automatizzato.
    3. Diluire sospensione cellulare in volume richiesto di supporti EB per rendere una concentrazione finale di 25 cellule / microlitro (o 2,5 x 10 3 cellule / ml). Si noti che ogni coperchio di una capsula di Petri contiene circa 60 EBs e richiede circa 1,3 ml di sospensione cellulare. A questo punto, preparare un volume sufficiente di sospensione cellulare per generare il numero desiderato di EBS. Ad esempio, se sono necessari 240 EBs per l'esperimento, preparare 5,2 ml di 2,5 x 10 3 cellule / ml.
      NOTA: mESCs che non vengono utilizzati per la formazione EB possono essere utilizzati per esperimenti futuri riducendo la velocità, ri-sospensione in mezzi Mesc e placcatura come descritto nel paragrafo 4.2.
  2. Creazione di corpi embrionali
    1. Preparare sterili 10 cm Petri-piatti batteriche per appendere formazione delle gocce aggiungendo 2 ml di 1X PBS al fondo each.
    2. Trasferire la sospensione EB dal punto 5.1) ad un lavandino soluzione sterile.
    3. Togliere il coperchio dal preparato capsula di Petri e depositare con cura sessanta, 20 gocce microlitri di sospensione EB sulla superficie interna. Realizzare questo efficiente utilizzando una pipetta multicanale dotato di 6 punte. Ogni goccia 20 ml ora ha 500 cellule.
    4. sostituire delicatamente coperchio sulla metà inferiore del batterica Petri-piatto, facendo attenzione a non staccare appeso gocce. Posizionare i piatti nella cultura incubatore cellulare a 37˚ C. Dopo 2 giorni, le cellule sono pronte per lavare come descritto in 5.3).
  3. Wash-down di corpi embrionali
    Nota: Tutte le fasi di lavaggio-down vengono eseguite in una cappa sterile coltura di tessuti.
    1. Dopo 2 giorni di EB sono pronti per il lavaggio giù e trasferire a 6 cm piastre di Petri batteriche. Pre-caldo 3 ml di EB mezzi per capsula di Petri a RT. Ogni capsula di Petri 6 cm batterica può contenere efficacemente 2 coperchi per un valore di appendere gocce.
      Nota: Assicurarsi di utilizzare un non-rivestito capsula di Petri fo questo passo (vedi tabella materiali). Non usare un piatto di coltura di tessuti o qualsiasi altra superficie che favorisce l'adesione delle cellule. EBs dovrebbero rimanere sospese nei media fino al momento di essere placcato come descritto nella sezione 6.
    2. Rimuovere 10 cm piastre di Petri da incubatore e riporre in cappa di coltura tissutale sterile. Rimuovere con cautela il coperchio con EBS e inclinare ad un angolo di 45 gradi.
    3. Usando una pipetta 5 ml sierologico contenente 3 ml di mezzi RT EB, lavare delicatamente EBs in una piscina in fondo del coperchio. Ispezionare con cura il coperchio per EBs che sono bloccati in superficie e ri-sciacquare, se necessario.
    4. Dopo aver lavato tutti i trasferimenti EBS a una piastra di Petri 6 centimetri.
    5. Ripetere i punti 5.3.2) -5.3.4) per tutte le EBS. Ogni sei centimetri di Petri deve contenere EBs da due coperchi 10 CM. Mettere tutti i piatti di nuovo in incubatore a 37 ° C per altri due giorni.
      NOTA: EBs che sono troppo vicini tra loro in sospensione possono stare insieme e formare grandi aggregati. Questo può avere un impatto negativo cardiaco efficienza differenziazioneoltre a ridurre in modo significativo il numero di disponibili EBS. Per prevenire l'aggregazione, EBS dovrebbe essere controllato ogni giorno e separati muovendo delicatamente avanti e indietro, poi un lato all'altro. L'uso di piatti batteriche nei passaggi differenziazione primi è necessaria per evitare allegato EB al piatto e permettere EBS di crescere in sospensione.

6. placcatura e trattamento di EBs Con Grem2

  1. Preparare terreno di trattamento Grem2 con l'aggiunta di un volume sufficiente di magazzino (0,5 mg / mL) Grem2 medio RT EB per una diluizione finale di 1-5 mg / ml.
    NOTA: La concentrazione efficace per il trattamento di EBs varia a seconda della linea cellulare e l'attività specifica del lotto corrente di Grem2. Si raccomanda che prima di utilizzare la dose viene titolata per trovare la massima efficacia. Per la linea CGR8 Mesc che abitualmente uso di 3-5 mg / ml di Grem2. concentrazioni efficaci di Grem2 per la generazione dei miociti atriale produrrà cellule in rapida contraenti tragiorni 7-8 che sono diffuse nel corso di ogni bene. Se amministrazione fenotipo non si osserva in colture trattate si raccomanda che la dose di Grem2 essere titolata nel range indicato.
  2. Preparare piastre di coltura tissutale 6 pozzetti aspirando soluzione di rivestimento di gelatina da ciascun pozzetto e aggiungendo 2 ml di mezzi di trattamento RT Grem2. Rimuovere EBs da incubatore e riporre in cappa di coltura tissutale sterile.
  3. Utilizzando un P1000 impostato a 100 l di trasferimento 30 EBs da 6 cm capsule di Petri a ciascun pozzetto. Luogo EBs in incubatrice e in modo uniforme disperdono delicatamente spostando piastra posteriore a quella anteriore, allora una parte all'altra.
    1. Dopo EB hanno attaccato al pozzi rivestiti di gelatina, sostituire il supporto Grem2 ogni due giorni fino al giorno 10. Dopo il giorno 10, interrompere il trattamento Grem2 e aggiungere media EB freschi ogni due giorni per mantenere le cellule sane.
      NOTA: Dopo aver fissato, EBS appiattirsi lungo la superficie della piastra rivestita.

7. La dissociazione delle cellule per RT-qPCR Analysis

  1. La dissociazione delle cellule con tripsina-EDTA
    1. Supporti Aspirare da ogni pozzetto e lavare due volte con 1 ml per pozzetto di DPBS sterile meno Ca 2+ e Mg 2+.
    2. Aggiungere 0,5 ml di 0,25% soluzione di tripsina-EDTA sterile in ciascun pozzetto da cui verranno raccolti cellule.
    3. Mettere piatto in incubatrice a 37 ° C per 5 minuti.
    4. Dopo 5 minuti le cellule di controllo per la dissociazione. Se le cellule ancora rimangono attaccati al fondo del rubinetto ben delicatamente per allentare. Se intercettazioni non si allenta le cellule, mettere di nuovo in incubatrice e monitorare ogni 2 minuti fino a quando le cellule sono completamente staccati.
    5. Neutralizzare soluzione tripsina-EDTA con l'aggiunta di 0,5 ml di mezzi EB in ogni pozzetto.
    6. Trasferire intere 1 ml di sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 1,5 ml micro.
    7. Cellule pellet di filatura in una centrifuga da tavolo per 5 min a 300 x g.
    8. Aspirare i media da pellet e passare alla lisi immediatamente o conservare a pellet a -70 C fino al momento per lisi. Lungo-term stoccaggio di pellet non è raccomandato come questo può portare alla degradazione dell'RNA.
  2. Cellulare Lysis e analisi molecolare
    1. A questo punto le cellule sono pronte per l'isolamento di RNA utilizzando un kit di estrazione colonna commerciale oppure usando il reagente di estrazione dell'RNA secondo i protocolli forniti dai produttori (vedi tabella dei materiali). Una volta isolato, invertire RNA trascritto e utilizzare cDNA per l'analisi RT-qPCR utilizzando tecniche standard di 20, 21.
      NOTA: Primer utilizzati da questo laboratorio per RT-qPCR sono elencati nella tabella 1. atriale identità è confermata utilizzando una combinazione di RT-qPCR a guardare l'espressione di geni atriale e ventricolare e elettrofisiologia per azione di registrazione durata del potenziale (vedi paragrafo 8). Una lista di geni è incluso in questo protocollo come esempio di marcatori atriali e ventricolari affidabili. Ulteriori informazioni riguardanti atriale e ventricolare espressione genica nel contesto della differenziazione delle cellule staminali pluripotenti è situato in riferimento 14. </ Li>

8. Analisi elettrofisiologiche

  1. La dissociazione delle cellule con collagenasi
    1. supporti Aspirare da ogni pozzetto e lavare due volte con 1 ml per pozzetto di PBS sterile.
    2. Aggiungere 0,5 ml di 1 mg / ml soluzione di collagenasi in ogni pozzetto.
    3. Mettere piatto in incubatrice a 37 ° C per 10 min.
    4. Dopo 5 minuti le cellule di controllo per la dissociazione. Se le cellule ancora rimangono attaccati tra loro o il fondo del rubinetto ben delicatamente per allentare. Ulteriori dissociare le cellule delicatamente triturazione con un P1000.
      NOTA: per facilitare la patch di registrazioni morsetto cellule deve essere triturato fino ad ottenere una cella singola sospensione.
    5. Aggiungere 0,5 ml supporti EB in ogni pozzetto e mescolare pipettando.
    6. Trasferire intere 1 ml di sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 1,5 ml micro.
    7. Cellule pellet di filatura in una centrifuga da tavolo per 5 min a 300 x g.
    8. supporti Aspirare da pellet cellulari.
    9. le cellule in 500 risospenderemicrolitri di PBS con 10% FBS, avendo cura di triturare in una sospensione singola cella.
  2. Caratterizzazione elettrofisiologici.
    NOTA: Molti ottimi protocolli sono stati pubblicati in questa rivista sull'uso singola patch clamp cellule per misurare potenziali di membrana delle cellule. Per informazioni dettagliate su come eseguire la patch di singola cellula morsetto il lettore novizio si riferisce a questi protocolli 21-24. Di seguito sono riportate informazioni specifiche per questo protocollo che aiuterà l'elettrofisiologo esperto preparare e gestire Mesc deriva CMS per la caratterizzazione del sottotipo.
    1. Preparare soluzione di registrazione intracellulare composto dai seguenti: 10 mm tampone HEPES, 5 mM MgATP, 2 mM EGTA, 110 mm glutammato di potassio, 10 mM KCl, e 10 mm di NaCl. Regolare soluzione a pH 7,2 con NaOH.
    2. Preparare una soluzione composta di seguenti registrazione extracellulare (vasca): 2 mM HEPES, 10 mM di glucosio, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5.4 mM KCl, e 137mM NaCl. Regolare soluzione a pH 7,4 con NaOH.
    3. Preparare una pipetta di vetro che misura 2-5 resistenza MW quando riempito con soluzione di registrazione utilizzando il vetro borosilicato di serie con filamento.
    4. Trasferire 100 ml di cellule sospese in camera di registrazione contenenti soluzione di registrazione extracellulare con un P200.
      NOTA: Le cellule possono essere combinati in sospensione o, per facilitare la manipolazione e l'uso per il trattamento farmacologico e / o saggi di perfusione, possono essere seminate su un vetrino rivestito di gelatina, come indicato in 8.2.5).
    5. Preparare rivestito gelatina vetrini mettendo un diametro di 10 millimetri vetrino di vetro in ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti e copertura con soluzione di gelatina, come descritto nella sezione 3.1) di questo protocollo.
      1. Dopo almeno 30 minuti soluzione aspirare gelatina e aggiungere 100 ml di cellule sospese direttamente al coprioggetto e mettere tutta la piastra da 6 pozzetti in incubatrice per almeno 2 ore o fino a quando le cellule hanno attaccato. Dopo che le cellule hanno attaccato, rimuovi vetrino e mettere in registrazione da camera con soluzione di registrazione extracellulare.
        NOTA: Se si utilizza la linea di fluorescenza Mesc giornalista cardiaca αMHC-DsRed, CM può essere identificato con i loro nuclei rosso fluorescente. Se non si utilizza una linea giornalista cardiaco, le cellule spontaneamente contraenti possono essere osservate e isolati per le misurazioni. cellule staminali pluripotenti derivate CMS sono solitamente più piccoli e più arrotondata, manca la morfologia caratteristica rettangolare completamente formata adulti miociti cardiaci.
    6. Fai tutte le registrazioni a 37 ° C. Patch singole cellule utilizzando tutta la fascetta cellulare in modalità di corrente-clamp con una pipetta di vetro borosilicato di 2-5 resistenza MW. Utilizzare una leggera pressione negativa per raggiungere sigillo gigaohm prima di ottenere tutta l'accesso delle cellule. Applicare una rapida pressione negativa alla rottura della membrana e di ottenere tutta l'accesso cella prima di registrare potenziali di membrana.
    7. Evocare potenziali d'azione con 4 msec depolarizzanti iniezioni di corrente.
      NOTA:Per PSC-derivato CM la quantità di corrente necessaria per innescare riproducibile potenziali d'azione possono variare. Al fine di trovare corrente di soglia ottimale, cominciare ad un relativamente bassa ampiezza corrente e aumento innescando in modo graduale fino a potenziali d'azione riproducibili si ottengono.
      NOTA: Azione potenziali durate per miociti atriali Grem2-indotti sono di solito nel range di 20-40 ms e la mancanza di una fase di plateau (Figura 6B).

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Representative Results

Prima di differenziazione, le cellule staminali pluripotenti dovrebbero essere compatto e privo di differenziazione spontanea. Le cellule mostrati nella Figura 1A sono pronti per essere singolarizzati e utilizzato per appendere gocce come descritto in 5.1 della sezione del protocollo. Le cellule illustrati nella Figura 1B sono spontaneamente la differenziazione e non devono essere utilizzati per la preparazione di gocce sospese.

I pannelli inclusi in figura 2 mostrano EBs formate con successo al giorno differenziazione 2. Qualità EBs generalmente migliore forma all'interno uniformemente distanziate, appeso ben arrotondati gocce, come illustrato nella figura 2. Con la differenziazione giorno 2, EBS dovrebbe essere visibile ad occhio nudo, come accordi sferici di differenziazione delle cellule staminali alle punte delle gocce sospese (Figura 2). Questi corpi elementari sono pronti per wash-down, come descritto nella sezione 5.3 del protocollo.

Durante i giorni 2-4, EBS lavato-down in sospensione dovrebbe continuare a crescere in dimensioni. Al giorno 4, EBS ben formati dovrebbero essere liberi di fluttuare e omogenee per forma e dimensioni (Figura 3). EBS mostrati nella Figura 3 sono pronti per essere trasferiti a piastre pre-rivestito e trattato con Grem2 come descritto nel 6.1-6.3 della sezione protocollo.

Una volta placcato, EBs dovrebbe appiattire come cellule migrano dalla EB sulla superficie della piastra di coltura tissutale. Mostrato in Figura 4 sono esempi di EBs collegato correttamente a giorni di differenziazione 8 (pannello di sinistra) e 10 (pannello di destra). Le cellule devono continuare a essere monitorati ogni giorno per essere sicuri che rimangono attaccati e per verificare la differenziazione cardiaca come descritto di seguito.

cellule contraente, indicando la presenza di CMS, si può osservare già nel giorno6 e il più tardi il giorno 9. In genere, le cellule contraenti presente al giorno 8 di differenziazione. Il numero di contrarre le cellule in ciascun pozzetto dovrebbero continuare ad aumentare attraverso la differenziazione giorno 14. Nel settore non-trattati pozzetti di controllo si osservano piccoli, patch contraenti lentamente (Video S1), mentre in Grem2 pozzi trattati grandi macchie con un tasso di amministrazione relativamente veloce sono comuni ( Video S2). Occasionalmente, differenziazione cardiaca non riesce a verificarsi. In questi casi i tempi di trattamento Grem2, l'attività della proteina, e lo stato delle cellule prima di differenziazione dovrebbe essere nuovamente valutato per essere sicuri che ciascuna di queste condizioni è ottimizzato come descritto in questo protocollo (vedi la discussione).

La Figura 5 mostra i risultati tipici di culture Grem2-trattati e controlli non trattati. analisi RT-qPCR dell'espressione genica in cellule raccolte e lisate come descritto nella 7,1-7,2 della sezione protocollo tipicamente rivelare alta levels di geni strutturali e normativi cardiaci nelle culture Grem2-trattati (Figura 5A). Se si utilizza la linea cellulare αMHC-DsRed-Nuc, l'aumento della resa di CM può essere osservata visualmente come numeri più alti di nuclei DsRed-etichettati in pozzi Grem2-trattati (Figura 5B, pannello in basso).

Oltre a generare un maggior numero di CM, trattamento Grem2 polarizza anche differenziamento verso un fenotipo atriale come. Il fenotipo atriale è solitamente confermata in due modi. In primo luogo, l'analisi RT-qPCR di cellule raccolte come descritto nella 7,1-7,2 della sezione di protocollo dovrebbe rivelare che i geni caratteristici di atriale CM sono sovraregolati mentre i geni ventricolari sono inibiti (figura 6A). In secondo luogo, le misure di patch clamp di azione cellulare durata del potenziale (come descritto nella 8,1-8,2 della sezione di protocollo) rivela che un breve, atriale simile potenziale d'azione predomina tra Grem2 treate cellule d (Figura 6b).

Figura 1
Figura 1. topo le cellule staminali embrionali rappresentativi (mESCs). Topo pluripotenti le cellule staminali embrionali prima della formazione EB con la caratteristica grande nucleo, compatto morfologia formanti colonie (A, frecce nere), e bordi bianchi di fase (A, frecce arancioni). Differenziazione spontanea di cellule ES di topo è indicato da più grandi, singole cellule separate dalle colonie (B, frecce nere) e la perdita di confine di fase attorno colonie (B, freccia arancione). Le immagini catturate utilizzando un microscopio a contrasto di fase invertito. Barre di scala rappresentano 50 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

1 "> figura 2
Figura 2. corpi embrionali (EBS) al giorno 2 di differenziazione. Hanging gocce sospese da un coperchio capsula di Petri (a sinistra, barra della scala è di 2 cm) sono distribuiti uniformemente ed omogeneo in termini di dimensioni. EB in gocce appesi sono stati osservati come sfere compatte al centro di ogni goccia (a destra, barra della scala è di 1 mm). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. EBs in sospensione al giorno 4 di differenziazione. Ideale EBs dovrebbero essere omogenea per dimensione e forma con il minimo rispetto all'altro oppure il fondo della piastra. Le immagini sono state acquisite utilizzando un ambito dissezione in condizioni sterili. barra della scala rappresenta 100 micron.carico / 53919 / 53919fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. La morfologia tipica EB dopo la placcatura. Placcato EBs a giorni 8 (a sinistra) e 10 (a destra) di differenziazione. Come EB allegare alle piastre gelatinizzati, si appiattiscono e appaiono come centri densi circondate da un monostrato sempre più confluenti di cellule. Piccole sacche di contrarre le cellule sono generalmente osservati intorno ai giorni di differenziazione 6-8 nei pressi del centro della EB. Queste tasche continuano ad espandersi in tutto il protocollo di differenziazione per formare grandi fogli di contrarre le cellule nelle monostrati circostanti. Le immagini catturate utilizzando un microscopio a contrasto di fase invertito e. Barre di scala rappresentano 200 micron. Cliccate qui per visualizzare un più grande versione di questa figura.

Figura 5
Figura 5. cardiaco differenziazione in pozzetti di controllo Grem2-trattati e non trattati. Analisi qPCR dei marcatori cardiaci indica un aumento di espressione del gene cardiaco in EBs trattati con Grem2 fin dal sesto giorno e per tutta il giorno 10 di differenziazione (A). La linea cellulare αMHC-DsRed-Nuc ingegnerizzato mostra grandi piscine di DsRed marcato CM nelle colture trattate con Grem2 (B, in basso) vs controlli non trattati (B, in alto). Figure adattato con il permesso di 14. Le barre di errore rappresentano SEM di almeno 3 esperimenti replicati. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

6 "src =" / files / ftp_upload / 53919 / 53919fig6.jpg "/>
Figura 6. Caratterizzazione del fenotipo cardiaco atriale-like. Analisi qPCR indica un aumento dell'espressione di geni atriali e sottoregolazione di geni associati con CMS ventricolari nei campioni Grem2-trattati (A). Colture di controllo producono CMS con potenziale d'azione caratteristica durata cellule atriali e ventricolari mentre il trattamento con Grem2 genera popolazioni cellulari con il corto potenziale d'azione caratteristica durata miociti atriali (B). I campioni sono stati confrontati con test t di student. *, P <0,05; ***, P <0.001 Figure adattato con il permesso di 14. Le barre di errore rappresentano SEM di almeno 3 esperimenti replicati. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

"Video Video S1. Pozzetti di controllo non trattato (tasto destro per il download). Tasche piccole, lentamente-contraenti o macchie di miociti cardiaci intorno alla periferia della EB (frecce bianche). Il video è stata presa a differenziazione giorno 10.

Video S2
Video S2. Pozzi Grem2-trattati (Tasto destro del mouse per scaricare) . I risultati tipici osservati in cellule Grem2-trattati. Grandi macchie di cellule contraenti rapidamente sono stati osservati in tutto il EB placcato. Il video è stata presa a differenziazione giorno 10.

Gene Reverse Primer (5 'a 3')
actina CTACGAGGGCTATGCTCTCCC CCGGACTCATCGTACTCCTGC
GAPDH CTCACTCAAGATTGTCAGCAATG GAGGGAGATGCTCAGTGTTGG
Gata4 ACAAGGTCCAAGCCTACTCCA CTGCGATGTCTGAGTGACAGG
GJA1 ACAAGGTCCAAGCCTACTCCA CCGGGTTGTTGAGTGTTACAG
Gja5 ATAACAGTGGGCAGTTGAACAGCAG TACCCAATAACGAATGTGGGAGATG
Myh6 TACACTCTTCTCTACCTATGCTTCT CACTATCTTCTTGAACTCAATGC
MYL2 AGAGATCGATGAAATGATCAAAGAG CAGAGCCAAGACTTCCTGTTTATT
Myl7 AAATCAGACCTGAAGGAGACCTATT CAGAGAGACTTGTAGTCAATGTTGC
Nkx2.5 GTCTCAATGCCTATGGCTAC CTACGTCAATAAAGTGGGATG
Tnnt2 CAGAGGAGGCCAACGTAGAAG CTCCATCGGGGATCTTGGGT

Tabella 1. Elenco delle qPCR sequenze di primer. Primer sequenze sono elencati in ordine alfabetico per nome del gene. Le sequenze sono forniti 5 'a 3' per tutti i geni analizzati nelle figure 5 e 6.

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Discussion

Questo protocollo produce ordinariamente culture con una elevata percentuale di CMS che sono caratteristici della stirpe atriale. Come con qualsiasi protocollo di differenziazione, la qualità delle mESCs prima di differenziazione dovrebbe essere data particolare attenzione. mESCs dovrebbero essere monitorati di routine per una corretta morfologia (Figura 1A). Qualsiasi differenziazione spontanea che si verifica prima della formazione di EB si limitano fortemente l'efficienza del cardiogenesis e deve essere rimosso prima di passaging (Figura 1B). dimensione EB colpisce anche cardiogenesis. numero di cellule che iniziano tra i 200 ei 1.000 per EB sono stati testati e 500 cellule per EB produce abitualmente il maggior numero di CMS. Le cellule che vengono fatte passare il giorno prima della formazione EB tendono a differenziarsi in modo più efficiente.

Il metodo "appeso a goccia" viene utilizzato per generare EB in questo protocollo 25. Altri metodi per rendere EBs utilizzati per cardiaco differenziazione ettarisono già stati segnalati 26-29. Il metodo "appeso drop" è semplice e poco costoso, facilmente adottata in qualsiasi laboratorio con apparecchiature colture cellulari comune e materiali, e può essere effettuata da chiunque abbia esperienza coltura cellulare. E 'anche versatile, producendo EBs che possono essere facilmente manipolati, trasferiti, placcato, o raccolti per l'RNA analisi in base alle esigenze dei ricercatori. E 'anche scalabile, producendo numeri piccole o grandi di EBS, se necessario.

Il protocollo impone il fasciame di EBs su piastre rivestite di gelatina al 4 ° giorno di differenziazione. Questo passaggio converte differenziare EBs nel più tipico formato di monostrato comune a coltura di tessuti. In alcuni casi può essere più conveniente eo necessario liberare EBS in sospensione anziché placcatura. Se EBs sospensione sono preferiti per applicazioni a valle le cellule possono essere lasciati in sospensione durante il processo di differenziazione invece di essere placcato al giorno 4. Durante il trattamento ingegnoh Grem2, EBS sono posti in 1,5 ml provette da centrifuga e lasciato sedimentare per gravità. Il supporto viene poi accuratamente rimosso con un P1000, lasciando una piccola quantità dietro per evitare l'aspirazione di EBS, e viene aggiunto 1,5 ml Grem2 materiale al tubo. Questa sospensione viene quindi trasferito in una capsula di Petri 6 cm e ritorna nel 37 ° C. Il supporto viene modificato utilizzando il metodo del tubo centrifuga micro sopra indicato ogni due giorni.

Differenziazione giorno 4 è stato scelto per il trattamento delle cellule con Grem2 sulla base di analisi di espressione dei geni generalmente associati a grandi eventi dello sviluppo. L'aggiunta di Grem2 dopo picco di espressione dei geni marcatori gastrulazione T brachyury e Cerberus come 1 e al momento della comparsa di espressione dei marcatori di cellule progenitrici cardiache come NKX2-5 è fondamentale sia per cardiogenesis e le specifiche atriale. Poiché picco espressione di questi geni può variare leggermente tra linee cellulari si raccomanda di controllare l'espressione di questi geni durante differentiation per determinare tempistica ottimale per Grem2 aggiunta. Delle linee testati per questo protocollo, più risposto al trattamento con Grem2 tra i giorni 4 e 5 di differenziazione.

Come con qualsiasi proteina ricombinante, l'attività di Grem2 varia da lotto a lotto. Si raccomanda pertanto che Grem2 dallo stesso lotto è utilizzato per ogni serie di esperimenti per mantenere la coerenza. Quando un nuovo lotto è stato acquistato, efficacia può essere valutata mediante titolazione della dose nell'intervallo di 1-5 mg / ml. Questo protocollo produce CM della stirpe atriale di numero sufficiente per l'analisi e la cultura. Le cellule prodotte utilizzando questo protocollo possono essere analizzati tramite citometria a flusso, elettrofisiologia, RT-qPCR, o ri-coltura per l'utilizzo in saggi cellulari dal vivo. Per facilitare l'identificazione e l'isolamento di CM, dopo la cultura della linea giornalista αMHC-DsRed-Nuc è stato sviluppato ed è abitualmente utilizzato dal nostro laboratorio.

Questo protocollo utilizza siero per mantenere in buona salute cell culture in tutto il processo di differenziazione. Mentre questo protocollo produce routine robusta, differenziazione cardiaca atriale-like, uso di siero introduce un elemento indefinito al processo di differenziazione. Ciò può limitare l'utilità del protocollo nei casi in cui è richiesta una media più definita. Se è necessaria una preparazione media più definito, il siero può essere sostituito per KO siero sostituzione 30. Quando si passa ad un terreno di coltura definito è consigliabile sincronizzazione e la concentrazione di trattamento Grem2 essere nuovamente ottimizzati come già descritto in questa sezione.

RT-qPCR viene utilizzato per quantificare l'espressione di geni specifici per i miociti atriali e ventricolari. trattamento Grem2 porta ad una induzione di geni specifici atriali mentre regolazione verso il basso o non influenzano l'espressione di geni ventricolari. Questo risultato è tipico per CMS Grem2-indotte. Un insieme suggerito di geni per la valutazione identità atriale è compresa in questo protocollo. Un set esteso di genes ed una discussione di loro pertinenza possono essere trovati in opere di riferimento da questo protocollo 14,16. Come il campo continua ad evolversi e la nostra comprensione di differenziazione cardiaca migliora, si raccomanda che questa lista dei marcatori di identità atriali e ventricolari è valutato e rivisto, se necessario.

Generazione di culture omogenee di CMS facilitare gli sforzi di ricerca clinica focalizzati sulle malattie noti per influenzare specifici sottotipi cardiaci e fornire un sistema modello per la ricerca di base incentrata sulla comprensione dei meccanismi di specifica camera nei cuori vertebrati.

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Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto da NIH sovvenzioni HL083958 e HL100398 (AKH) e 2T32HL007411-33 "Programmi in meccanismi cardiovascolari: Formazione in Investigation" (JB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GMEM Life Technologies 11710
FBS Life Technologies 10082
Glutamax Life Technologies 35050
LIF EMD Millipore ESG1107
ß-Mercaptoethanol Sigma M3148
IMDM Sigma I3390
Non-Essential Amino Acids Sigma M7145
10 cm Tissue Culture Plates Sarstedt 83.3902
10 cm Bacterial Petri Dishes VWR 25384-342
6 cm Bacterial Petri Dishes VWR 25384-092
6-well tissue culture plates Sarstedt 83.3920
Gremlin 2 recombinant protein R&D Systems 2069-PR-050
Sterile filter units Thermo Fisher 09-741-02
Gelatin (from porcine skin) Sigma G1890
10X PBS, Sterile Sigma P5493
BSA  Sigma 5470
0.05% Trypsin-EDTA solution Life Technologies 25300054
DPBS, no Calcium, no Magnesium Life Technologies 14200

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References

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Biologia dello Sviluppo Numero 109 cellule staminali pluripotenti atriale cardiaca differenziazione proteina morfogenetica (BMP) di segnalazione BMP Antagonista Gremlin 2 (Grem2) proteina correlata a Dan e Cerberus (PRDC)
Differenziazione dei atriale cardiomiociti dalle cellule staminali pluripotenti utilizzando la BMP Antagonista Grem2
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Bylund, J. B., Hatzopoulos, A. K. Differentiation of Atrial Cardiomyocytes from Pluripotent Stem Cells Using the BMP Antagonist Grem2. J. Vis. Exp. (109), e53919, doi:10.3791/53919 (2016).

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