Abstract
Les protocoles pour produire des populations de cardiomyocytes à partir de cellules souches pluripotentes ont été développés, mais ceux-ci donnent généralement des cellules de phénotypes mixtes. Les chercheurs intéressés à poursuivre des études impliquant des sous-types de myocytes spécifiques nécessitent une approche de différenciation plus dirigée. Par traitement de souris souches embryonnaires (ES) avec des cellules Grem2, un antagoniste de BMP sécrétées qui est nécessaire pour la formation de la chambre auriculaire in vivo, un grand nombre de cellules cardiaques avec un phénotype auriculaire peut être généré. L'utilisation de la lignée de cellules souches conçu Myh6-DsRed-NUC pluripotentes permet l'identification, la sélection et la purification des cardiomyocytes. Dans ce protocole corps embryoïdes sont générés à partir de cellules Myh6-DsRed-NUC selon la méthode de goutte suspendue et maintenues en suspension jusqu'à ce jour de différenciation 4 (d4). A cellules d4 sont traités avec Grem2 et étalées sur des plaques de gélatine revêtues. Entre d8-d10 grandes surfaces contractantes sont observées dans les cultures et continuent de se développer et mature par d14. Moléculaire, des analyses histologiques et electrophysiogical indiquent les cellules dans les cellules Grem2 traitées acquièrent des caractéristiques atriaux comme fournissant un modèle in vitro pour étudier la biologie des cardiomyocytes auriculaires et leur réponse à divers agents pharmacologiques.
Introduction
Les cellules souches pluripotentes sont un outil puissant pour générer et étudier les cellules à partir d' une multitude de tissus difficiles à l'accès à des études de recherche et pré-cliniques de base, en particulier chez les humains 1-5. la modulation appropriée des voies de signalisation de développement peut diriger la différenciation des cellules souches pluripotentes au sort phénotypique souhaitée. De nombreux protocoles ont été développés pour générer des cardiomyocytes (SGC) à partir de cellules souches pluripotentes 6-14. Ces protocoles comportent généralement une modulation de la superfamille TFGβ (activine, BMP et TGF) et les voies Wnt par addition temporisée de facteurs de croissance exogènes et / ou des petites molécules 10,12-15. Ces protocoles sont généralement efficaces pour augmenter le pourcentage de cellules qui deviennent CMme, mais manquent de spécificité, la génération d'une population mixte de cellules de lignées représentant auriculaire, ventriculaire et nodal du système / de conduction. Afin d'étudier cardiaque spécifique sous-types d'un appro de différenciation plus orientéeach est nécessaire.
Gremlin2 (Grem2, également appelée protéine apparentée à Dan et Cerberus ou PRDC pour faire court) est un antagoniste BMP sécrétée qui est nécessaire pour la différenciation cardiaque adéquate et la formation de chambre auriculaire au cours du développement cardiaque chez le poisson zèbre 16. Le traitement de différenciation des cellules souches embryonnaires avec Grem2 à la différenciation jour 4, juste après expression pic de marqueurs mésodermiques T-brachyury et Cerberus comme 1, augmente le rendement de la CMS et génère un pool de cellules principalement de la lignée auriculaire 14.
Grem2 recombinant est utilisé pour traiter les cellules différenciées et peut être effectuée en utilisant des techniques 17 de production de protéines standard ou peuvent être achetés dans le commerce. Il est très soluble dans les solutions aqueuses et peut être ajoutée de manière exogène à la culture au point de temps souhaité.
Différenciation peut être suivi par RT-qPCR pour quantifier l'expression des marqueurs représentantdes progéniteurs cardiovasculaires, progéniteurs cardiaques, et engagés Cms. Immunofluorescence peut également être utilisée pour identifier et visualiser la répartition spatiale des types de cellules cardiaques.
Les applications qui requièrent des populations pures sont plus facilement réalisées en utilisant un système rapporteur pour identifier et isoler Cms. A cet effet, nous avons introduit la αMHC-DsRedNuc construire dans la lignée de cellules de souris CGR8 ES 14. Cellules CGR8 grandissent et restent pluripotentes sans cellules nourricières, ce qui facilite l' expansion et la différenciation des essais 18. La lignée cellulaire ES contient une protéine fluorescente DsRed séquence codante avec un signal de localisation nucléaire sous l'alpha cardiaque spécifique chaîne myosine lourd (a Mhc ou Myh6) promoteur du gène. L'utilisation de ces cellules, CMs peut être facilement identifié et isolé pour la quantification, le tri cellulaire, électrophysiologie, écrans de drogue, et les mécanismes de différenciation auriculaire étudier.
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Protocol
1. Préparation de la cellule Culture Media, Solutions et réactifs.
- Préparer 500 ml de souris les cellules souches embryonnaires (Mesc) supports par mélange et filtration stérile (0,2 um de taille des pores) 445 ml Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM), 50 ml inactivé par la chaleur du sérum de fœtus bovin (FBS), 5 ml 100X concentrée L- remplacement de la glutamine, 5 ul de souris recombinante leucémie facteur inhibiteur (LIF) à 1 x 10 7 unités par ml et 1,43 ul de ß-mercaptoéthanol (concentration finale 50 uM). Conserver à 4 ° C jusqu'à utilisation.
- Préparer 500 ml de embryoïdes Body (EB) médias de différenciation par mélange et stérile filtrage 391 ml Iscove modifié Dulbecco (IMDM), 100 ml de chaleur FBS inactivé, 5 ml 100X concentré remplacement de L-glutamine, 5 ml 100X concentré acides aminés non essentiels (NEAA), et 2,86 ul de ß-mercaptoéthanol (concentration finale est de 100 uM). Entreposer à 4˚ C jusqu'à utilisation.
- Préparer 0,2% en poids/ volume de gélatine en mélangeant 1 g de gélatine de porc en poudre de peau avec 500 ml de filtration, l' eau distillée 2 O. Stériliser par autoclavage. Notez que la gélatine peut ne pas être complètement soluble dans l'eau à température ambiante. Après autoclavage la gélatine doit être complètement dissous. Stocker à température ambiante jusqu'à utilisation.
- Préparer Grem2 aliquotes de protéine recombinante en dissolvant 50 ug pastille de lyophilisé Grem2 dans 100 phosphate ul solution saline tamponnée (PBS) additionné de 0,1% de BSA pour faire un / ul solution mère à 0,5 pg. Aliquoter 20 pi de cette solution mère en cinq stériles tubes de 1,5 ml de centrifugeuse et stocker à -80˚ C jusqu'à utilisation.
- Préparer PBS selon des protocoles ou d' achat publiés comme un stock 10X et diluer 1:10 avec de filtre, H 2 O distillée pour faire une 1X dilution 19 de travail. Stériliser PBS par autoclavage avant de les utiliser. Stocker à température ambiante jusqu'à utilisation. Dans certaines étapes, DPBS sans Ca 2+ et Mg 2+ est utilisé. Ceci est purchased comme une solution 1X. Informations de commande est inclus dans la table des réactifs.
2. Préparation de Gelatin Coated 10 cm Tissue Culture Plats
- Dans une hotte de culture tissulaire stérile ajouter 5 ml d'une solution de gélatine à 0,2% à chaque boîte de 10 cm pour culture de tissus pour le revêtement. Placer la vaisselle dans l'incubateur à 37 ° C pendant au moins 30 minutes ou jusqu'à 4 jours.
3. Préparation de Gelatin Coated 6 puits de culture de tissu Plaques
- Dans une hotte de culture tissulaire stérile ajouter 1 ml de gélatine à 0,2% à chaque puits d'une plaque de culture tissulaire à 6 puits. La place des plaques dans l'incubateur à 37 ° C pendant au moins 30 minutes ou jusqu'à 4 jours.
4. Embryonic Culture de cellules souches
- mESCs dégel
- Préparer des milieux Mesc en réchauffant à la température ambiante dans une hotte de culture tissulaire stérile. Ajouter 10 ml de milieu RT à une boîte de 10 cm revêtu de gélatine.
- Retirer 1 flacon de mESCs contenant environ 1 x 10 6 cellules decryoconservation. Tenir cryovial avec des pinces, placer dans un bain d'eau à 37 ° C. Remuer doucement jusqu'à ce que la suspension cellulaire a décongelé et seulement un petit cristal de glace reste dans le centre du flacon. Sécher avec un flacon non pelucheux lingette jetable et stériliser avec 70% EtOH.
- Dans une hotte de culture de tissus stériles éliminer les cellules décongelés en utilisant une pointe de P1000 de cryovial et transfert à 10 cm plat préparé au point 4.1.1).
- Placez boîte de 10 cm en 37 ˚C culture cellulaire incubateur humidifié avec 5% de CO 2 et de répartir uniformément les cellules en déplaçant doucement l'avant de la plaque à l' arrière, puis côté à l' autre. Permettre aux cellules de se fixer à la plaque O / N ou au moins 6 heures.
- La première chose que les prochaines cellules de contrôle du matin pour la fixation à l'aide d'un microscope à champ lumineux. Certains débris cellulaires et les cellules mortes seront observées dans les médias. C'est normal. Aspirer le milieu de la vaisselle et les remplacer par 10 ml de milieu Mesc frais.
- Continuer à changer de support sur les cellules chaque jour pour prévenir la différenciation.
- des cellules de passage lorsque 60 à 70% confluentes. Préparer les cellules pour repiquage par aspiration médias et rinçage avec 5 ml stérile 1X DPBS sans MgCl2 et CaCl2. Ajouter une solution de trypsine-EDTA 2 ml 0,05%. Placer dans un incubateur à 37 ° C pendant 5 min.
- Alors que les cellules sont en incubation, préparer une nouvelle boîte de 10 cm par aspiration solution de gélatine et en ajoutant 10 ml de RT MESC médias. Après 5 min de vérifier les cellules du détachement. Si les cellules restent attachés, continuer à incuber à 37 ° C pendant 2 minutes à la fois jusqu'à complètement détaché.
- Quench trypsine-EDTA en ajoutant 3 ml de MESC médias. Transférer la suspension cellulaire à un tube de 15 ml de centrifugeuse et de spin à 200 xg pendant 5 min pour sédimenter. Aspirer le milieu de culot et remettre en suspension dans 10 ml de milieu Mesc.
- Selon le rapport de division désiré, ajouter 0,5-1,0 ml de suspension cellulaire à chaque plat préparé à l'étape 4.2.2). Placez plat dans l'incubateur et répartir uniformément les cellules en déplaçant doucement vers l'avant puis côté à l'autre. Toutcellules ow pour fixer O / N ou pendant au moins 12 heures.
NOTE: Un rapport de division de 1 heures 10-à-1:20 est commun pour la plupart des lignes Mesc. Ce rapport peut varier en fonction de la ligne utilisée, le numéro de passage et la confluence souhaité sur la nouvelle antenne. Pour un transfert 1:10 split rapport 1 ml de suspension cellulaire dans 9 ml de milieu Mesc et de la plaque dans une boîte de 10 cm revêtu de gélatine fraîchement préparée.
5. Préparation de corps embryoïdes
NOTE: Toutes les étapes sauf centrifugation sont effectuées dans une hotte de culture tissulaire stérile.
- Préparation de la suspension cellulaire dans EB médias
- À 70% de confluence (généralement 24-48 h post-passage), utiliser les cellules pour la formation EB. Préparer les cellules pour la formation EB en détachant et pastillage selon les sections 4.2.1) - 4.2.3).
Note: (. Par exemple, très peu de la mort cellulaire, pas de contamination, de la morphologie correcte) Il est préférable de cellules de passage au moins un temps de post-dégel et vérifier pour la santé et la croissance robuste (e.g., doublements de population se produisent chaque 24-48 h) avant d'utiliser pour la fabrication de ballasts électroniques. - Re-suspendre le culot dans 5 ml EB médias. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre ou compteur de cellules automatisé.
- Diluer la suspension de cellules dans le volume requis de milieu EB pour obtenir une concentration finale de 25 cellules / ul (ou 2,5 x 10 3 cellules / ml). A noter que chaque couvercle d'une boîte de pétri contient environ 60 ballasts électroniques et nécessite environ 1,3 ml de suspension cellulaire. A ce stade, préparer un volume suffisant de suspension de cellules pour générer le nombre voulu de ballasts électroniques. Par exemple, si 240 ballasts électroniques sont nécessaires pour l' expérience, préparer 5,2 ml à 2,5 x 10 3 cellules / ml.
NOTE: mESCs qui ne sont pas utilisés pour la formation EB peuvent être utilisés pour des expériences futures en faisant tourner vers le bas, remise en suspension dans des milieux Mesc et placage comme décrit dans la section 4.2.
- À 70% de confluence (généralement 24-48 h post-passage), utiliser les cellules pour la formation EB. Préparer les cellules pour la formation EB en détachant et pastillage selon les sections 4.2.1) - 4.2.3).
- Création de corps embryoïdes
- Préparer stériles de 10 cm des boîtes de Pétri bactériennes pour suspendre la formation de gouttes par addition de 2 ml de 1 x PBS au fond de l'each.
- Transfert EB suspension de l'étape 5.1) à un bassin de solution stérile.
- Retirer le couvercle de boîte de Pétri préparée et déposer soigneusement soixante, 20 gouttes ul de EB suspension sur la surface intérieure. Accomplir ceci efficacement à l'aide d'une pipette multi-canaux équipé de 6 conseils. Chaque goutte de 20 pi a maintenant 500 cellules.
- Replacez délicatement le couvercle sur la moitié inférieure de la boîte de Pétri bactérienne, en faisant attention à ne pas déloger gouttes pendaison. Placez les plats dans la culture cellulaire incubateur à 37˚ C. Après 2 jours, les cellules sont prêtes pour laver comme décrit en 5.3).
- Wash-down de corps embryoïdes
Note: Toutes les étapes de lavage vers le bas sont réalisées dans une hotte de culture tissulaire stérile.- Après 2 jours EB de sont prêts pour le lavage et le transfert de boîtes de 6 cm de Pétri bactériennes. Pré-chaud 3 ml de EB médias par boîte de Pétri à la température ambiante. Chaque boîte de Pétri de 6 cm bactérienne peut effectivement contenir 2 couvercles d'une valeur de gouttes pendaison.
Remarque: Veillez à utiliser une boîte de Pétri f non couchéou cette étape (voir le tableau des matériaux). Ne pas utiliser une boîte de culture de tissu ou toute autre surface qui favorise l'adhésion cellulaire. EB devraient rester en suspension dans les médias avant d'être prêt à plaquer comme décrit dans la section 6. - Enlever 10 cm boîtes de pétri de l'incubateur et la placer dans la hotte stérile de culture tissulaire. Retirez délicatement le couvercle avec EBS et incliner à un angle de 45 degrés.
- En utilisant une pipette sérologique de 5 ml contenant 3 ml de milieu RT EB, lavez doucement EBs dans une piscine au fond du couvercle. Inspectez soigneusement le couvercle pour EB qui sont collées à la surface et re-rinçage si nécessaire.
- Après avoir lavé tout EBs transfert à une boîte de Pétri de 6 cm.
- Répétez les étapes 5.3.2) -5.3.4) pour tous les ballasts électroniques. Chaque boîte de Pétri de 6 cm doit contenir EBs de deux 10 cm couvercles. Placez tous les plats de nouveau dans l'incubateur à 37 ° C pendant deux jours.
NOTE: EB qui sont trop rapprochées en suspension peuvent rester ensemble et former de grands agrégats. Cela peut avoir un impact négatif sur l'efficacité de la différenciation cardiaqueainsi que de réduire de manière significative le nombre de disponibles EB. Pour éviter l'agrégation, EB doit être vérifié chaque jour et séparé en déplaçant doucement d'avant en arrière, puis côté à l'autre. L'utilisation de plats bactériens dans les étapes précoces de différenciation est nécessaire pour empêcher la fixation EB au plat et laisser EBs de croître en suspension.
- Après 2 jours EB de sont prêts pour le lavage et le transfert de boîtes de 6 cm de Pétri bactériennes. Pré-chaud 3 ml de EB médias par boîte de Pétri à la température ambiante. Chaque boîte de Pétri de 6 cm bactérienne peut effectivement contenir 2 couvercles d'une valeur de gouttes pendaison.
6. Placage et le traitement des EBs Avec Grem2
- Préparer le milieu de traitement Grem2 en ajoutant un volume suffisant de stock (0,5 pg / pl) Grem2 à moyenne RT EB pour une dilution finale de 1-5 pg / ml.
REMARQUE: La concentration efficace pour le traitement des ballasts électroniques varie en fonction de la lignée cellulaire et l'activité spécifique du lot actuel de Grem2. Il est recommandé que, avant d'utiliser la dose est titré pour trouver une efficacité maximale. Pour la ligne CGR8 MESC nous utilisons régulièrement 3-5 pg / ml de Grem2. Les concentrations efficaces de Grem2 pour la production d'myocytes auriculaire va produire des cellules adjudicatrices rapidement entrejours 7-8 qui sont répandues dans chaque puits. Si contractant phénotype est pas observée dans les cultures traitées, il est recommandé que la dose soit Grem2 titrée dans la fourchette indiquée. - Préparer des plaques à 6 puits de culture tissulaire en aspirant la solution de revêtement de gélatine dans chaque puits et en ajoutant 2 ml de milieu de RT Grem2 traitement. Retirer EB de l'incubateur et le placer dans la hotte stérile de culture tissulaire.
- L'utilisation d'un P1000 réglé à 100 pi de transfert 30 à partir de 6 cm EBs Pétri plats à chaque puits. La place dans EBs incubateur et disperser uniformément par doucement déplacer la plaque arrière vers l'avant, puis côté à l'autre.
- Après avoir attaché à EBs gélatine puits revêtus, remplacer les médias Grem2 tous les deux jours jusqu'au jour 10. Après 10 jours, interrompre le traitement Grem2 et ajouter des médias EB frais tous les deux jours pour maintenir les cellules saines.
NOTE: Après avoir fixé, EbS aplatir le long de la surface de la plaque revêtue.
- Après avoir attaché à EBs gélatine puits revêtus, remplacer les médias Grem2 tous les deux jours jusqu'au jour 10. Après 10 jours, interrompre le traitement Grem2 et ajouter des médias EB frais tous les deux jours pour maintenir les cellules saines.
7. Cellule Dissociation pour RT-qPCR Analysis
- Cellule Dissociation avec trypsine-EDTA
- Aspirer le milieu de chaque puits et rincer deux fois avec 1 ml par puits de DPBS stérile moins Ca 2+ et Mg 2+.
- Ajouter 0,5 ml de 0,25% de solution de trypsine-EDTA stérile pour chaque puits à partir de laquelle les cellules seront recueillies.
- Placer la plaque dans un incubateur à 37 ° C pendant 5 min.
- Après 5 min cellules de contrôle pour la dissociation. Si les cellules restent encore attachés au fond du robinet bien doucement pour desserrer. Si taraudage ne se desserre pas les cellules, placer de nouveau dans l'incubateur et de surveiller toutes les 2 min jusqu'à ce que les cellules sont complètement détachés.
- Neutraliser solution trypsine-EDTA en ajoutant 0,5 ml de milieu EB à chaque puits.
- Transférer l'intégralité de 1 ml de suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse de 1,5 ml de micro-ondes.
- cellules à granules par filage dans une centrifugeuse de table pendant 5 min à 300 x g.
- Aspirer le milieu de culot et passer à la lyse immédiatement ou conserver culot à -70 ° C jusqu'au moment de la lyse. Long term stockage des pellets est déconseillée car cela peut conduire à la dégradation de l'ARN.
- Lyse des cellules et analyse moléculaire
- A ce stade, les cellules sont prêtes pour l'isolement d'ARN en utilisant un kit d'extraction sur colonne en utilisant un réactif commercial ou d'extraction d'ARN selon les protocoles fournis par le fabricant (voir le tableau des matériaux). Une fois isolé, inverser l' ARN transcrit et utiliser ADNc pour une analyse par RT-qPCR en utilisant des techniques standard de 20, 21.
NOTE: Amorces utilisées par ce laboratoire pour RT-qPCR sont énumérés dans le tableau 1. identité atriale est confirmée en utilisant une combinaison de RT-qPCR à regarder l'expression de gènes auriculaires et ventriculaires et l'électrophysiologie à l'action record durée du potentiel (voir la section 8). Une sélection de gènes est inclus dans ce protocole, par exemple, des marqueurs fiables auriculaire et ventriculaire. De plus amples informations à propos de l' oreillette et l' expression du gène ventriculaire dans le contexte de la différenciation des cellules souches pluripotentes se trouve dans la référence 14. </ Li>
- A ce stade, les cellules sont prêtes pour l'isolement d'ARN en utilisant un kit d'extraction sur colonne en utilisant un réactif commercial ou d'extraction d'ARN selon les protocoles fournis par le fabricant (voir le tableau des matériaux). Une fois isolé, inverser l' ARN transcrit et utiliser ADNc pour une analyse par RT-qPCR en utilisant des techniques standard de 20, 21.
8. Analyse électrophysiologique
- Dissociation cellulaire avec de la collagénase
- Aspirer le milieu de chaque puits et rincer deux fois avec 1 ml par puits de PBS stérile.
- Ajouter 0,5 ml de 1 mg / ml de solution de collagénase à chaque puits.
- Placer la plaque dans un incubateur à 37 ° C pendant 10 min.
- Après 5 min cellules de contrôle pour la dissociation. Si les cellules encore restent attachées les unes aux autres ou le fond du robinet de bien doucement pour desserrer. De plus dissocier les cellules par trituration douce avec un P1000.
NOTE: Pour faciliter brassage des cellules enregistrements de serrage doit être trituré jusqu'à ce qu'une suspension à cellule unique est obtenue. - Ajouter 0,5 ml de milieu EB chaque puits et mélanger par pipetage.
- Transférer l'intégralité de 1 ml de suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse de 1,5 ml de micro-ondes.
- cellules à granules par filage dans une centrifugeuse de table pendant 5 min à 300 x g.
- Aspirer le milieu de culots cellulaires.
- cellules dans 500 Re-suspendreul de PBS avec 10% de FBS, en étant sûr de triturer dans une suspension cellulaire unique.
- Caractérisation électrophysiologique.
NOTE: Beaucoup d'excellents protocoles ont été publiés dans cette revue sur l'utilisation unique patch clamp de la cellule pour mesurer les potentiels de membrane cellulaire. Pour des informations détaillées sur la façon d'effectuer patch cellule unique pince le lecteur novice est fait référence à ces protocoles 21-24. Ce qui suit contient des informations spécifiques pour ce protocole qui aidera le électrophysiologue expérimenté préparer et gérer MESC dérivé CMs pour le sous-type de caractérisation.- Préparer une solution d'enregistrement intracellulaire constitué des éléments suivants: 10 mM de tampon HEPES 5 mM MgATP, 2 mM d'EGTA, 110 mM de glutamate de potassium, 10 mM de KCl et 10 mM de NaCl. Ajuster la solution à un pH de 7,2 en utilisant du NaOH.
- Préparer l' enregistrement extracellulaire (bain) en solution composée comme suit: 2 mM de HEPES, 10 mM de glucose, 1 mM de MgCl2, 2 mM de CaCl2, 5,4 mM de KCl et 137MM de NaCl. Ajuster la solution à un pH de 7,4 en utilisant du NaOH.
- Préparer une pipette en verre qui mesure 2-5 résistance à la MQ lorsque remblayé avec une solution d'enregistrement en utilisant le verre borosilicate standard avec filament.
- Transfert 100 ul de cellules en suspension dans la chambre d'enregistrement contenant une solution d'enregistrement extracellulaire en utilisant un P200.
REMARQUE: Les cellules peuvent être corrigées en suspension ou, pour faciliter la manipulation et l'utilisation pour le traitement médicamenteux et / ou des essais de perfusion, peut être ensemencé sur une lamelle de gélatine appliquée comme indiqué dans 8.2.5). - Préparer la gélatine revêtu des lamelles de verre en plaçant un diamètre lamelle de verre de 10 mm dans chaque puits d'une plaque à 6 puits et couvrant avec une solution de gélatine comme décrit dans la section 3.1) de ce protocole.
- Après solution aspirée de gélatine au moins 30 minutes et ajouter 100 pi de cellules en suspension directement à lamelle et placer toute la plaque de 6 puits dans l'incubateur pendant au moins 2 heures ou jusqu'à ce que les cellules ont attaché. Après que les cellules ont attaché, remove lamelle et place dans la chambre d'enregistrement avec une solution d'enregistrement extracellulaire.
NOTE: Si vous utilisez la ligne de MESC reporter cardiaque fluorescent αMHC-DsRed, CMs peuvent être identifiés par leurs noyaux fluorescents rouges. Si ne pas utiliser une ligne de journaliste cardiaque, les cellules adjudicatrices spontanément peuvent être observés et isolés pour les mesures. les cellules souches pluripotentes dérivées CMs sont généralement plus petites et plus arrondi, manquant la morphologie rectangulaire caractéristique des myocytes cardiaques adultes complètement formé.
- Après solution aspirée de gélatine au moins 30 minutes et ajouter 100 pi de cellules en suspension directement à lamelle et placer toute la plaque de 6 puits dans l'incubateur pendant au moins 2 heures ou jusqu'à ce que les cellules ont attaché. Après que les cellules ont attaché, remove lamelle et place dans la chambre d'enregistrement avec une solution d'enregistrement extracellulaire.
- Faire tous les enregistrements à 37 ° C. Le patch clamp en utilisant des cellules individuelles de cellules entières en mode courant-clamp avec une pipette en verre de borosilicate de résistance à 05/02 MQ. Utiliser une pression négative douce pour atteindre joint gigaohm avant d'obtenir l'accès à cellules entières. Appliquer une pression négative rapide à la rupture membrane et avoir accès cellule entière avant l'enregistrement des potentiels de membrane.
- Évocation potentiels d'action à l'aide de 4 msec dépolarisants injections de courant.
REMARQUE:Pour CMs PSC dérivé la quantité de courant nécessaire pour déclencher de façon reproductible des potentiels d'action peuvent varier. Afin de trouver courant optimal de seuil, commencer à une relativement faible amplitude du courant actuel et augmentation de déclenchement de manière progressive jusqu'à ce que les potentiels d'action reproductibles sont obtenus.
NOTE: Action durées possibles pour myocytes auriculaires Grem2 induites sont habituellement dans la gamme de 20-40 ms et manquent une phase de plateau (figure 6B).
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Representative Results
Avant la différenciation, les cellules souches pluripotentes doivent être compact et sans différenciation spontanée. Les cellules représentées sur la figure 1A sont prêts à être utilisés singularisé et pour accrocher des gouttes , comme décrit dans la section 5.1 du protocole. Les cellules représentées sur la figure 1B sont spontanément différenciation et ne doivent pas être utilisés pour la préparation des gouttes suspendues.
Les panneaux inclus dans la figure 2 montrent EBs formés avec succès au jour de différenciation 2. Qualité EB forment généralement mieux dans régulièrement espacées, suspendu bien arrondi gouttes comme le montre la figure 2. Par la différenciation jour 2, EB doit être visible à l'œil nu comme arrangements sphériques de différenciation des cellules souches au niveau des pointes des gouttes de suspension (figure 2). Ces ballasts électroniques sont prêts pour le lavage vers le bas comme décrit dans la section 5.3 du protocole.
Pendant les jours 2-4, EBs lavé-bas en suspension devraient continuer à croître en taille. Au jour 4, EBs bien formés devraient être flottant et homogènes en taille et la forme (Figure 3). Les ballasts électroniques représentés sur la figure 3 sont prêts à être transférés sur des plaques pré-revêtues et traité avec Grem2 comme décrit dans la section de 6/1 à 6/3 de protocole.
Une fois que plaquée EBs doit aplatir les cellules migrent hors de la EB sur la surface de la plaque de culture de tissu. Montré dans la figure 4 sont des exemples de EBs correctement attachés aux jours de différenciation 8 (panneau de gauche) et 10 (panneau de droite). Les cellules doivent continuer à surveiller tous les jours pour être sûr qu'ils restent attachés et pour vérifier la différenciation cardiaque comme décrit ci-dessous.
cellules contractantes, indiquant la présence de CMs, peut être observée dès le jour6 et aussi tard que le jour 9. En règle générale, les cellules contractantes seront présents au jour 8 de la différenciation. Le nombre de cellules contracter dans chaque puits devraient continuer d'augmenter à travers le jour de différenciation 14. Dans non-traités puits de contrôle de petites parcelles contractantes lentement sont observés (vidéo S1) tandis que dans Grem2 traités puits de grandes taches avec un taux de contrats relativement rapide sont fréquents ( vidéo S2). De temps en temps, la différenciation cardiaque ne se produit pas. Dans de tels cas, le moment du traitement Grem2, l'activité de la protéine, et l'état des cellules avant la différenciation devrait être réévalué pour être sûr que chacun de ces conditions est optimisé comme décrit dans ce protocole (voir la discussion).
La figure 5 montre les résultats typiques des cultures Grem2-traitées et les témoins non traités. Analyse par RT-PCR quantitative de l'expression génique dans des cellules collectées et lysées comme décrit dans la section 7.1 à 7.2 du protocole généralement révélées haute levels de gènes structurels et réglementaires cardiaques dans les cultures Grem2-traitées (figure 5A). Si la lignée cellulaire αMHC-DsRed-Nuc est utilisé, le rendement accru de CMs peut être observé visuellement plus grand nombre de noyaux DsRed marqués dans les puits Grem2-traités (figure 5B, panneau inférieur).
En plus de générer un nombre accru de CMs, le traitement Grem2 sollicite également la différenciation vers un phénotype auriculaire comme. Le phénotype auriculaire est généralement confirmée de deux manières. Tout d' abord, l' analyse par RT-qPCR des cellules recueillies comme décrit dans 7,1-7,2 de la section de protocole devrait révéler que les gènes caractéristiques des atrial CMs sont surexprimés alors que les gènes ventriculaires sont downregulated (figure 6A). Deuxièmement, les mesures de patch clamp d'action cellulaire durée du potentiel (tel que décrit dans 8.1-8.2 de la section de protocole) révèle que, un potentiel d'action à court auriculaire comme prédomine parmi les Grem2 treate cellules d (Figure 6B).
Figure 1. Représentant des cellules souches embryonnaires de souris (mESCs). Les cellules souches embryonnaires de souris pluripotentes avant la formation EB avec grand noyau caractéristique, compact morphologie de formation de colonies (A, flèches noires), et blanc frontières de phase (A, flèches oranges). La différenciation spontanée des cellules ES de souris est indiqué par de plus grandes, des cellules individuelles séparées des colonies (B, flèches noires) et la perte de la phase frontière autour des colonies (B, flèche orange). Images capturées à l'aide d'un contraste de phase inversée microscope. Les barres d'échelle représentent 50 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Les corps embryoïdes (EbS) au jour 2 de la différenciation. Hanging gouttes suspendues à partir d' un couvercle de boîte de Pétri ( à gauche, la barre d'échelle est de 2 cm) sont régulièrement espacées et homogènes en taille. EB en gouttes suspendues sont observées sous forme de sphères compactes dans le centre de chaque goutte ( à droite, barre d'échelle est de 1 mm). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. EB en suspension au jour 4 de la différenciation. Idéal EBs doivent être homogènes en taille et en forme avec un minimum l' adhérence les unes aux autres ou à la partie inférieure de la plaque. Les images ont été capturées en utilisant un microscope à dissection dans des conditions stériles. La barre d'échelle représente 100 um.charge / 53919 / 53919fig3large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. morphologie EB typique après placage. Plaqué EBs aux jours 8 ( à gauche) et 10 ( à droite) de différenciation. Comme EB attacher à plaques gélifiés, ils aplatissent et apparaissent centres denses entourés par une monocouche de plus en plus de cellules confluentes. De petites poches de cellules contracter sont généralement observés autour des jours de différenciation 6-8 près du centre de l'EB. Ces poches continuent de se développer à travers le protocole de différenciation pour former de plus grandes feuilles de cellules adjudicatrices dans les monocouches environnantes. Les images capturées à l'aide d'un microscope à contraste de phase inversée et. Les barres d'échelle représentent 200 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.
Figure 5. différenciation cardiaque dans les puits témoins Grem2-traités et non traités. Analyses qPCR des marqueurs cardiaques indique une augmentation de l'expression cardiaque génique dans EBs traité avec Grem2 dès six jours et jusqu'au jour 10 de la différenciation (A). La lignée cellulaire αMHC-DsRed-Nuc conçu montre de grands bassins de DsRed marqué CMs dans les cultures traitées avec Grem2 (B, en bas) par rapport à des témoins non traités (B, en haut). Les chiffres adaptés avec la permission de 14. Les barres d'erreur représentent SEM d'au moins 3 expériences répétées. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 6. Caractérisation du phénotype cardiaque auriculaire-like. QPCR analyse indique une augmentation de l'expression de gènes auriculaires et la régulation négative des gènes associés à CMs ventriculaires dans des échantillons Grem2-traités (A). Les cultures témoins produisent Cms du potentiel d' action caractéristique de la durée des cellules auriculaires et ventriculaires tandis que le traitement avec Grem2 génère des populations de cellules avec l'action à court potentiel caractéristique de la durée des myocytes auriculaires (B). Les échantillons ont été comparés en utilisant le test t de l' étudiant. * P <0,05; *** P <0,001 Les chiffres adaptés avec la permission de 14. Les barres d'erreur représentent SEM d'au moins 3 expériences répétées. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Vidéo S2. Puits Grem2-traités (clic pour télécharger) . Des résultats typiques observés dans les cellules traitées Grem2. De grandes taches de cellules adjudicatrices rapidement sont observées dans tout le EB plaqué. Vidéo a été prise au jour de la différenciation 10.
| Gène | | L' amorce inverse (5 'à 3') | |
| actine | CTACGAGGGCTATGCTCTCCC | CCGGACTCATCGTACTCCTGC |
| Gapdh | CTCACTCAAGATTGTCAGCAATG | GAGGGAGATGCTCAGTGTTGG |
| Gata4 | ACAAGGTCCAAGCCTACTCCA | CTGCGATGTCTGAGTGACAGG |
| GJA1 | ACAAGGTCCAAGCCTACTCCA | CCGGGTTGTTGAGTGTTACAG |
| GJA5 | ATAACAGTGGGCAGTTGAACAGCAG | TACCCAATAACGAATGTGGGAGATG |
| Myh6 | TACACTCTTCTCTACCTATGCTTCT | CACTATCTTCTTGAACTCAATGC |
| Myl2 | AGAGATCGATGAAATGATCAAAGAG | CAGAGCCAAGACTTCCTGTTTATT |
| Myl7 | AAATCAGACCTGAAGGAGACCTATT | CAGAGAGACTTGTAGTCAATGTTGC |
| Nkx2.5 | GTCTCAATGCCTATGGCTAC | CTACGTCAATAAAGTGGGATG |
| Tnnt2 | CAGAGGAGGCCAACGTAGAAG | CTCCATCGGGGATCTTGGGT |
Tableau 1. Liste des qPCR séquences d'amorce. Primer séquences sont classés par ordre alphabétique par nom de gène. Les séquences sont fournies 5 'à 3' pour tous les gènes analysés dans les figures 5 et 6.
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Discussion
Ce protocole produit régulièrement des cultures avec un pourcentage élevé de CMs qui sont caractéristiques de la lignée auriculaire. Comme avec n'importe quel protocole de différenciation, la qualité des mESCs avant la différenciation méritent une attention particulière. mESCs doivent être surveillés régulièrement pour la morphologie correcte (figure 1A). Toute différenciation spontanée qui se produit avant la formation de EbS limiter sévèrement l'efficacité des cardiogenèse et doit être enlevé avant repiquage (figure 1B). taille EB affecte également cardiogenèse. À partir du nombre de cellules entre 200 et 1000 par EB ont été testés et 500 cellules par EB produit régulièrement le plus grand nombre de Cms. Les cellules qui sont repiquées la veille de la formation EB ont également tendance à se différencier de façon plus efficace.
La méthode "goutte suspendue" est utilisé pour générer EB dans ce protocole 25. D'autres procédés de fabrication utilisés pour EBs cardiaque différenciation have été signalé 26-29. La méthode "goutte suspendue" est simple et peu coûteux, facilement adopté dans un laboratoire avec des équipements et des matériaux de culture cellulaire commune, et peut être réalisée par une personne ayant une expérience de culture cellulaire. Il est aussi polyvalent, produisant EB qui peuvent être facilement manipulées, transférées, plaqués ou collectées pour l'ARN analyse en fonction des besoins des enquêteurs. Il est également évolutif, la production de petites ou un grand nombre de ballasts électroniques, au besoin.
Le protocole dicte le placage de EBs sur des plaques revêtues de gélatine à jour 4 de la différenciation. Cette étape convertit la différenciation EBs dans le format plus typique monocouche commun à la culture tissulaire. Dans certains cas, il peut être plus pratique et ou nécessaire de quitter les EB en suspension plutôt que de placage. Si EBs de suspension sont préférées pour des applications en aval, les cellules peuvent être laissées en suspension tout au long du processus de différenciation au lieu d'être plaqué au jour 4. Lors du traitement de l'esprith Grem2, les ballasts électroniques sont placés dans 1,5 ml des tubes de centrifugeuse et laissé décanter par gravité. Le milieu est ensuite soigneusement enlevé avec un P1000, laissant derrière une petite quantité pour éviter l'aspiration des ballasts électroniques, et 1,5 ml de milieu Grem2 est ajouté au tube. Cette suspension est ensuite transférée dans une boîte de Pétri de 6 cm et placé en arrière à 37 ° C. Le support est modifié en utilisant la méthode du tube de centrifugeuse micro indiqué ci-dessus tous les deux jours.
Différenciation jour 4 a été choisie pour le traitement des cellules avec Grem2 basées sur l'analyse de l'expression des gènes généralement associés à des événements majeurs de développement. L'addition de Grem2 après expression pic des gastrulation gènes marqueurs T brachyury et Cerberus comme 1 et au début de l'expression de marqueurs de cellules progénitrices cardiaques telles que NKX2-5 est critique pour les deux cardiogenèse et la spécification auriculaire. Parce que l'expression maximale de ces gènes peut varier légèrement entre les lignées cellulaires, il est recommandé de surveiller l'expression de ces gènes au cours differentiation pour déterminer le moment optimal pour l'addition Grem2. Parmi les lignées testées pour ce protocole, la plupart ont répondu au traitement avec Grem2 entre 4 et 5 jours de différenciation.
Comme avec toute protéine recombinante, l'activité de Grem2 varie d'un lot à. Il est donc recommandé que Grem2 du même lot est utilisé pour chaque série d'expériences pour maintenir la cohérence. Lorsqu'un nouveau lot acheté, l'efficacité peut être évaluée par titrage de la dose dans la plage de 1 à 5 ug / ml. Ce protocole donne CMs de la lignée auriculaire du nombre suffisant pour l'analyse et de la culture. Les cellules produites en utilisant ce protocole peuvent être analysés par cytométrie en flux, électrophysiologie, RT-qPCR, ou re-culture pour une utilisation dans des essais de cellules vivantes. Pour faciliter l'identification et l'isolement des CMs après culture de la ligne de journaliste αMHC-DsRed-Nuc a été développé et est couramment utilisée par notre laboratoire.
Ce protocole utilise le sérum pour maintenir en bonne santé CEcultures ll tout au long du processus de différenciation. Bien que ce protocole produit régulièrement robuste, la différenciation cardiaque auriculaire-like, l'utilisation de sérum introduit un élément non défini pour le processus de différenciation. Cela peut limiter l'utilité du protocole dans les cas où un média plus défini est nécessaire. Si une préparation de support plus défini est nécessaire, le sérum peut être remplacé par du sérum de remplacement KnockOut 30. Lors du passage à un milieu de culture défini, il est recommandé que le moment et la concentration du traitement Grem2 être ré-optimisé comme déjà décrit dans cette section.
RT-PCR quantitative est utilisée pour quantifier l'expression de gènes spécifiques à auriculaire et ventriculaire des myocytes. Grem2 traitement conduit à une induction de gènes spécifiques d'oreillette tout en régulant vers le bas ou non affecter l'expression des gènes ventriculaires. Ce résultat est typique pour CMs Grem2-induites. Un ensemble suggéré de gènes pour évaluer l'identité auriculaire est inclus dans ce protocole. Un ensemble étendu de gènes et une discussion sur leur pertinence peuvent être trouvés dans des ouvrages référencés par ce protocole 14,16. Comme le domaine continue d'évoluer et notre compréhension de la différenciation cardiaque améliore il est recommandé que cette liste de marqueurs d'identité auriculaire et ventriculaire est évaluée et révisée au besoin.
Génération des cultures homogènes de CMs faciliteront les efforts de recherche clinique axés sur les maladies connues pour affecter les sous-types cardiaques spécifiques et de fournir un système de modèle pour la recherche fondamentale axée sur la compréhension des mécanismes de la spécification de la chambre dans les cœurs vertébrés.
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Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le NIH subventions HL083958 et HL100398 (AKH) et 2T32HL007411-33 "Programme en cardiovasculaires Mécanismes: Formation en Investigation" (JB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GMEM | Life Technologies | 11710 | |
| FBS | Life Technologies | 10082 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050 | |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
| ß-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Non-Essential Amino Acids | Sigma | M7145 | |
| 10 cm Tissue Culture Plates | Sarstedt | 83.3902 | |
| 10 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-342 | |
| 6 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-092 | |
| 6-well tissue culture plates | Sarstedt | 83.3920 | |
| Gremlin 2 recombinant protein | R&D Systems | 2069-PR-050 | |
| Sterile filter units | Thermo Fisher | 09-741-02 | |
| Gelatin (from porcine skin) | Sigma | G1890 | |
| 10X PBS, Sterile | Sigma | P5493 | |
| BSA | Sigma | 5470 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA solution | Life Technologies | 25300054 | |
| DPBS, no Calcium, no Magnesium | Life Technologies | 14200 |
References
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