Abstract
Protokolle für die Populationen von Kardiomyozyten aus pluripotenten Stammzellen zu erzeugen, wurden entwickelt, aber diese in der Regel Zellen aus gemischten Phänotypen ergeben. Die Forscher interessiert Studien führen spezifische myocyte Subtypen Beteiligung erfordern eine gerichtete Differenzierung Ansatz. Durch die Behandlung kann Maus embryonale Stammzellen (ES - Zellen) mit Grem2, sezerniertes BMP - Antagonist, für die atriale Kammerbildung in vivo erforderlich ist, eine große Anzahl von Herzzellen mit einem atrial - Phänotyp erzeugt werden. Verwendung des konstruierten Myh6-DsRed-Nuc pluripotenten Stammzelllinie ermöglicht die Identifizierung, Selektion und Reinigung von Kardiomyozyten. In diesem Protokoll werden Embryoidkörpern von Myh6-DsRed-Nuc Zellen erzeugt, um die hängenden Tropfen Verfahren und in der Schwebe gehalten, bis die Differenzierung Tag 4 (d4) verwendet wird. Bei d4 Zellen werden mit Grem2 behandelt und plattiert auf Gelatine-beschichteten Platten. Zwischen d8-d10 großen öffentlichen Flächen in den Kulturen beobachtet werden und weiter expandieren und mAture durch d14. Molekular-, histologische und electrophysiogical Analysen zeigen Zellen in Grem2 behandelten Zellen atrial artigen Eigenschaften eine in - vitro - Modell die Bereitstellung zur Untersuchung der Biologie des atrialen Kardiomyozyten und ihre Reaktion auf verschiedene pharmakologische Mittel zu erwerben.
Introduction
Pluripotente Stammzellen sind ein leistungsfähiges Werkzeug zum Erzeugen und Zellen aus einer Vielzahl von schwer zugänglichen Geweben für Grundlagenforschung und präklinische Studien, insbesondere beim Menschen 1-5 studieren. Die richtige Modulation der Entwicklungs-Signalwege können die Differenzierung pluripotenter Stammzellen auf die gewünschte phänotypische Schicksal lenken. Viele Protokolle wurden entwickelt , Kardiomyozyten (CMs) aus pluripotenten Stammzellen 6-14 zu erzeugen. Diese Protokolle umfassen im allgemeinen Modulation TFGβ -Superfamilie (Activin, BMP und TGF & bgr;) und Wnt Wege durch timed Zugabe von exogenen Wachstumsfaktoren und / oder kleine Moleküle 10,12-15. Diese Protokolle sind im allgemeinen wirksam bei der der Prozentsatz der Zellen zu erhöhen, die CMs werden, aber es fehlt die Spezifität, eine gemischte Population von Zellen zu erzeugen darstellt atrialen, ventrikulären und Knoten / Leitungssystem Abstammungen. Um bestimmte Herz zu studieren Subtypen eine gerichtete Differenzierung approACH ist nicht erforderlich.
Gremlin2 (Grem2, die auch als Protein mit Bezug zu Dan und Cerberus oder PRDC kurz) ist ein sezerniertes BMP - Antagonist, der für die richtige Herzdifferenzierung und Vorhofkammer Bildung während der Herzentwicklung in Zebrabärbling 16 notwendig ist. Die Behandlung von Differenzierung embryonaler Stammzellen mit Grem2 an Differenzierung Tag 4, kurz nach Spitzen Expression von mesodermalen Marker T-Brachyurie und Cerberus wie 1, erhöht die Ausbeute an CMs und erzeugt einen Pool von Zellen überwiegend aus der Vorhof Linie 14.
Rekombinante Grem2 wird verwendet , um die differenzierenden Zellen zu behandeln und kann 17 unter Verwendung von Standard - Protein - Produktionstechniken hergestellt werden oder können im Handel erworben werden. Es ist in wässrigen Lösungen sehr gut löslich und können exogen zu Kulturen mit der gewünschten Zeitpunkt zugesetzt werden.
Die Differenzierung kann mittels RT-qPCR quantifiziert werden verfolgt Expression von Markern repräsentativvon Herz-Kreislauf-Vorläufern, Herz-Vorläufern und engagierte CMs. Immunofluoreszenz können auch zur Identifizierung und Visualisierung der räumlichen Verteilung der kardialen Zelltypen verwendet werden.
Anwendungen, die reine Populationen erfordern, werden leichter durchgeführt, wenn ein Reportersystem mit CMs zu identifizieren und zu isolieren. Zu diesem Zweck haben wir die & alpha; MHC-DsRedNuc Konstrukts in die Maus CGR8 ES - Zelllinie 14 eingeführt. CGR8 Zellen wachsen und bleiben pluripotent ohne Feeder - Zellen, Expansion und Differenzierung Assays zu erleichtern 18. Die ES - Zelllinie enthält eine DsRed - fluoreszierende Protein codierende Sequenz mit einem Kernlokalisierungssignal unter der herzspezifischen alpha - Myosin schwere Kette (& agr; MHC- oder Myh6) Genpromotor. Unter Verwendung dieser Zellen kann CMs leicht zur Quantifizierung identifiziert und isoliert werden, Zellsortierung, Elektrophysiologie, Drogen-Bildschirme, und Mechanismen der atrial Differenzierung zu studieren.
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Protocol
1. Herstellung von Zellkulturmedien, Lösungen und Reagenzien.
- Bereiten 500 ml Maus-embryonalen Stammzellen (MESC) Medien durch Vermischen und sterile Filterung (0,2 um Porengrße) 445 ml Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM), 50 ml hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum (FBS), 5 ml 100X konzentrierte L- Glutamin Ersatz, 5 & mgr; l rekombinantem Maus Leukemia Inhibitory Factor (LIF) bei 1 x 10 7 Einheiten pro ml, und 1,43 ul ß-Mercaptoethanol (Endkonzentration 50 uM). Lagerung bei 4 ° C bis zur Verwendung.
- Bereiten 500 ml Embryoidkörper (EB) Differenzierungsmedien durch Mischen und sterile Filterung 391 ml Iscove modifiziertem Dulbecco Medium (IMDM), 100 ml hitzeinaktiviertem FBS, 5 ml 100X konzentrierte L-Glutamine Ersatz, 5 ml 100X konzentrierte Nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA) und 2,86 ul ß-Mercaptoethanol (Endkonzentration 100 uM). Lagern bei einer 4˚ C bis zur Verwendung.
- Bereiten Sie 0,2% w/ v Lösung von Gelatine mit 500 ml filtriert, destilliertem H 2 O 1 g Schweinehautgelatine Pulvermisch Durch Autoklavieren sterilisieren. Beachten Sie, dass die Gelatine nicht vollständig löslich bei RT in Wasser sein kann. Nachdem die Gelatine Autoklavenbehandlung vollständig aufgelöst werden sollte. Lagern Sie bei RT bis zur Verwendung.
- Bereiten Grem2 rekombinantes Protein-Aliquots von 50 ug Pellet lyophilisierter Grem2 in 100 ul phosphatgepufferter Kochsalzlösung aufgelöst (PBS), supplementiert mit 0,1% BSA ein 0,5 & mgr; g / & mgr; l Stammlösung herzustellen. Aliquot 20 ul dieser Stammlösung in fünf sterile 1,5 ml Zentrifugenröhrchen und lagern bei -80˚ C bis zur Verwendung.
- Bereiten Sie PBS gemäß veröffentlichten Protokollen oder Kauf als 10fach und verdünnen 1:10 mit filtriert destilliertem H 2 O , um eine 1X machen Verdünnung arbeiten 19. Sterilisieren PBS vor der Verwendung im Autoklaven. Lagern Sie bei RT bis zur Verwendung. In einigen Schritten, DPBS ohne Ca 2+ und Mg 2+ verwendet wird. Dies ist purchased als 1X-Lösung. Bestellinformationen sind in der Tabelle der Reagenzien enthalten.
2. Herstellung von Gelatine beschichtete 10 cm Gewebekulturschalen
- In einem sterilisierten Gewebekulturhaube 5 ml 0,2% ige Gelatinelösung zu jeder 10 cm-Gewebekulturschale für die Beschichtung. Platz Gerichte im Inkubator bei 37 ° C für mindestens 30 Minuten oder bis zu 4 Tage.
3. Herstellung von Gelatine beschichtete 6-Well-Gewebekulturplatten
- In einem sterilisierten Gewebekulturhaube 1 ml 0,2% Gelatine in den jede Vertiefung einer 6-Well-Gewebekulturplatte. Platz Platten im Inkubator bei 37 ° C für mindestens 30 Minuten oder bis zu 4 Tage.
4. Embryonic Stem Cell Culture
- Thawing mESCs
- Bereiten Sie MESC Medien in einem sterilisierten Gewebekultur Haube Erwärmung auf RT. 10 ml RT Medien zu einer Gelatine beschichtete 10 cm Teller.
- Entfernen 1 Fläschchen mESCs , die etwa 1 x 10 6 Zellen ausKryolagerung. Halten Cryovial mit einer Zange, in einem Wasserbad 37 ° C. Vorsichtig schwenken, bis Zellsuspension und nur ein kleiner Eiskristall bleibt in der Mitte der Ampulle aufgetaut ist. Trocknen Sie Fläschchen mit einem Einweg-fusselfreien wischen und zu sterilisieren mit 70% EtOH.
- In einem sterilen Gewebekultur Haube aufgetauten Zellen entfernen Cryovial eine P1000 Spitze mit und Transfer zu 10 cm Schale in 4.1.1) hergestellt.
- Platz 10 cm Schale in 37 ˚C befeuchteten Zellkultur - Inkubator mit 5% CO 2 und gleichmäßig Zellen verteilen , indem Sie vorsichtig auf die Platte vorne bewegen nach hinten, dann von Seite zu Seite. Allow Zellen zu befestigen O / N oder zumindest 6 h zu plattieren.
- Das erste, was die nächsten Morgen Check-Zellen für die Befestigung eines Hellfeldmikroskop. Einige Zelltrümmer und tote Zellen werden in den Medien zu beachten. Das ist normal. Absaugen Medien von Speisen und ersetzen mit 10 ml frisch MESC Medien.
- Weiter täglich Medien auf Zellen zu verändern Differenzierung zu verhindern.
- Passage-Zellen, wenn 60-70% konfluent. Vorbereitung der Zellen für Passagierung durch Medien und Spülen mit 5 ml sterilem 1X DPBS ohne MgCl 2 und CaCl 2 abgesaugt. 2 ml 0,05% Trypsin-EDTA-Lösung. Der Platz im Inkubator bei 37 ° C für 5 min.
- Während Zellen werden inkubiert, neue 10 cm-Schale herzustellen, indem man Gelatinelösung abgesaugt und mit 10 ml RT MESC Medien hinzufügen. Nach 5 Minuten überprüfen Sie die Zellen für die Ablösung. Wenn Zellen haften bleiben, weiterhin bei 37 ° C für 2 Minuten zu einem Zeitpunkt, zu brüten, bis sie vollständig abgelöst.
- Quench Trypsin-EDTA durch Zugabe von 3 ml MESC Medien. Übertragen Zellsuspension in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen und Spinn bei 200 xg für 5 Minuten zu pelletieren. Absaugen Medien von Pellets und resuspendieren in 10 ml MESC Medien.
- Je nach Split-Verhältnis gewünscht, fügen 0,5-1,0 ml Zellsuspension in jede Schale, hergestellt in Schritt 4.2.2). Legen Gericht in Inkubator und gleichmäßig verteilen Zellen durch leichtes Bewegen von hinten nach vorne dann von Seite zu Seite. Alleow Zellen O / N oder für mindestens 12 h zu befestigen.
HINWEIS: Ein Split-Verhältnis von 1.10 Uhr bis 01.20 Uhr ist üblich für die meisten MESC Linien. Dieses Verhältnis kann in Abhängigkeit von der Leitung verwendet, passage Nummer und gewünschte Konfluenz auf der neuen Schale variieren. Für 1:10 Splitverhältnis 1 ml der Zellsuspension in 9 ml MESC Medien und Platte in einer frisch mit Gelatine beschichtete 10 cm Gericht zubereitet.
5. Herstellung von Embryoidkörpern
HINWEIS: Alle Schritte außer Zentrifugation in einem sterilen Gewebekulturhaube durchgeführt.
- Herstellung von Zellsuspension in EB Medien
- Bei 70% Konfluenz (in der Regel 24 bis 48 Stunden nach der Durchgang), die Zellen für EB Bildung verwenden. Vorbereitung der Zellen für EB Bildung durch Ablösen und Pelletierung nach den Abschnitten 4.2.1) - 4.2.3).
Anmerkung: (. ZB sehr wenig Zelltod, keine Verschmutzung, richtige Morphologie) Es ist am besten zu Passage Zellen mindestens ein Mal nach dem Auftauen und prüfen Sie für die Gesundheit und ein robustes Wachstum (e.g., Populationsverdopplungen alle 24-48 h) vor auftretenden zur Herstellung von EBs zu verwenden. - Re-suspend Pellet in 5 ml EB Medien. Zählen von Zellen mit einer Zählkammer oder automatisierten Zellzähler.
- Verdünnte Zellsuspension in erforderliche Volumen von EB Medien eine Endkonzentration von 25 Zellen / & mgr; l (oder 2,5 x 10 3 Zellen / ml) herzustellen. Man beachte, dass jeder Deckel einer Petrischale hält etwa 60 EBs und erfordert etwa 1,3 ml der Zellsuspension. In diesem Schritt wird ein ausreichendes Volumen der Zellsuspension herzustellen, die gewünschte Anzahl von EBs zu erzeugen. Wenn beispielsweise 240 EBs für Experiment erforderlich sind, vorzubereiten 5,2 ml bei 2,5 x 10 3 Zellen / ml.
HINWEIS: mESCs, die nicht für EB Bildung verwendet werden, können durch Drehen nach unten, Resuspendieren in MESC Medien für zukünftige Experimente verwendet werden, und Beschichtung wie in Abschnitt 4.2 beschrieben.
- Bei 70% Konfluenz (in der Regel 24 bis 48 Stunden nach der Durchgang), die Zellen für EB Bildung verwenden. Vorbereitung der Zellen für EB Bildung durch Ablösen und Pelletierung nach den Abschnitten 4.2.1) - 4.2.3).
- Erstellung von Embryoidkörpern
- Bereiten sterile 10 cm bakterielle Petrischalen Tropfenbildung zum Aufhängen durch Zugabe von 2 ml 1X PBS auf den Boden des eACH.
- Übertragen EB Suspension aus Schritt 5.1) zu einer sterilen Lösung Becken.
- Entfernen Deckel aus vorbereiteten Petrischale und vorsichtig sechzig, 20 ul Tropfen EB Suspension auf der inneren Oberfläche abscheiden. Erledigen Sie dies effizient einen Mehrkanal-Pipette, ausgestattet mit 6 Tipps. Jede 20 ul Tropfen hat jetzt 500 Zellen.
- Vorsichtig Deckel auf die untere Hälfte der bakteriellen Petrischale ersetzen, man aufpassen, nicht Tropfen hängen zu entfernen. Platzieren Sie Gerichte in Zellkultur-Inkubator bei 37˚ C. Nach 2 Tagen werden die Zellen bereit zu waschen, wie in 5.3 beschrieben).
- Wash-down von Embryoidkörpern
Hinweis: Alle Wash-Down Schritte werden in einer sterilen Gewebekulturhaube durchgeführt.- Nach 2 Tagen EB sind zum Waschen bereit nach unten und Transfer zu 6 cm bakteriellen Petrischalen. Vorwärmen 3 ml EB Medien pro Petrischale auf RT. Jede 6 cm bakterielle Petrischale kann 2 Deckel effektiv halten wert Tropfen hängen.
Hinweis: Stellen Sie sicher, dass eine nicht-beschichteten Petrischale f zu verwenden,oder dieser Schritt (siehe Materialien Tabelle). Verwenden Sie keine Gewebekulturschale oder einer anderen Oberfläche verwenden, die Zelladhäsion fördert. EBs sollten in Medien, bis sie bereit suspendiert bleiben plattiert werden, wie in Abschnitt 6 beschrieben. - Entfernen Sie 10 cm Petrischalen aus Inkubator aufnehmen und in sterile Gewebekultur Kapuze. Sorgfältig Deckel mit EBs entfernen und in einem 45-Grad-Winkel kippen.
- Mit einem 5 ml serologische Pipette mit 3 ml RT EB Medien, vorsichtig waschen EBs in einen Pool an der Unterseite des Deckels. inspizieren Sie vorsichtig den Deckel für EBs, die an die Oberfläche geklebt werden und wieder spülen, falls nötig.
- Nachdem alle EBs Übertragung auf eine 6 cm Petrischale zu waschen.
- Wiederholen Sie die Schritte 5.3.2) -5.3.4) für alle EVGs. Jede 6 cm Petrischale sollte EBs enthalten zwei 10 cm Deckel. Legen Sie alle Gerichte wieder in Inkubator bei 37 ° C für zwei weitere Tage.
HINWEIS: EBs, die zu nahe beieinander sind, in Suspension kann zusammenhalten und große Aggregate bilden. Dies kann sich negativ auf Herz Differenzierung Effizienz auswirkensowie deutlich die Zahl der zur Verfügung stehenden EBs reduzieren. Um zu verhindern, Aggregation, sollte EBs jeden Tag und durch sanft hin und her bewegt getrennt geprüft werden, dann einer Seite zur anderen. Die Verwendung von Bakterien Gerichte in den frühen Differenzierungsschritte notwendig EB Befestigung an der Schale zu verhindern und ermöglichen EBs in Suspension zu wachsen.
- Nach 2 Tagen EB sind zum Waschen bereit nach unten und Transfer zu 6 cm bakteriellen Petrischalen. Vorwärmen 3 ml EB Medien pro Petrischale auf RT. Jede 6 cm bakterielle Petrischale kann 2 Deckel effektiv halten wert Tropfen hängen.
6. Auflage und Behandlung von EBs Mit Grem2
- Bereiten Sie Grem2 Behandlungsmedium durch ausreichendes Volumen an Lager Zugabe (0,5 ug / ul) Grem2 auf RT EB Medium für eine endgültige Verdünnung von 1 bis 5 & mgr; g / ml.
HINWEIS: Die wirksame Konzentration für die Behandlung von EBs variiert in Abhängigkeit von der Zelllinie und die spezifische Aktivität des aktuellen Menge Grem2. Es wird empfohlen, vor der Dosis zu verwenden, wird eine maximale Wirksamkeit zu finden titriert. Für die CGR8 MESC Linie routinemäßig verwenden wir 3-5 ug / ml Grem2. Wirksame Konzentrationen von Grem2 für Vorhof Myocytenbildung produzieren schnell Vertrags Zellen zwischenTage 7-8, die während jeder Vertiefung weit verbreitet sind. Wenn Auftraggeber Phänotyp in behandelten Kulturen nicht beobachtet wird, wird empfohlen, dass die Grem2 im Bereich titriert werden Dosis angegeben. - Bereiten 6-Well-Gewebekulturplatten, die durch Gelatine-Beschichtungslösung Absaugen aus jeder Vertiefung und Zugabe von 2 ml RT Grem2 Behandlungsmedien. Entfernen EBs aus Inkubator aufnehmen und in sterile Gewebekultur Kapuze.
- Mit Hilfe eines P1000 auf 100 & mgr; l Transfer 30 EBs von 6 cm Petrischalen in jede Vertiefung. Platz EBs in Inkubator und gleichmäßig verteilen, indem Sie vorsichtig Platte nach vorne zu bewegen zurück dann von Seite zu Seite.
- Nach EBs zu Gelatine beschichteten Vertiefungen angebracht sind, ersetzen Grem2 Medien 10 alle zwei Tage bis zum Tag 10. Nach dem Tag, beenden alle zwei Tage die Grem2 Behandlung und fügen Sie frische EB Medien gesunde Zellen zu erhalten.
HINWEIS: Nach dem Anbringen EBs wird entlang der Oberfläche der beschichteten Platte abflachen.
- Nach EBs zu Gelatine beschichteten Vertiefungen angebracht sind, ersetzen Grem2 Medien 10 alle zwei Tage bis zum Tag 10. Nach dem Tag, beenden alle zwei Tage die Grem2 Behandlung und fügen Sie frische EB Medien gesunde Zellen zu erhalten.
7. Zelldissoziationsmedium für RT-qPCR Analysis
- Zelldissoziation mit Trypsin-EDTA
- Absaugen Medien aus jeder Vertiefung und spülen Sie zweimal mit 1 ml pro Vertiefung von sterilen DPBS minus Ca 2+ und Mg 2+.
- 0,5 ml 0,25% sterile Trypsin-EDTA-Lösung in jede Vertiefung, aus denen Zellen gesammelt werden.
- Legen Sie die Platte im Inkubator bei 37 ° C für 5 min.
- Nach 5 min Kontrollzellen für die Dissoziation. Wenn noch Zellen zu Boden des Bohrlochs Hahn verbunden bleiben sanft zu lösen. Wenn Klopfen Zellen nicht lösen, legen Sie wieder in Inkubator und überwachen alle 2 Minuten, bis die Zellen vollständig abgelöst werden.
- Neutralisieren Trypsin-EDTA-Lösung durch Zugabe von 0,5 ml EB Medien in jede Kammer.
- Übertragen gesamten 1 ml der Zellsuspension in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- Pellet Zellen in einer Tischzentrifuge 5 min bei 300 x g zu drehen.
- Absaugen Medien von Pellets und sich nach der Lyse sofort oder zu speichern Pellet bei -70 ° C bis zur Lyse bereit. Lang term Lagerung von Pellets wird nicht empfohlen, da dies zu einer Verschlechterung der RNA führen kann.
- Zellyse und Molekulare Analyse
- An diesem Punkt werden die Zellen für die RNA-Isolierung bereit, eine kommerzielle Säule-Extraktions-Kits oder unter Verwendung von RNA-Extraktion Reagenz nach den Protokollen, die von den Herstellern geliefert (siehe Tabelle der Materialien). Nach der Isolierung, reverse transkribierten RNA und verwenden cDNA für RT-qPCR - Analyse unter Verwendung von Standardtechniken 20, 21.
HINWEIS: Die Primer dieses Labor für RT-qPCR sind in Tabelle 1 aufgeführt Atrial Identität bestätigt wird eine Kombination von RT-qPCR unter Verwendung von Expression von atriale und ventrikuläre Gene und Elektro zum Handeln Rekordpotentialdauer zu betrachten (siehe Abschnitt 8). Eine Auswahl von Genen wird in diesem Protokoll als ein Beispiel für zuverlässige atriale und ventrikuläre Marker enthalten. Weitere Informationen über atriale und ventrikuläre Genexpression in Zusammenhang mit der pluripotenten Stammzelldifferenzierung in Referenz 14 gefunden. </ Li>
- An diesem Punkt werden die Zellen für die RNA-Isolierung bereit, eine kommerzielle Säule-Extraktions-Kits oder unter Verwendung von RNA-Extraktion Reagenz nach den Protokollen, die von den Herstellern geliefert (siehe Tabelle der Materialien). Nach der Isolierung, reverse transkribierten RNA und verwenden cDNA für RT-qPCR - Analyse unter Verwendung von Standardtechniken 20, 21.
8. Elektrophysiologische Analyse
- Zelldissoziationsmedium mit Kollagenase
- Absaugen Medien aus jeder Vertiefung und zweimal mit 1 ml pro Vertiefung von sterilem PBS spülen.
- 0,5 ml von 1 mg / ml Kollagenase-Lösung zu jeder Vertiefung.
- Legen Sie die Platte im Inkubator bei 37 ° C für 10 min.
- Nach 5 min Kontrollzellen für die Dissoziation. Wenn weiterhin Zellen aneinander oder dem Boden des Bohrlochs tap befestigt bleiben sanft zu lösen. distanziere ferner die Zellen durch vorsichtiges Zerreiben mit einem P1000.
HINWEIS: Patch-Clamp-Aufnahmen Zellen zu erleichtern, sollte bis eine Suspension Einzelzelle verrieben werden erreicht. - 0,5 ml EB Medien in jede Vertiefung und mischen durch Pipettieren.
- Übertragen gesamten 1 ml der Zellsuspension in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- Pellet Zellen in einer Tischzentrifuge 5 min bei 300 x g zu drehen.
- Aspirat Medien von Zellpellets.
- Re-suspend-Zellen in 500& mgr; l PBS mit 10% FBS, sicher zu sein, in eine Einzelzellsuspension zu verreiben.
- Elektrophysiologische Charakterisierung.
HINWEIS: Viele ausgezeichnete Protokolle wurden in dieser Zeitschrift zur Verwendung von Einzelzell Patch-Clamp zu messen Zellmembran Potentiale veröffentlicht. Ausführliche Informationen darüber , wie ausführen einzelne Zelle Patch den Neuling Leser klemmen wird 21-24 auf diese Protokolle bezeichnet. Im Folgenden werden spezifische Informationen für dieses Protokoll, das der erfahrene electrophysiologist herzustellen und zu hand MESC CMs wird dazu beitragen, abgeleitet Charakterisierung für den Subtyp.- Bereiten intrazelluläre Aufnahme Lösung, bestehend aus den folgenden: 10 mM HEPES-Puffer, 5 mM MgATP, 2 mM EGTA, 110 mM Kaliumglutamat, 10 mM KCl, und 10 mM NaCl. Einzustellen Lösung auf einen pH von 7,2 unter Verwendung von NaOH.
- Bereiten Sie extrazelluläre Aufnahme (Bad) Lösung , bestehend aus den folgenden: 2 mM HEPES, 10 mM Glucose, 1 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5,4 mM KCl und 137mM NaCl. Einzustellen Lösung auf einen pH von 7,4 unter Verwendung von NaOH.
- Bereiten Sie eine Glaspipette, die 2-5 MOhm Widerstand misst, wenn sie mit Recording-Lösung unter Verwendung von Standard-Borosilikatglas mit Filament verfüllt.
- Transfer 100 ul der suspendierten Zellen in Aufnahmekammer enthält, extrazelluläre Aufzeichnungslösung eine P200 verwenden.
HINWEIS: Die Zellen in Suspension geroutet werden kann oder die Handhabung zu erleichtern und Verwendung zur medikamentösen Behandlung und / oder Perfusion Assays kann auf einen mit Gelatine beschichteten Deckgläschen ausgesät werden, wie in 8.2.5 beschrieben). - Bereiten Sie Gelatine beschichtete Glasplättchen durch einen Durchmesser von 10 mm Deckglas in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte platziert und Abdecken mit Gelatinelösung wie in Abschnitt 3.1) dieses Protokoll beschrieben.
- Nach mindestens 30 absaugen Gelatinelösung min und 100 l suspendierten Zellen direkt gesamte 6-Well-Platte in Inkubator Deckglas und Platz für mindestens 2 Stunden oder bis die Zellen gebunden haben. Nachdem die Zellen angeschlossen haben, remove Deckglas und in mit extrazellulären Aufzeichnungslösung Aufnahmekammer.
HINWEIS: Um die & alpha; MHC-DsRed fluoreszierende Herz Reporter MESC Linie Bei der Verwendung kann CMs durch ihre rot fluoreszierende Kerne identifiziert werden. Wenn kein Herz Reporter Linie verwenden, spontan kontrahier Zellen können für Messungen beobachtet und isoliert werden. Pluripotente Stammzellen abgeleitet CMs sind in der Regel kleiner und abgerundet, die charakteristische rechteckige Morphologie von voll ausgebildeten erwachsenen Kardiomyozyten fehlt.
- Nach mindestens 30 absaugen Gelatinelösung min und 100 l suspendierten Zellen direkt gesamte 6-Well-Platte in Inkubator Deckglas und Platz für mindestens 2 Stunden oder bis die Zellen gebunden haben. Nachdem die Zellen angeschlossen haben, remove Deckglas und in mit extrazellulären Aufzeichnungslösung Aufnahmekammer.
- Nehmen Sie alle Aufnahmen bei 37 ° C. Patch-Einzelzellen unter Verwendung von Ganzzellklemme in Current-Clamp-Modus mit einem Borosilicatglas pipettieren von 2-5 MOhm Widerstand. Verwenden Sie sanfte Unterdruck Gigaohm Dichtung vor der Gewinnung ganze Zelle Zugang zu erreichen. Tragen Sie eine schnelle Unterdruckmembran zu zerreißen und Sie erhalten Zugang ganze Zelle vor der Membranpotentiale der Aufnahme.
- Evoke Aktionspotentiale unter Verwendung von 4 ms depolarisierenden Strominjektionen.
HINWEIS:Für PSC-derived CMs erforderliche Strommenge reproduzierbar zu Aktionspotentialen auslösen kann variieren. Um eine optimale Schwellenstrom zu finden, bei einem relativ niedrigen Strom und Zunahmestartauslösestromamplitude in einer schrittweisen Art und Weise, bis reproduzierbare Aktionspotentiale erhalten werden.
HINWEIS: Aktionspotentialdauer für Grem2-induzierte Vorhofmyozyten sind in der Regel im Bereich von 20 bis 40 ms und es fehlt ihnen eine Plateauphase (6B).
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Representative Results
Vor der Differenzierung sollte pluripotenten Stammzellen kompakt und frei von spontaner Differenzierung sein. Die Zellen , die in 1A gezeigt sind bereit für hängende Tropfen vereinzelnden und verwendet werden , wie in 5.1 des Protokolls beschrieben. Die Zellen in 1B gezeigt werden spontan differenzieren und sind nicht zur Herstellung von hängenden Tropfen verwendet werden.
Die Platten, die in Abbildung 2 zeigen , erfolgreich gebildet EBs an Differenzierung Tag 2. Qualität EBs bilden in der Regel innerhalb von gleichmäßigem Abstand am besten, gut abgerundet hängen wie in Abbildung 2 gezeigt , sinkt. Durch Differenzierung Tag 2, EBs sollte als sphärische Anordnungen für das bloße Auge sichtbar sein differen Stammzellen an den Spitzen der hängenden Tropfen (Abbildung 2). Diese EBs sind bereit für wash-down wie in 5.3 des Protokolls Abschnitt beschrieben.
Während der Tage 2-4, sollte gewaschen-down EBs in Suspension weiterhin in der Größe wachsen. Am Tag 4, wohlgeformte EBs sollte frei schwebenden und homogen in Größe und Form (Abbildung 3). Die EBs in Figur 3 gezeigt sind , bereit , übertragen zu werden Platten vorbeschichtet und mit Grem2 behandelt , wie in 6.1-6.3 des Protokolls beschrieben.
Einmal überzogen, sollte EBs abzuflachen, wie Zellen aus der EB auf die Oberfläche der Gewebekulturplatte herauswandern. Gezeigt in der Abbildung 4 sind Beispiele für richtig angebracht EBs an Differenzierung Tagen 8 (links) und 10 (rechtes Bild). Die Zellen sollten weiterhin täglich überwacht werden, um sicherzustellen, dass sie verbunden bleiben und für Herz-Differenzierung zu überprüfen, wie weiter unten beschrieben.
Vertrags Zellen, die das Vorhandensein von CMs, kann bereits Tag beobachtet werden6 und so spät wie Tag 9. Typischerweise wird Vertrags Zellen am Tag 8 der Differenzierung vorhanden sein. Die Zahl der Zellen in jeder Vertiefung sollten Vertrags weiter durch Differentiation Tag 14. In nicht behandelten Kontrollvertiefungen klein, langsam Vertrags Flecken beobachtet werden (Video S1), während in Grem2 Vertiefungen mit einer relativ schnellen Rate Vertrags großen Flecken behandelt zu erhöhen sind häufig ( Video S2). Gelegentlich versagt Herz Differenzierung auftreten. In solchen Fällen wird der Zeitpunkt der Grem2 Behandlung, die die Aktivität des Proteins und der Zustand der Zellen vor der Differenzierung werden sollte neu bewertet sicher sein, dass jede dieser Bedingungen optimiert ist, wie in diesem Protokoll beschrieben (siehe Diskussion).
Abbildung 5 zeigt die Ergebnisse , die typisch für Grem2 behandelten Kulturen und unbehandelten Kontrollen. RT-qPCR Analyse der Genexpression in den Zellen gesammelt und lysiert wie in 7,1-7,2 des Protokolls beschrieben typischerweise offenbaren hohe levels kardialer strukturellen und regulatorischen Gene in Grem2 behandelten Kulturen (5A). Wenn der & alpha; MHC-DsRed-Nuc - Zelllinie verwendet wird, kann die erhöhte Ausbeute an CMs visuell als eine höhere Anzahl von DsRed-markierte Kerne in Grem2-behandelten Vertiefungen (5B, unteres Feld) beobachtet werden.
Zusätzlich zur Bereitstellung einer erhöhten Anzahl von CMs zu erzeugen, vorspannt Grem2 Behandlung auch die Differenzierung zu einem Vorhof-ähnlichen Phänotyp. Die atriale Phänotyp ist in der Regel auf zwei Arten bestätigt. Zuerst RT-qPCR - Analyse von Zellen in 7,1-7,2 des Protokollabschnitt wie beschrieben gesammelt sollte zeigen , dass die Gene charakteristisch atrial CMs aufreguliert sind , während ventrikulärer Gene abreguliert werden (6A). Zweitens Patch Clamp Messungen von zellulären Aktionspotentialdauer (wie in 8,1-8,2 des Protokolls Abschnitt beschrieben) zeigt, dass eine kurze, Vorhofartige Wirkung Potential vorherrscht unter Grem2 treate d - Zellen (6B).
Abbildung 1. Repräsentative embryonalen Stammzellen der Maus (mESCs). Pluripotenten embryonalen Stammzellen der Maus vor dem EB Bildung mit charakteristischen großen Kern, kompakte koloniebildenden Morphologie (A, schwarze Pfeile), und weiße Phasengrenzen (A, orange Pfeile). Spontane Differenzierung von Maus - ES - Zellen wird durch größere, einzelne Zellen aus Kolonien (B, schwarze Pfeile) und der Verlust der Phasengrenze um Kolonien (B, orange Pfeil) getrennt angegeben. Bilder, die ein umgekehrtes Phasenkontrastmikroskop. Maßstabsbalken stellen 50 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Embryoidkörpern (EVG) am Tag 2 der Differenzierung. Hängende Tropfen aus einer Petrischale Deckel aufgehängt (links, Maßstabsbalken ist 2 cm) sind gleichmäßig verteilt und homogen in der Größe. EBs in hängenden Tropfen als kompakte Kugeln in der Mitte jeder Tropfen beobachtet werden (rechts, Maßstab ist 1 mm). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. EBs in Suspension am Tag 4 der Differenzierung. Ideal EBs sollte in Form und Größe mit minimaler Einhaltung miteinander oder der Unterseite der Platte homogen sein. Die Bilder wurden mit einem Binokular unter sterilen Bedingungen erfasst. Maßstabsbalken entspricht 100 & mgr; m.Last / 53919 / 53919fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Typische EB Morphologie nach der Plattierung. Plattiert EBs an den Tagen 8 (links) und 10 (rechts) der Differenzierung. Als EBs auf verkleisterte Platten befestigen, glätten sie und so dicht Zentren durch eine zunehmend konfluenten Monolayer von Zellen umgeben erscheinen. Kleine Taschen Zellen der Auftraggeber sind um Differenzierung Tage 6-8 in der Nähe der Mitte des EB im Allgemeinen beobachtet. Diese Taschen weiterhin im gesamten Differenzierung Protokoll zu größeren Blätter von Vertrags Zellen in den umliegenden Monolayern zu erweitern. Bilder, die unter Verwendung eines invertierten Phasenkontrastmikroskop und. Maßstabsbalken repräsentieren 200 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier um ein , um zu vergrößern Version dieser Figur.
Abbildung 5. Cardiac Differenzierung in Grem2 behandelten und nicht behandelten Kontrollvertiefungen. QPCR - Analyse von Herzmarker zeigt eine Zunahme in der Herz Genexpression in EBs mit Grem2 behandelt bereits Tag sechs und Weiter bis Tag 10 der Differenzierung (A). Hochentwickeltes & alpha; MHC-DsRed-Nuc Zelllinie zeigt große Pools von DsRed-markierten CMs in Kulturen mit Grem2 behandelt (B, unten) im Vergleich zu nicht behandelten Kontrollen (B, oben). Figuren mit freundlicher Genehmigung von 14 angepasst. Die Fehlerbalken SEM repräsentieren von mindestens 3 Wiederholungsversuchen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 6. Charakterisierung von atrialen artigen Herz Phänotyp. QPCR - Analyse zeigt eine Zunahme der Expression von Genen und atrial Herunterregulieren von Genen , die mit ventrikulären CMs in Grem2 behandelten Proben (A). Kontrollkulturen produzieren CMs mit Aktionspotentialdauer charakteristisch für atriale und ventrikuläre Zellen während der Behandlung mit Grem2 Zellpopulationen mit dem kurzen Aktionspotentialdauer charakteristisch atrialen Myozyten erzeugt (B). Die Proben wurden unter Verwendung von Student-t - Test verglichen. * P <0,05; *** P <0,001 Figuren mit freundlicher Genehmigung von 14 angepasst. Die Fehlerbalken SEM repräsentieren von mindestens 3 Wiederholungsversuchen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Video S1. Nicht behandelte Kontrollvertiefungen (Rechtsklick zum Herunterladen). Klein, langsam kontrahier Taschen oder Patches von Kardiomyozyten um den Umfang des EB (weiße Pfeile). Video wurde 10 an Differenzierung Tag genommen.
Video S2. Grem2-behandelten Wells (Rechtsklick zum Herunterladen) . Typische Ergebnisse in Grem2-behandelten Zellen beobachtet. Große Flecken schnell Vertrags Zellen werden während des gesamten plattierten EB beobachtet. Video wurde 10 an Differenzierung Tag genommen.
| Gen | | Reverse - Primer (5 'bis 3') | |
| Actin | CTACGAGGGCTATGCTCTCCC | CCGGACTCATCGTACTCCTGC |
| GAPDH | CTCACTCAAGATTGTCAGCAATG | GAGGGAGATGCTCAGTGTTGG |
| Gata4 | ACAAGGTCCAAGCCTACTCCA | CTGCGATGTCTGAGTGACAGG |
| Gja1 | ACAAGGTCCAAGCCTACTCCA | CCGGGTTGTTGAGTGTTACAG |
| Gja5 | ATAACAGTGGGCAGTTGAACAGCAG | TACCCAATAACGAATGTGGGAGATG |
| Myh6 | TACACTCTTCTCTACCTATGCTTCT | CACTATCTTCTTGAACTCAATGC |
| Myl2 | AGAGATCGATGAAATGATCAAAGAG | CAGAGCCAAGACTTCCTGTTTATT |
| Myl7 | AAATCAGACCTGAAGGAGACCTATT | CAGAGAGACTTGTAGTCAATGTTGC |
| Nkx2.5 | GTCTCAATGCCTATGGCTAC | CTACGTCAATAAAGTGGGATG |
| TNNT2 | CAGAGGAGGCCAACGTAGAAG | CTCCATCGGGGATCTTGGGT |
Tabelle 1. Liste der qPCR - Primersequenzen. Die Primersequenzen sind alphabetisch nach Gen Namen aufgelistet. Sequenzen sind 5 für alle Gene , die in den 5 und 6 analysiert 'nach 3' vorgesehen.
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Discussion
Dieses Protokoll erzeugt routinemßig Kulturen mit einem hohen Prozentsatz der CMs, die charakteristisch für die atriale lineage sind. Wie bei jeder Differenzierung Protokoll sollte die Qualität der mESCs vor der Differenzierung besondere Aufmerksamkeit geschenkt werden. mESCs sollten routinemäßig für die richtige Morphologie (Abbildung 1A) überwacht werden. Jede spontane Differenzierung , die vor der Bildung von EBs auftritt , wird stark die Effizienz der Kardiogenese begrenzen und sollte vor der Passagierung (1B) entfernt werden. EB Größe wirkt sich auch auf Kardiogenese. Startzellzahlen zwischen 200 und 1000 pro EB wurden getestet und 500 Zellen pro EB produziert routinemäßig die höchste Anzahl von CMs. Zellen, die am Tag vor der EB Bildung agiert werden, neigen auch effizienter zu differenzieren.
Die "hängenden Tropfen" Methode wird verwendet , 25 EBs in diesem Protokoll zu erzeugen. Andere Verfahren zur EBs verwendet für die kardiale Differenzierung ha machenbereits 26-29 berichtet. Die "hanging drop" Methode ist einfach und preiswert, leicht in jedem Labor mit gängigen Zellkulturausrüstung und Materialien anzuwenden sind, und kann von jedermann mit Zellkultur Erfahrung durchgeführt werden. Es ist auch vielseitig, die Herstellung von EBs, die leicht manipuliert werden können, übertragen, überzogen, oder gesammelt für RNA entsprechend den Bedürfnissen der Ermittler analysiert. Es ist auch skalierbar, kleine oder große Anzahlen von EBs produziert nach Bedarf.
Das Protokoll schreibt die Beschichtung von EBs auf mit Gelatine beschichtete Platten an Tag 4 der Differenzierung. Dieser Schritt wandelt EBs in den typischen einschichtigen Format gemeinsam Gewebekultur zu unterscheiden. In einigen Fällen kann es bequemer und oder notwendig sein, die EBs in der Schwebe zu lassen, anstatt Plattierung. Wenn Suspension EBs für Downstream-Anwendungen bevorzugt werden, können die Zellen statt in Suspension während des Differenzierungsprozesses werden links von 4 am Tag überzogen wird, wenn nämlich der Behandlung vonh Grem2 werden die EBs in 1,5 ml Zentrifugenröhrchen gegeben und durch die Schwerkraft absetzen gelassen. Das Medium wird dann vorsichtig mit einer P1000 entfernt, wobei eine kleine Menge Zurücklassung Aspiration der EBs zu verhindern, und 1,5 ml Grem2 Medium wird in das Röhrchen gegeben. Diese Suspension wird dann in eine 6 cm Petrischale überführt und bei 37 ° C platziert zurück. Das Medium wird geändert Verfahren unter Verwendung der Mikrozentrifugenröhrchen über alle zwei Tage angezeigt.
Differentiation Tag 4 wurde für die Behandlung von Zellen mit Grem2 ausgewählt basierend auf Expressionsanalyse von Genen im Allgemeinen mit großen Entwicklungs Ereignissen verbunden. Die Zugabe von Grem2 nach dem Peak Expression der Gastrulation Markergene T Brachyurie und Cerberus wie 1 und zu Beginn der Expression von Herzvorläuferzellmarker wie NKX2-5 ist sowohl entscheidend für die Herzentwicklung und Vorhof Spezifikation. Weil peak Expression dieser Gene leicht unter Zelllinien variieren kann, ist es empfehlenswert, die Expression dieser Gene während d zu überwachenifferentiation zu bestimmen optimalen Zeitpunkt für Grem2 hinaus. Der Linien für dieses Protokoll getestet, die meisten auf die Behandlung mit Grem2 zwischen den Tagen 4 und 5 der Differenzierung.
Wie bei jedem rekombinanten Proteins variiert die Aktivität von Grem2 von Los zu Los. Es wird daher empfohlen, dass Grem2 aus der gleichen Charge für jeden Satz von Experimenten verwendet wird Konsistenz aufrechtzuerhalten. Wenn eine neue Menge gekauft wird, Wirksamkeit kann durch Titrieren der Dosis im Bereich von 1-5 & mgr; g / ml bewertet. Dieses Protokoll liefert CMs aus der atriale lineage ausreichender Zahl für die Analyse und Kultur. Die Zellen mit diesem Protokoll erzeugt wird, kann über die Durchflusszytometrie, Elektrophysiologie, RT-qPCR oder neu kultiviert für den Einsatz in lebenden Zellen-Assays analysiert werden. Um die Identifizierung und Isolierung von CMs erleichtern nach der Kultur der & alpha; MHC-DsRed-Nuc Reporter Linie entwickelt wurde und wird routinemäßig in unserem Labor eingesetzt.
Dieses Protokoll verwendet Serum gesund ce zu haltenll Kulturen der Differenzierungsprozess. Während dieses Protokoll routinemäßig robust produziert, Vorhofartige Herzdifferenzierung, stellt die Verwendung von Serum ein undefiniertes Element an den Differenzierungsprozess. Dies kann Nützlichkeit des Protokolls in den Fällen beschränken, in denen eine definierte Medien erforderlich ist. Wenn eine definierte Medienherstellung erforderlich ist, Serum kann durch KnockOut Serum Ersatz 30 ersetzt werden. Wenn auf eine definierte Kulturmedien Schalt wird empfohlen, dass Zeitpunkt und die Konzentration von Grem2 Behandlung erneut optimiert werden, wie bereits in diesem Abschnitt beschrieben.
RT-qPCR wird verwendet, um die Expression von Genen, die spezifisch für atriale und ventrikuläre Myocyten zu quantifizieren. Grem2 Behandlung führt zu einer Induktion von Vorhof spezifischer Gene, während nach unten Regel oder nicht die Expression von ventrikulären Gene beeinflussen. Dieses Ergebnis ist typisch für Grem2-induzierte CMs. Eine vorgeschlagene Satz von Genen für die Beurteilung der Vorhof Identität wird in diesem Protokoll enthalten. Eine erweiterte Reihe von Gens und eine Diskussion ihrer Bedeutung kann durch dieses Protokoll 14,16 verwiesen in Werken. Da das Feld verbessert zu entwickeln und unser Verständnis der kardialen Differenzierung weiterhin wird empfohlen, dass diese Liste der atriale und ventrikuläre Identitätsmarker beurteilt und bei Bedarf überarbeitet.
Die Erzeugung homogener Kulturen von CMs wird die klinische Forschung Bemühungen erleichtern auf Krankheiten konzentriert bekannt spezifischen Herz Subtypen beeinflussen und ein Modellsystem sorgen für die Grundlagenforschung auf dem Verständnis der Mechanismen der Kammer Spezifikation konzentriert in wirbel Herzen.
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Acknowledgments
": Training in Untersuchungsprogramm in Herz-Kreislauf-Mechanismen" (JB) Diese Arbeit wurde durch NIH Zuschüsse HL083958 und HL100398 (AKH) und 2T32HL007411-33 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GMEM | Life Technologies | 11710 | |
| FBS | Life Technologies | 10082 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050 | |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
| ß-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Non-Essential Amino Acids | Sigma | M7145 | |
| 10 cm Tissue Culture Plates | Sarstedt | 83.3902 | |
| 10 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-342 | |
| 6 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-092 | |
| 6-well tissue culture plates | Sarstedt | 83.3920 | |
| Gremlin 2 recombinant protein | R&D Systems | 2069-PR-050 | |
| Sterile filter units | Thermo Fisher | 09-741-02 | |
| Gelatin (from porcine skin) | Sigma | G1890 | |
| 10X PBS, Sterile | Sigma | P5493 | |
| BSA | Sigma | 5470 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA solution | Life Technologies | 25300054 | |
| DPBS, no Calcium, no Magnesium | Life Technologies | 14200 |
References
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