Abstract
Protocolos para a produção de populações de cardiomiócitos a partir de células estaminais pluripotentes têm sido desenvolvidos, mas estes em geral produzem fenótipos de células misturadas. Os pesquisadores interessados em prosseguir estudos envolvendo subtipos miócitos específicas requerem uma abordagem diferenciação mais direcionado. Por tratamento de células estaminais embrionárias de ratinho (ES) com Grem2, um antagonista de BMP segregada que é necessário para a formação da câmara atrial in vivo, um grande número de células cardíacas com um fenótipo fibrilação pode ser gerado. A utilização da linha de células estaminais pluripotentes engenharia Myh6-DsRED-Nuc permite a identificação, selecção e purificação de cardiomiócitos. Neste protocolo de corpos embrióides são geradas a partir de células-Myh6 DsRED-Nuc, utilizando o método de gota suspensa e mantido em suspensão até ao dia diferenciação 4 (D4). Em células D4 são tratados com Grem2 e plaqueadas em placas revestidas com gelatina. Entre D8-D10 grandes áreas contratantes são observados nas culturas e continuar a expandir e mAture através d14. Molecular, as análises histológicas e electrophysiogical indicam células em células tratadas com Grem2 adquirir características atriais-como fornecendo um modelo in vitro para estudar a biologia dos cardiomiócitos atriais e a sua resposta aos vários agentes farmacológicos.
Introduction
As células estaminais pluripotentes são uma ferramenta poderosa para gerar e estudar as células de um hospedeiro de difícil acesso aos tecidos para estudos de investigação básica e pré-clínicos, especialmente em seres humanos 1-5. modulação correcta de vias de sinalização de desenvolvimento podem dirigir a diferenciação de células estaminais pluripotentes para o destino fenotípica desejada. Muitos protocolos têm sido desenvolvidos para gerar cardiomiócitos (CMS) a partir de células estaminais pluripotentes 6-14. Estes protocolos geralmente envolvem a modulação da superfamília TFGβ (Activina, BMP e TGF-p) e percursos através de adição atempada de factores exógenos de crescimento e / ou pequenas moléculas 10,12-15 Wnt. Estes protocolos são geralmente eficazes no aumento da percentagem de células que se tornam CMS, mas carecem de especificidade, produção de uma população mista de células que representam linhagens atrial, ventricular, e sistema nodal / condução. A fim de estudar cardíaca específica subtipos A appro diferenciação mais direcionadoACH é necessária.
Gremlin2 (Grem2, também chamada proteína relacionada com Dan e Cerberus ou CRS para o short) é um antagonista secretado BMP que é necessário para a diferenciação cardíaca adequada e formação de câmara atrial durante o desenvolvimento cardíaco em zebrafish 16. Tratar a diferenciação de células estaminais embrionárias com Grem2 diferenciação no dia 4, imediatamente depois do pico de expressão dos marcadores de mesodermal t-brachyury e Cerberus como 1, aumenta o rendimento de CMS e gera um conjunto de células predominantemente da linhagem auricular 14.
Grem2 recombinante é utilizado para tratar as células de diferenciação e pode ser feita usando técnicas de produção de proteínas padrão 17 ou podem ser adquiridos comercialmente. É altamente solúvel em soluções aquosas e pode ser adicionado exogenamente para culturas no ponto de tempo desejado.
A diferenciação pode ser rastreado usando RT-qPCR para quantificar a expressão de um representante marcadoresde progenitores cardiovasculares, progenitores cardíacos e comprometido CMs. Imunofluorescência também pode ser utilizado para identificar e visualizar a distribuição espacial dos tipos de células cardíacas.
As aplicações que requerem populações puras são mais facilmente realizado quando se utiliza um sistema repórter para identificar e isolar CMS. Para esse efeito, nós introduzimos a αMHC-DsRedNuc construir na linha de células de rato CGR8 ES 14. CGR8 células pluripotentes permanecem crescer e sem células alimentadoras, facilitando de expansão e de diferenciação 18 ensaios. A linha de células ES contém uma sequência de codificação de proteína fluorescente DsRed com um sinal de localização nuclear sob a alfa-específico cardíaco Miosina Cadeia Pesada (a Mhc ou Myh6) promotor do gene. Usando essas células, o CMS pode ser facilmente identificado e isolado para a quantificação, separação de células, eletrofisiologia, telas de drogas, e estudando mecanismos de diferenciação atrial.
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Protocol
1. Preparação de celular Meios de Cultura, soluções e reagentes.
- Prepare a 500 ml de células estaminais embrionárias rato (Mesc) dos suportes por mistura e filtragem esterilizada (0,2 um de tamanho de poro) 445 ml de Meio Essencial Mínimo de Glasgow (GMEM), 50 ml de soro de bovino fetal (FBS) inactivado, 5 mL de 100X concentrado L- substituição de glutamina, 5 ul de pequeno rato recombinante da leucemia factor inibidor (LIF) em 1 x 10 7 unidades por ml, e 1,43 uL de ß-mercaptoetanol (concentração final é de 50 uM). Armazenar a 4 ° C até que esteja pronto para uso.
- Preparar 500 ml de embrióides corpo (EB) meios de diferenciação por mistura e filtração estéril 391 ml de Iscove Modified Dulbecco Médio (IMDM), 100 ml de FBS inactivado pelo calor, 5 mL de 100X concentrado a reposição de L-glutamina, 5 mL de 100X concentrado aminoácidos não-essenciais (NEAA), e 2,86 ul de beta-mercaptoetanol (concentração final é de 100 uM). Guarde-o em 4˚ C até estar pronto para usar.
- Prepare a 0,2% wsolução / v de gelatina misturando 1 g de pó de gelatina de pele de porcino, com 500 ml de filtrado, H2O destilada Esterilizar em autoclave. Note-se que a gelatina pode não ser completamente solúvel em água à TA. Após autoclavagem a gelatina deve ser completamente dissolvido. Armazenar à temperatura ambiente até que esteja pronto para uso.
- Preparar alíquotas de proteína recombinante Grem2 por dissolução de 50 g de sedimento liofilizado Grem2 em 100 ul de fosfato salina tamponada (PBS) suplementado com 0,1% de BSA para fazer um / solução de estoque de 0,5 ug ul. Alíquota de 20 ul desta solução estoque em cinco tubos de 1,5 ml de centrífuga estéril e armazenar a -80˚ C até estar pronto para usar.
- Prepare PBS acordo com protocolos publicados ou compra como um estoque 10X e diluir 1:10 com filtrado, H2O destilada para fazer uma 1X diluição 19 trabalhando. Esterilizar por autoclavagem com PBS antes da utilização. Armazenar à temperatura ambiente até que esteja pronto para uso. Em alguns passos, DPBS sem Ca 2+ e Mg 2+ é usado. Este é purchased como uma solução 1X. Informações para encomendas está incluído na tabela de reagentes.
2. Preparação de 10 cm revestidas com gelatina de tecido placas de cultura
- Num capuz de cultura de tecidos esterilizadas adicionar 5 ml de solução de gelatina a 0,2% a cada placa de cultura de tecidos de 10 cm para revestimento. Coloque a loiça na incubadora a 37 C durante pelo menos 30 minutos ou até 4 dias.
3. Preparação de revestidos com gelatina de 6 poços de tecido placas de cultura
- Num capuz de cultura de tecidos esterilizadas adicionar 1 ml de gelatina a 0,2% a cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 6 poços. Colocar as placas em incubadora a 37 ° C durante pelo menos 30 minutos ou até 4 dias.
4. Cultura de Células-Tronco Embrionárias
- mESCs descongelamento
- Prepare Mesc meios de aquecimento até à temperatura ambiente num capuz de cultura de tecidos esterilizadas. Adicionam-se 10 ml de meio IR para um prato de 10 cm revestidas com gelatina.
- Remover um frasco de mESCs contendo aproximadamente 1 x 10 6 a partir de célulascryostorage. Segurando cryovial com pinças, coloque em banho-maria a 37 ° C. Agitar ligeiramente até a suspensão de células foi descongelada e apenas um pequeno cristal de gelo mantém-se no centro do frasco. Secar frasco com um sem fiapos pano descartável e esterilizar com 70% de EtOH.
- Em uma capa de cultura de tecidos estéreis remover as células descongeladas usando uma ponta P1000 de cryovial e transferir para placa de 10 cm preparadas em 4.1.1).
- Coloque placa de 10 cm em 37 ° C incubadora de cultura de células umidificada com 5% de CO 2 e distribuir uniformemente as células movendo levemente a frente da placa para trás, em seguida, lado a lado. Permitir que as células para anexar ao prato S / N ou, pelo menos, 6 horas.
- A primeira coisa que as células de verificação manhã seguinte para o anexo usando um microscópio de campo claro. Alguns restos celulares e células mortas serão observadas nos meios de comunicação. Isto é normal. media aspirado de pratos e substituir com 10 ml de meio Mesc frescos.
- Continuar a mudar de mídia em células todos os dias para evitar diferenciação.
- células de passagem quando 60-70% confluentes. Prepare células para passaging por aspiração de mídia e lavagem com 5 ml estéril 1X DPBS sem MgCl2 e CaCl2. Adicionar 2 ml de solução de 0,05% de tripsina-EDTA. Colocar na incubadora a 37 ° C durante 5 min.
- Enquanto as células são a incubação, preparar nova placa de 10 cm por aspiração solução de gelatina e adicionar 10 ml de meio RT MESC. Após 5 min verificar as células de desprendimento. Se as células permanecem ligados, continuar a incubar a 37 ° C durante 2 min em um tempo até que esteja completamente isolada.
- Quench tripsina-EDTA, adicionando 3 ml de meio MESC. Transferir suspensão de células para um tubo de centrífuga de 15 ml e de centrifugação a 200 xg durante 5 min para sedimentar. media aspirado de sedimento e re-suspensão em 10 ml de mídia Mesc.
- Dependendo da razão de separação desejado, adicionar 0,5-1,0 ml de suspensão de células a cada prato preparado no passo 4.2.2). Coloque prato em incubadora e distribuir uniformemente as células suavemente em movimento de trás para frente, em seguida, lado a lado. Todoscélulas ow para anexar O / N ou por pelo menos 12 horas.
NOTA: A razão de separação das 01:10 ao 01:20 é comum para a maioria das linhas Mesc. Esta proporção pode variar, dependendo da linha usado, número de passagem, e confluência desejado no novo prato. Para uma separação 01:10 Taxa de transferência de 1 ml de suspensão de células em 9 ml de meio e Mesc placa numa placa de 10 cm revestidas com gelatina recentemente preparada.
5. Preparação de corpos embrióides
NOTA: Todas as etapas, exceto a centrifugação são realizados em uma capa de cultura de tecidos estéreis.
- Preparação da suspensão de células em EB mídia
- Após a 70% de confluência (geralmente 24-48 horas pós-passagem), usar as células para a formação de EB. Prepare células para a formação de EB, desprendendo e peletização acordo com os pontos 4.2.1) - 4.2.3).
Nota: (., Por exemplo, muito pouca morte celular, sem contaminação, a morfologia adequada) É melhor para células de passagem pelo menos uma vez de pós-descongelamento e verificar para a saúde e crescimento robusto (e.g., duplicações da população que ocorrem a cada 24-48 horas) antes de usar para fazer EBS. - Re-suspender pellet em 5 ml de mídia EB. Contagem de células utilizando um hemocitómetro ou contador de células automatizado.
- Dilui-se a suspensão de células no volume necessário de meios EB para fazer uma concentração final de 25 células / uL (ou 2,5 x 10 3 células / ml). Note-se que cada tampa de uma placa de petri contém cerca de 60 EB e requer cerca de 1,3 ml de suspensão de células. Nesta etapa, preparar um volume suficiente de suspensão de células para gerar o número desejado de EBS. Por exemplo, se EBs 240 são necessários para a experiência, preparar 5,2 ml a 2,5 x 10 3 células / ml.
NOTA: mESCs que não são usados para a formação de EB pode ser utilizado para experiências futuras girando para baixo, re-suspensão em meios Mesc e plaqueamento tal como descrito na secção 4.2.
- Após a 70% de confluência (geralmente 24-48 horas pós-passagem), usar as células para a formação de EB. Prepare células para a formação de EB, desprendendo e peletização acordo com os pontos 4.2.1) - 4.2.3).
- Criação de corpos embrióides
- Prepare estéreis de 10 cm placas de petri bacterianas para pendurar formação da gota através da adição de 2 ml de PBS 1X para a parte inferior do each.
- Transferir suspensão EB do passo 5.1) para uma bacia de solução estéril.
- Remover a tampa do prato de petri preparada e depositar cuidadosamente sessenta, 20 ul de suspensão de gotas EB sobre a superfície interior. Conseguir isso de forma eficiente usando uma pipeta multi-canal equipado com 6 dicas. Cada gota de 20 ul agora tem 500 células.
- Gentilmente substituir tampa sobre metade inferior da bacteriana petri-prato, tomando cuidado para não desalojar pendurado gotas. Coloque pratos na incubadora de cultura celular a 37˚ C. Depois de 2 dias, as células estão prontas para lavar como descrito em 5.3).
- Wash-down de corpos embrióides
Nota: Todos os passos de lavagem para baixo são realizadas em uma capa de cultura de tecido estéril.- Após 2 dias EB de estão prontos para a lavagem para baixo e transferir para 6 cm placas de petri bacterianas. Pré-quente 3 ml de meio EB por caixa de Petri até à TA. Cada placa de Petri de 6 cm bacteriana pode efetivamente realizar 2 tampas no valor de pendurar gotas.
Nota: Certifique-se de usar um prato de petri f não revestidoou este passo (veja a tabela materiais). Não utilizar uma placa de cultura de tecido ou de qualquer outra superfície que encoraja a adesão celular. EBs deverão permanecer suspensas em meio até estar pronto para ser banhado como descrito na seção 6. - Retirar 10 cm placas de Petri de incubadora e colocar em estéril capuz de cultura de tecidos. Remova cuidadosamente tampa com EBS e inclinar em um ângulo de 45 graus.
- Usando uma pipeta serológica 5 ml contendo 3 ml de meio EB RT, lavar cuidadosamente EBs em uma piscina, na parte inferior da tampa. Verifique cuidadosamente a tampa para EBs que estão presas à superfície e re-lavagem, se necessário.
- Depois de lavar todos EBs transferência para uma placa de Petri 6 cm.
- Repita os passos 5.3.2) -5.3.4) para todos os EBS. Cada placa de Petri de 6 centímetros deve conter CEs a partir de duas tampas 10 cm. Coloque todos os pratos de volta para incubador a 37 ° C durante mais dois dias.
NOTA: EBs que estão muito perto juntos em suspensão pode ficar juntos e formar grandes agregados. Isso pode afetar negativamente a eficiência diferenciação cardíacabem como reduzir significativamente o número de disponível EBS. Para prevenir a agregação, a EBS deve ser verificado a cada dia e separados por gentilmente se movendo para trás e para a frente, em seguida, lado a lado. O uso de pratos de bactérias nos passos de diferenciação precoce é necessária para impedir a fixação EB para o prato e permitir EBS para crescer em suspensão.
- Após 2 dias EB de estão prontos para a lavagem para baixo e transferir para 6 cm placas de petri bacterianas. Pré-quente 3 ml de meio EB por caixa de Petri até à TA. Cada placa de Petri de 6 cm bacteriana pode efetivamente realizar 2 tampas no valor de pendurar gotas.
6. Galvanização e Tratamento de EBs Com Grem2
- Prepare Grem2 meio de tratamento através da adição de um volume suficiente de estoque (0,5 ug / uL) de meio de RT Grem2 EB para uma diluição final de 1-5 ug / ml.
NOTA: A concentração eficaz para o tratamento da EBS varia dependendo da linha celular e a actividade específica do lote corrente de Grem2. Recomenda-se que, antes de usar a dose é titulada para encontrar a eficácia máxima. Para a linha CGR8 MESC que usam rotineiramente 3-5 ug / ml de Grem2. concentrações eficazes de Grem2 para a geração de miócitos atrial irá produzir células rapidamente contratantes entredias 7-8 que são comuns ao longo de cada bem. Se fenótipo contratação não é observado em culturas tratadas, recomenda-se que o Grem2 dose seja titulada dentro do intervalo indicado. - Preparar as placas de cultura de tecidos de 6 cavidades por aspiração solução de revestimento de gelatina a partir de cada cavidade e a adição de 2 ml de RT Grem2 meio de tratamento. Remover EBs da incubadora e coloque em estéril capa de cultura de tecidos.
- Usando um P1000 ajustado para 100 ul de transferência 30 CEs a partir de 6 cm pratos de Petri para cada poço. Coloque EBs em incubadora e uniformemente dispersar por movendo-se delicadamente placa trás para a frente, em seguida, lado a lado.
- Depois de EBs ter anexado a poços revestidos com gelatina, substituir a mídia Grem2 a cada dois dias até o dia 10. Após o dia 10, interrompa o tratamento Grem2 e adicionar mídia EB frescos a cada dois dias para manter as células saudáveis.
NOTA: Depois de ligar, o EBS vai achatar ao longo da superfície da placa revestida.
- Depois de EBs ter anexado a poços revestidos com gelatina, substituir a mídia Grem2 a cada dois dias até o dia 10. Após o dia 10, interrompa o tratamento Grem2 e adicionar mídia EB frescos a cada dois dias para manter as células saudáveis.
7. A dissociação celular para RT-qPCR Analysis
- A dissociação celular com tripsina-EDTA
- Meios Aspirar cada cavidade e lavar duas vezes com 1 ml por poço de DPBS estéril menos Ca 2+ e Mg 2+.
- Adicionar uma solução de tripsina-EDTA esterilizado de 0,5 mL de 0,25% a cada poço a partir da qual será recolhido células.
- Coloque placa na incubadora a 37 ° C durante 5 min.
- Após 5 min células de seleção para a dissociação. Se as células ainda permanecem ligados para baixo da torneira bem delicadamente para soltar. Se batida não soltar as células, coloque de volta para incubadora e monitorar cada 2 min até que as células são completamente separada.
- Neutralizar solução de tripsina-EDTA, adicionando 0,5 ml de meio EB para cada poço.
- Transfira a totalidade de 1 ml de suspensão de células para um tubo de centrífuga de 1,5 ml de micro.
- células de pelotas por centrifugação numa centrífuga de bancada durante 5 minutos a 300 x g.
- Aspirar media de pellet e passar para lise imediatamente ou loja de pellet a -70 ° C até que esteja pronto para a lise. Ter longom de armazenamento de peletes não é recomendado pois pode conduzir à degradação do ARN.
- Lise celular e Análise Molecular
- Neste ponto, as células estão prontas para o isolamento de ARN utilizando um kit de extracção de coluna comercial ou utilizando o reagente de extracção de ARN de acordo com os protocolos fornecidos pelo fabricante (ver tabela de materiais). Uma vez isolado, ARN transcrito reverso e utilizar ADNc para análise de RT-qPCR utilizando técnicas padrão de 20, 21.
NOTA: Os iniciadores utilizados por este laboratório por RT-qPCR estão listadas na Tabela 1. identidade Atrial é confirmada usando uma combinação de RT-qPCR de olhar para a expressão de genes atriais e ventriculares e eletrofisiologia à ação registro duração do potencial (ver secção 8). A selecção de genes está incluído neste protocolo como um exemplo de marcadores auriculares e ventriculares fiáveis. Outras informações sobre a fibrilação ventricular e a expressão do gene no contexto de diferenciação de células estaminais pluripotentes é encontrado na referência 14. </ Li>
- Neste ponto, as células estão prontas para o isolamento de ARN utilizando um kit de extracção de coluna comercial ou utilizando o reagente de extracção de ARN de acordo com os protocolos fornecidos pelo fabricante (ver tabela de materiais). Uma vez isolado, ARN transcrito reverso e utilizar ADNc para análise de RT-qPCR utilizando técnicas padrão de 20, 21.
8. Análise eletrofisiológica
- A dissociação celular com colagenase
- meios Aspirar cada cavidade e lavar duas vezes com 1 ml por poço de PBS estéril.
- Adicionar 0,5 ml de 1 mg / ml de solução de colagenase a cada poço.
- Coloque placa na incubadora a 37 ° C durante 10 min.
- Após 5 min células de seleção para a dissociação. Se as células permanecem ainda ligados uns aos outros ou a parte inferior da torneira bem suavemente para soltar. Além disso dissociar as células por trituração suave com um P1000.
NOTA: Para facilitar remendo células gravações braçadeira deve ser triturado até obter uma suspensão de uma única célula é alcançada. - Adicionar 0,5 ml de meio EB a cada poço e misturar por pipetagem.
- Transfira a totalidade de 1 ml de suspensão de células para um tubo de centrífuga de 1,5 ml de micro.
- células de pelotas por centrifugação numa centrífuga de bancada durante 5 minutos a 300 x g.
- Aspirar meios de sedimentos celulares.
- células em 500 suspender novamenteul PBS com FBS 10%, tendo a certeza de triturar em uma suspensão de células individuais.
- Caracterização eletrofisiológica.
NOTA: Muitos excelentes protocolos foram publicados nesta revista sobre o uso de patch clamp única célula para medir potenciais de membrana celular. Para obter informações detalhadas sobre como realizar patch de uma única célula prender o leitor iniciante é referido estes protocolos 21-24. O seguinte contém informações específicas para este protocolo que irá ajudar o electrophysiologist experiente preparar e lidar com MESC derivado CMs para a caracterização do subtipo.- Preparar a solução de gravação intracelular composta do seguinte: tampão 10 mM de HEPES, MgATP 5 mM, EGTA 2 mM, glutamato de potássio 110 mM, KCl 10 mM, e NaCl 10 mM. Ajustar solução para um pH de 7,2 usando NaOH.
- Preparar a solução de composto a seguinte gravação extracelular (banho): HEPES 2 mM, glicose 10 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2 2 mM, KCl 5,4 mM, e 137MM de NaCl. Ajustar solução para um pH de 7,4 usando NaOH.
- Prepare uma pipeta de vidro que mede 2-5 resistência mohms quando preenchidos com solução de gravação usando o vidro de borosilicato padrão com filamento.
- Transferência de 100 ul de suspensão de células em câmara de gravação contendo solução de gravação extracelular utilizando um P200.
NOTA: As células podem ser patched ou em suspensão, para facilitar o manuseamento e o uso para o tratamento de droga e / ou ensaios de perfusão, podem ser semeadas em uma lamela revestida de gelatina, conforme descrito em 8.2.5). - Prepare revestidos com gelatina lamelas de vidro através da colocação de 10 mm de diâmetro lamela de vidro em cada poço de uma placa de 6 poços e cobrindo com uma solução de gelatina, tal como descrito na secção 3.1) deste protocolo.
- Depois de aspirado de solução de gelatina, pelo menos, 30 min e adicionar 100 ul de células suspensas directamente a lamela e colocar toda a placa de 6 poços na incubadora durante pelo menos 2 horas ou até que as células tenham anexado. Após as células foram ligados, rlamela emove e coloque em gravação de câmara com solução de gravação extracelular.
NOTA: Se estiver usando o fluorescente linha MESC repórter cardíaca αMHC-DsRed, CMS podem ser identificados por seus núcleos fluorescentes vermelhas. Se não utilizando uma linha de repórter cardíaca, células espontaneamente contratantes podem ser observados e isolado para as medições. células-tronco pluripotentes derivadas CMs são geralmente menores e mais arredondada, sem a morfologia rectangular característico de adultos totalmente formado miócitos cardíacos.
- Depois de aspirado de solução de gelatina, pelo menos, 30 min e adicionar 100 ul de células suspensas directamente a lamela e colocar toda a placa de 6 poços na incubadora durante pelo menos 2 horas ou até que as células tenham anexado. Após as células foram ligados, rlamela emove e coloque em gravação de câmara com solução de gravação extracelular.
- Faça todas as gravações a 37 ° C. Remendar células individuais usando braçadeira de célula inteira no modo de corrente-clamp com uma pipeta de vidro de borosilicato de 2-5 resistência mohms. Use pressão negativa suave para alcançar selo gigaohm antes de obter acesso à célula inteira. Aplicar pressão negativa rápida à ruptura da membrana e obter acesso célula inteira antes de gravar potenciais de membrana.
- Evocam os potenciais de ação usando 4 ms despolarizantes injeções atuais.
NOTA:Para a CMS-PSC derivada a quantidade de corrente necessária para desencadear potenciais de acção reprodutível pode variar. A fim de encontrar a corrente limiar óptimo, comece a uma amplitude de corrente actual e provocando aumento relativamente baixa de forma gradual até potenciais de acção reprodutíveis são obtidos.
NOTA: Acção durações potenciais para miócitos atriais induzidas Grem2 são geralmente na gama de 20-40 ms e carecem de um fase de plateau (Figura 6B).
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Representative Results
Antes de diferenciação, as células estaminais pluripotentes deve ser compacta e isenta de diferenciação espontânea. As células mostrados na Figura 1A está pronto para ser singularizados e usado para pendurar gotas, tal como descrito no ponto 5.1 da secção de protocolo. As células mostradas na Figura 1B estão diferenciação espontânea e não deve ser utilizada para a preparação de gotas de suspensão.
Os painéis incluídos na Figura 2 mostram EBs formados com sucesso no dia diferenciação 2. Qualidade EBs formam geralmente melhor dentro uniformemente espaçados, suspensão bem arredondado cai como mostrado na Figura 2. Por dia diferenciação 2, o EBS deve ser visível a olho nu como arranjos esféricos de diferenciar células-tronco nas pontas das gotas de suspensão (Figura 2). Estes EBs estão prontos para a lavagem para baixo, conforme descrito no ponto 5.3 da seção de protocolo.
Durante os dias 2-4, o EBS lavou-down em suspensão deve continuar a crescer em tamanho. No dia 4, o EBS bem formadas deve ser de livre flutuação e homogéneas em tamanho e forma (Figura 3). EBS mostrado na Figura 3 estão prontas para serem transferidas para placas pré-revestidas e tratadas com Grem2 como descrito na secção de 6,1-6,3 do protocolo.
Uma vez chapeado, EBs deve achatar como as células migram para fora da EB sobre a superfície da placa de cultura de tecido. Mostrado na Figura 4 são exemplos de EBs correctamente ligadas dias diferenciação 8 (painel da esquerda) e 10 (painel da direita). As células devem continuar a ser monitorado diariamente para ter certeza que eles permanecem ligados e para verificar se há diferenciação cardíaca, tal como descrito abaixo.
células contratantes, indicando a presença de CMs, pode ser observado tão cedo como o dia6 e tão tarde como o dia 9. Normalmente, as células contratantes estarão presentes no dia 8 de diferenciação. Os números de células contrair em cada poço deve continuar a aumentar até ao dia 14. No diferenciação não tratado poços de controlo são observadas pequenas manchas, lentamente contratantes (Video S1), enquanto em Grem2 tratados poços grandes manchas com uma taxa de contratação relativamente rápido são comuns ( Vídeo S2). Ocasionalmente, diferenciação cardíaca deixa de ocorrer. Em tais casos o tempo de tratamento Grem2, a actividade da proteína, e do estado das células antes da sua diferenciação deverá ser reavaliado para ter a certeza de que cada uma destas condições for optimizada, conforme descrito neste protocolo (ver discussão).
A Figura 5 mostra os resultados típicos de culturas tratadas com Grem2 e controlos não tratados. análise de RT-qPCR da expressão do gene em células colhidas e lisadas como descrito no 7,1-7,2 secção do protocolo tipicamente revelam alta LevELS de genes estruturais e reguladoras cardíacas em culturas tratadas com Grem2 (Figura 5A). Se a linha de células αMHC-DsRed-Nuc está a ser utilizado, o aumento do rendimento de CMS pode ser observada visualmente como um maior número de núcleos marcados DsRed em poços tratados com Grem2 (Figura 5B, painel inferior).
Além de gerar um aumento do número de CMs, o tratamento Grem2 também influencia a diferenciação no sentido de uma atrial como fenótipo. O fenótipo auricular é normalmente efectuado de duas maneiras. Primeiro, a análise de RT-qPCR de células recolhidas como descrito na secção de 7,1-7,2 protocolo deve revelar que os genes característicos da fibrilação CMS são regulados positivamente, enquanto os genes ventriculares são regulados negativamente (Figura 6A). Em segundo lugar, as medições de patch clamp de potencial de acção celular duração (conforme descrito na secção de 8,1-8,2 do protocolo) revela que um curto, o potencial de acção atrial semelhante predomina entre Grem2 treate células D (Figura 6B).
Figura 1. células-tronco embrionárias Representante (mESCs). Rato pluripotentes células estaminais embrionárias antes da formação EB com grande núcleo característico, a morfologia de formação de colónias compacto (A, setas pretas), e as fronteiras de fase brancos (A, setas laranja). Diferenciação espontânea de células-tronco embrionárias de rato é indicado por células maiores, individuais separados das colónias (B, setas pretas) e perda de fronteira de fase em torno colónias (B, seta cor de laranja). Imagens capturadas usando um microscópio de contraste de fase invertida. Barras de escala representam 50 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. corpos embrióides (EBS) no dia 2 de diferenciação. Hanging gotas suspensas de uma tampa placa de Petri (esquerda, barra de escala é de 2 cm) são espaçadas e homogênea no tamanho. EBs em gotas de suspensão são observados como esferas compactas no centro de cada gota (à direita, barra de escala é de 1 mm). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. EBs em suspensão no dia 4 de diferenciação. Ideal EBs deve ser homogéneo em forma e tamanho com a adesão mínima uns aos outros ou a parte inferior da placa. As imagens foram capturadas usando um escopo de dissecação em condições estéreis. A barra de escala representa 100 fim.carga / 53919 / 53919fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. morfologia típica EB após o plaqueamento. Banhado EBs nos dias 8 (esquerda) e 10 (direita) de diferenciação. Como EBs anexar placas gelatinizado, eles achatar e aparecem como centros densos rodeado por uma monocamada cada vez mais confluente de células. Pequenas bolsas de células contrair são geralmente observadas em torno de dias de diferenciação 6-8 perto do centro da EB. Estas bolsas continuam a se expandir ao longo do protocolo de diferenciação para formar maiores folhas de células contratação nas monocamadas circundantes. As imagens capturadas usando um microscópio de contraste de fase invertida e. Barras de escala representam 200 m. Por favor clique aqui para ver uma maior versão desta figura.
Figura 5. cardíaca diferenciação em poços de controlo Grem2-tratados e não tratados. QPCR análise de marcadores cardíacos indica um aumento na expressão do gene cardíaca em EBs tratada com Grem2 tão cedo quanto seis dias e continuando até ao dia 10 de diferenciação (A). A linha de células αMHC-DsRed-Nuc engenharia mostra grandes grupos de CMs DsRed marcado em culturas tratadas com Grem2 (B, abaixo) vs. controles não tratados (B, em cima). Figuras adaptado com permissão de 14. As barras de erro representam SEM de pelo menos 3 experiências duplicadas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 6. Caracterização do fenótipo cardíaco auricular semelhante. QPCR análise indica um aumento na expressão de genes e atriais regulação negativa dos genes associados com o CMS ventriculares em amostras tratadas Grem2 (A). As culturas de controlo produzir CMs com potencial de acção duração característica de células atriais e ventriculares, enquanto o tratamento com Grem2 gera populações de células com o potencial de acção curta duração característica de miócitos atriais (B). As amostras foram comparadas pelo teste t de Student. *, P <0,05; ***, P <0,001 Figuras adaptado com permissão de 14. As barras de erro representam SEM de pelo menos 3 experiências duplicadas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo S1. Poços de controlo não tratados (clique direito para baixar). Bolsos Pequeno, lentamente-contratantes ou manchas de miócitos cardíacos em torno da periferia do EB (setas brancas). Vídeo foi feito no dia 10 de diferenciação.
Video S2. Poços tratados com Grem2 (clique com o botão direito para baixar) . Os resultados típicos observada em células tratadas com Grem2. Grandes manchas de células rapidamente contratantes são observados ao longo do EB banhado. Vídeo foi feito no dia 10 de diferenciação.
| Gene | | Iniciador reverso (5 'para 3') | |
| actina | CTACGAGGGCTATGCTCTCCC | CCGGACTCATCGTACTCCTGC |
| GAPDH | CTCACTCAAGATTGTCAGCAATG | GAGGGAGATGCTCAGTGTTGG |
| GATA4 | ACAAGGTCCAAGCCTACTCCA | CTGCGATGTCTGAGTGACAGG |
| Gja1 | ACAAGGTCCAAGCCTACTCCA | CCGGGTTGTTGAGTGTTACAG |
| Gja5 | ATAACAGTGGGCAGTTGAACAGCAG | TACCCAATAACGAATGTGGGAGATG |
| Myh6 | TACACTCTTCTCTACCTATGCTTCT | CACTATCTTCTTGAACTCAATGC |
| Myl2 | AGAGATCGATGAAATGATCAAAGAG | CAGAGCCAAGACTTCCTGTTTATT |
| Myl7 | AAATCAGACCTGAAGGAGACCTATT | CAGAGAGACTTGTAGTCAATGTTGC |
| Nkx2.5 | GTCTCAATGCCTATGGCTAC | CTACGTCAATAAAGTGGGATG |
| TNNT2 | CAGAGGAGGCCAACGTAGAAG | CTCCATCGGGGATCTTGGGT |
Sequências Tabela 1. Lista de sequências de iniciadores de qPCR. Primer estão listados em ordem alfabética pelo nome do gene. As sequências são fornecidas 5 'para 3' para todos os genes analisados nas Figuras 5 e 6.
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Discussion
Este protocolo rotineiramente produz culturas com uma elevada percentagem de CMS que são característicos da linhagem atrial. Como acontece com qualquer protocolo de diferenciação, a qualidade dos mESCs anteriores à diferenciação deve ser dada especial atenção. mESCs devem ser monitorizados por rotina para a morfologia adequada (Figura 1A). Qualquer diferenciação espontânea que ocorre antes da formação da EBS irá limitar severamente a eficiência de CARDIOGENESIS e deve ser removido antes passaging (Figura 1B). tamanho EB também afecta CARDIOGENESIS. Começando o número de células entre 200 e 1.000 por EB foram testados e 500 células por EB produz rotineiramente o maior número de CMs. As células que são passadas no dia anterior à formação EB também tendem a diferenciar de forma mais eficiente.
O método "pendurado queda" é usado para gerar EBs neste protocolo 25. Outros métodos para fazer EBs utilizados para cardíaca ha diferenciaçãove sido relatados 26-29. O método "gota em suspensão" é simples e barato, facilmente adoptado em qualquer laboratório com equipamento comum de cultura de células e materiais, e pode ser realizado por qualquer pessoa com experiência de cultura de células. Também é versátil, produzindo EBs que podem ser facilmente manipuladas, transferidos, chapeado, ou recolhidas para análise de ARN de acordo com as necessidades dos investigadores. Também é escalável, produzindo pequenos ou grandes números de EBs conforme necessário.
O protocolo determina o chapeamento da EBS em placas revestidas de gelatina no dia 4 de diferenciação. Esta etapa converte a diferenciação EBs para o formato monocamada mais típico comum para cultura de tecidos. Em alguns casos, pode ser mais conveniente ou necessário e deixar os CEs em suspensão em vez de plaqueamento. Se EBs suspensão são preferidos para aplicações a jusante as células podem ser deixadas em suspensão em todo o processo de diferenciação, em vez de serem plaqueadas no dia 4. Ao tratar with Grem2, as EBs são colocados em tubos de 1,5 ml de centrífuga e deixada em repouso por gravidade. O meio é então cuidadosamente removido com um P1000, deixando para trás uma pequena quantidade para prevenir a aspiração de EBS, e 1,5 ml Grem2 meios é adicionada ao tubo. Esta suspensão é então transferida para uma placa de Petri 6 cm e colocado de volta a 37˚C. A mídia é alterado usando o método de micro tubo de centrífuga acima indicada a cada dois dias.
Diferenciação dia 4 foi escolhido para o tratamento de células com Grem2 com base na análise de genes geralmente associados com os principais eventos de desenvolvimento de expressão. A adição de Grem2 após expressão pico dos genes marcadores gastrulação t brachyury e Cerberus como 1 e no início da expressão de marcadores de células progenitoras cardíacas, tais como Nkx2-5 é crítica para ambos CARDIOGENESIS especificação e fibrilação. Uma vez que a expressão destes genes de pico pode variar um pouco entre as linhas celulares, recomenda-se monitorar a expressão destes genes durante differentiation para determinar momento ideal para Grem2 disso. Das linhas testadas para este protocolo, a maioria respondeu ao tratamento com Grem2 entre os dias 4 e 5 de diferenciação.
Tal como com qualquer proteína recombinante, a actividade de Grem2 varia de lote para lote. Por conseguinte, recomenda-se que Grem2 a partir do mesmo lote são utilizadas para cada conjunto de experiências para manter a consistência. Quando um novo lote é comprado, a eficácia pode ser avaliada por titulação da dose no intervalo de 1-5 ug / ml. Este protocolo resulta CMs da linhagem atrial em número suficiente para análise e cultura. Células produzidas usando este protocolo pode ser analisada através de citometria de fluxo, eletrofisiologia, RT-qPCR, ou re-cultivadas para uso em ensaios de células vivas. Para facilitar a identificação e isolamento de CMs após o cultivo da linha repórter αMHC-DsRed-Nuc foi desenvolvido e é utilizado rotineiramente por nosso laboratório.
Este protocolo utiliza soro para manter ce saudávelll culturas em todo o processo de diferenciação. Embora este protocolo produz rotineiramente robusta, diferenciação cardíaca atrial-like, utilização de soro introduz um elemento indefinido para o processo de diferenciação. Isso pode limitar a utilidade do protocolo nos casos em que é necessária uma mídia mais definido. Se uma preparação de meios mais definido é necessário, o soro pode ser substituído por substituição KnockOut Soro 30. Quando a mudança para um meio de cultura definido recomenda-se que o tempo e concentração do tratamento Grem2 ser re-otimizado como já descrito nesta seção.
RT-qPCR é utilizada para quantificar a expressão de genes específicos de miócitos atriais e ventriculares. Grem2 tratamento conduz a uma indução de genes específicos atriais enquanto para baixo para regulação ou não afectar a expressão de genes ventriculares. Este resultado é típico para CMS-induzidas Grem2. Um conjunto sugerido de genes para avaliar identidade atrial está incluído neste protocolo. Um conjunto expandido de genes e uma discussão sobre sua relevância pode ser encontrada em obras referenciadas por este protocolo 14,16. Como o campo continua a evoluir e nossa compreensão da diferenciação cardíaca melhora recomenda-se que esta lista de marcadores de identidade atriais e ventriculares é avaliado e revisto conforme necessário.
Geração de culturas homogêneas de CMS irá facilitar os esforços de investigação clínica com foco em doenças conhecidas para afetar subtipos cardíacas específicas e fornecer um sistema modelo para a pesquisa básica focada na compreensão dos mecanismos de especificação de câmara em corações de vertebrados.
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Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo NIH concede HL083958 e HL100398 (AKH) e 2T32HL007411-33 "Programa em Mecanismos Cardiovasculares: Formação em Investigação" (JB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GMEM | Life Technologies | 11710 | |
| FBS | Life Technologies | 10082 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050 | |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
| ß-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Non-Essential Amino Acids | Sigma | M7145 | |
| 10 cm Tissue Culture Plates | Sarstedt | 83.3902 | |
| 10 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-342 | |
| 6 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-092 | |
| 6-well tissue culture plates | Sarstedt | 83.3920 | |
| Gremlin 2 recombinant protein | R&D Systems | 2069-PR-050 | |
| Sterile filter units | Thermo Fisher | 09-741-02 | |
| Gelatin (from porcine skin) | Sigma | G1890 | |
| 10X PBS, Sterile | Sigma | P5493 | |
| BSA | Sigma | 5470 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA solution | Life Technologies | 25300054 | |
| DPBS, no Calcium, no Magnesium | Life Technologies | 14200 |
References
- Loya, K., Eggenschwiler, R., et al. Hepatic differentiation of pluripotent stem cells. Biological Chemistry. 390 (10), 1047-1055 (2009).
- Narazaki, G., Uosaki, H., et al. Directed and systematic differentiation of cardiovascular cells from mouse induced pluripotent stem cells. Circulation. 118 (5), 498-506 (2008).
- Zhang, Y., Pak, C., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Park, I. H., Arora, N., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Golos, T. G., Giakoumopoulos, M., Garthwaite, M. A. Embryonic stem cells as models of trophoblast differentiation: progress, opportunities, and limitations. Reproduction. 140 (1), 3-9 (2010).
- Boheler, K. R., Czyz, J., Tweedie, D., Yang, H. T., Anisimov, S. V., Wobus, A. M. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells Into cardiomyocytes. Circulation Research. 91 (3), 189-201 (2002).
- Burridge, P. W., Anderson, D., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25 (4), 929-938 (2007).
- Cai, C. L., Liang, X., et al. Isl1 Identifies a cardiac progenitor population that proliferates prior to differentiation and contributes a majority of cells to the heart. Developmental Cell. 5 (6), 877-889 (2003).
- Fujiwara, M., Yan, P., et al. Induction and enhancement of cardiac cell differentiation from mouse and human induced pluripotent stem cells with Cyclosporin-A. PLoS ONE. 6 (2), e16734 (2011).
- Rai, M., Walthall, J. M., Hu, J., Hatzopoulos, A. K. Continuous antagonism by Dkk1 counter activates canonical wnt signaling and promotes cardiomyocyte differentiation of embryonic stem cells. Stem Cells and Development. (1), 54-66 (2012).
- Burridge, P. W., Matsa, E., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Lian, X., Zhang, J., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Zhang, J., Klos, M., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Tanwar, V., Bylund, J. B., et al. Gremlin 2 promotes differentiation of embryonic stem cells to atrial fate by activation of the JNK signaling pathway. Stem Cells. 32 (7), 1774-1788 (2014).
- Kattman, S. J., Witty, A. D., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
- Müller, I. I., Melville, D. B., et al. Functional modeling in zebrafish demonstrates that the atrial-fibrillation-associated gene GREM2 regulates cardiac laterality, cardiomyocyte differentiation and atrial rhythm. Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 332-341 (2013).
- Kattamuri, C., Luedeke, D. M., Thompson, T. B. Expression and purification of recombinant protein related to DAN and cerberus (PRDC). Protein Expression and Purification. 82 (2), 389-395 (2012).
- Schulz, H., Kolde, R., et al. The FunGenES Database: A genomics resource for mouse embryonic stem cell differentiation. PLoS ONE. 4 (9), e6804 (2009).
- Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using Real-Time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Beck, H., Semisch, M., Culmsee, C., Plesnila, N., Hatzopoulos, A. K. Egr-1 regulates expression of the glial scar component phosphacan in astrocytes after experimental stroke. American Journal of Pathology. 173 (1), 77-92 (2008).
- Graham, E. L., Balla, C., Franchino, H., Melman, Y., del Monte, F., Das, S. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
- Sachinidis, A., Fleischmann, B. K., Kolossov, E., Wartenberg, M., Sauer, H., Hescheler, J. Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).
- Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 862-869 (1995).
- Höpfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Volume 2: molecular embryo analysis, live imaging, transgenesis, and cloning. Methods in Molecular Biology. , 254-279 (2004).
- Ao, A., Williams, C. H., Hao, J., Hong, C. C. Modified mouse embryonic stem cell based assay for quantifying cardiogenic Induction Efficiency. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
- Antonchuk, J., Gassmann, M., Desbaillets, I. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWell™ plates. Basic Cell Culture Protocols. 946, 523-533 (2013).
- Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells. Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).
