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Developmental Biology

Zebrafish में एक इथेनॉल प्रेरित fibrotic लिवर मॉडल के विकास का अध्ययन करने के पूर्वज सेल की मध्यस्थता Hepatocyte पुनर्जनन

Published: May 13, 2016 doi: 10.3791/54002
Automatic Translation
1, 1, 1
1School of Biology, Parker H. Petit Institute for Bioengineering and Bioscience, Georgia Institute of Technology

Introduction

Hepatocytes 1, जो जिगर के प्रमुख parenchymal सेल प्रकार हैं की उल्लेखनीय उत्थान क्षमता के बावजूद, जीर्ण जिगर की विफलता इस क्षमता को बाधित, यकृत पूर्वज सेल (एचपीसी) निर्भर उत्थान 2 के लिए अग्रणी।

जीर्ण जिगर की क्षति मुख्य रूप से शराब के सेवन, क्रोनिक हेपेटाइटिस सी वायरस (एचसीवी) के संक्रमण 3 और गैर शराबी फैटी लीवर रोग (NAFLD) 4 से ली गई है। यह निरंतर जिगर फाइब्रोसिस, जो बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन का संचय के साथ जुड़ा हुआ है की ओर जाता है। बने ईसीएम संचय एक रेशेदार निशान ऊतक के गठन 5, बाद में उच्च रुग्णता और मृत्यु दर के साथ सिरोसिस में जिसके परिणामस्वरूप द्वारा बरकरार यकृत वास्तुकला विकृत। कई प्रयासों के profibrogenic साइटोकिन्स और सक्रिय myofibroblasts 6 बाधा पर ध्यान केंद्रित करके मुख्य रूप से fibrotic प्रतिक्रिया को कम करने के लिए बनाया गया है। मुख्य रूप से उत्तरार्द्ध एच यकृत तारामय कोशिकाओं से प्राप्त होता है (एससी), सिद्धांत यकृत गैर parenchymal जिगर निशान गठन 4 के लिए जिम्मेदार कोशिकाओं। फिर भी, पुनर्योजी चिकित्सा कि निरंतर fibrogenic अपमान की उपस्थिति में hepatocytes पुनर्जीवित करने HPCs सहित अंतर्जात सेलुलर स्रोतों को प्रोत्साहित आगे की जांच का इंतजार है।

यकृत फाइब्रोसिस से कई प्रयोगात्मक मॉडल स्तनधारियों में वर्णित किया गया है। कार्बन टेट्राक्लोराइड (सीसीएल 4) के दोहराव इंजेक्शन व्यापक रूप से murine और चूहे मॉडल 7 में जिगर फाइब्रोसिस प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। जब एक उच्च वसा (एचएफ) आहार के साथ संयुक्त, शराब profibrogenic जीन अभिव्यक्ति और यकृत फाइब्रोसिस 8 का एक बड़ा अपरेगुलेशन का नेतृत्व किया। स्टीटोसिस (लिपिड संचय) तीव्र शराब जोखिम का परिणाम है, यह जिगर और अधिक गंभीर यकृत की चोट से 9 अतिसंवेदनशील बनाता है।

Zebrafish, Danio rerio, उत्थान के अध्ययन के लिए एक अमूल्य हड्डीवाला मॉडल प्रणाली के रूप में उभरा है। हालांकिऐसे newts और axolotls के रूप में अन्य निचले रीढ़ zebrafish संभावित पुनर्योजी में हेरफेर करने के लिए जरूरी जीन में गड़बड़ी और दृश्य रणनीतियों के संबंध में अन्य मॉडल प्रणाली से अधिक लाभ है 10 कारकों, उत्थान के लिए एक उल्लेखनीय क्षमता है। zebrafish भी बस अपने पानी के लिए इथेनॉल (EtOH) जोड़कर शराबी जिगर की बीमारी (ALD) के अध्ययन के लिए एक आकर्षक कशेरुकी मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है। लार्वा और वयस्क zebrafish को एक्यूट EtOH जोखिम यकृत स्टीटोसिस 11-13 का कारण बना। वयस्क zebrafish बढ़ाया EtOH जोखिम प्राप्त है, कोलेजन बयान फाइब्रोसिस से संबंधित जीन 14 की upregulation के साथ मनाया गया। हालांकि, एक की जरूरत मॉडल के विकास के लिए एक प्रोत्साहन के रूप में fibrogenic EtOH के जवाब में जिगर उत्थान का अध्ययन करने के लिए मौजूद है।

हाल ही में, हम zebrafish 15 में एक EtOH प्रेरित fibrotic जिगर मॉडल विकसित किया है। हम लार्वा और adul में EtOH उपचार के साथ एक hepatocyte विशेष आनुवंशिक पृथक प्रणाली संयुक्तटी zebrafish। हम दो ट्रांसजेनिक लाइनों उत्पन्न, टीजी (fabp10a: CFP-एनटीआर) GT1 और टीजी (fabp10a: mCherry-एनटीआर) GT2, जिसमें कोलाई nitroreductase (एनटीआर) क्रमश: सियान और mCherry फ्लोरोसेंट प्रोटीन, करने के लिए जुड़े हुए हैं नियंत्रण के तहत, hepatocyte विशेष फैटी एसिड प्रोटीन 10A, जिगर बुनियादी (fabp10a) प्रमोटर बंधन की। इस प्रणाली में, एनटीआर एक nontoxic प्रोड्रग metronidazole (MTZ) एक डीएनए अंतर-कतरा पार से जोड़ने एजेंट 16 में धर्मान्तरित, hepatocytes की स्पष्ट मौत उत्प्रेरण। इस मॉडल का उपयोग करना, हम दिखा दिया है कि यकृत कोशिकाओं है, जो पायदान संकेतन के लिए उत्तरदायी हैं की आबादी, hepatocytes के पास अभाव में और ईसीएम से अधिक hepatocytes में बदल दिया। हम HPCs के रूप में इन कोशिकाओं को नामित किया गया। इसके अलावा, रासायनिक स्क्रीन के माध्यम से, हम WNT सिगनल के छोटे अणु उत्प्रेरक और पायदान संकेतन के अवरोधकों कि fibrotic जिगर में hepatocyte उत्थान बढ़ाने की पहचान की। therefoफिर से, zebrafish में हमारे fibrotic जिगर मॉडल सेल संस्कृति या स्तनधारी आधारित स्क्रीनिंग प्रणाली की तुलना में एक शानदार रासायनिक स्क्रीनिंग प्रणाली का प्रतिनिधित्व करता है। यह महत्वपूर्ण लागत और समय की बचत लाभ के साथ एक में विवो प्रणाली है। यहाँ हम एक EtOH प्रेरित fibrotic जिगर मॉडल की स्थापना के लिए और zebrafish में इस मॉडल का उपयोग रासायनिक स्क्रीन प्रदर्शन के लिए विस्तृत प्रक्रिया का वर्णन है। इसके अलावा, समय पाठ्यक्रम का विश्लेषण कैसे hepatocyte उत्थान fibrotic जिगर में होता जांच करने के लिए प्रदर्शन किया गया। इस प्रोटोकॉल तंत्र और fibrotic जिगर में hepatocyte उत्थान को बढ़ाने की रणनीति का अध्ययन करने के लिए एक अमूल्य उपकरण प्रदान करेगा।

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Protocol

Zebrafish उठाया और एक मानक प्रोटोकॉल है कि राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान और प्रौद्योगिकी संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के जॉर्जिया इंस्टिट्यूट द्वारा अनुमोदित के मानदंडों को पूरा करती है का उपयोग कर पैदा कर रहे थे।

1. समाधान की तैयारी

  1. भ्रूण / लार्वा zebrafish बनाए रखने के लिए 20 एल अंडे पानी (दूसरे के स्थान पर 'भ्रूण माध्यम' के साथ प्रयोग) तैयार करें। 250 मिलीलीटर आसुत जल में 1.5 ग्राम Caso 4 और 6 ग्राम तत्काल महासागर समुद्री नमक भंग। 20 एल आसुत जल और आंदोलन से भरा एक काबोइ में डालो।
  2. तैयार 1 एल 1-फिनाइल-2-Thiourea (पीटीयू) शेयर समाधान (20x)। 1 एल आसुत जल में 0.6 ग्राम पीटीयू पाउडर भंग। काम कर रहे एक समाधान के रूप में 0.003% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए प्रति 20 मिलीलीटर भ्रूण माध्यम स्टॉक समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
    चेतावनी: पीटीयू साँस लेना या त्वचीय प्रदर्शन के बाद प्रणालीगत विषाक्तता का कारण बन सकता है। तैयार है और उचित हैंडलिंग दिशा निर्देशों के अनुसार उपयोग करें।
  3. 1 एल एथिल 3-aminobe तैयारnzoate methanesulfonate (Tricaine) शेयर समाधान (20x)। आसुत जल में 4 जी Tricaine पाउडर भंग। 1 एम Tris बफर (9 पीएच) जोड़कर 7 पीएच को समायोजित करें, और आसुत जल के साथ 1 एल के लिए अंतिम मात्रा लाने के लिए। 50 मिलीलीटर में अशेष और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर। उपयोग करने से पहले गला लें।
    चेतावनी: Tricaine सनसनी का एक नुकसान के लिए प्रेरित कर सकते हैं। तैयार है और उचित हैंडलिंग दिशा निर्देशों के अनुसार उपयोग करें।
  4. 100 मिलीलीटर लार्वा metronidazole (MTZ) काम कर समाधान तैयार है। 100 मिलीलीटर भ्रूण माध्यम में 0.1% डाइमिथाइल sulfoxide में 0.25 जी MTZ पाउडर भंग (DMSO) की ताजा 15 मिमी MTZ समाधान करें। MTZ पाउडर जोरदार झटकों से पूरी तरह से भंग। ताजा MTZ समाधान करें और एल्यूमीनियम पन्नी का उपयोग MTZ के photocatalytic गिरावट को रोकने के लिए।
    चेतावनी: MTZ जलन पैदा कर सकता है। तैयार है और उचित हैंडलिंग दिशा निर्देशों के अनुसार उपयोग करें।
  5. 100 मिलीलीटर लार्वा इथेनॉल / metronidazole (EtOH / MTZ) काम कर समाधान तैयार है। ताजा MTZ समाधान करें और एल्यूमीनियम पन्नी का उपयोग photocatalytic डी को रोकने के लिएMTZ का उन्नयन। सिर्फ उपयोग करने से पहले 1.5% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 100 मिलीलीटर MTZ समाधान में 1.5 मिलीलीटर 100% इथेनॉल जोड़ें।
  6. 500 मिलीलीटर वयस्क MTZ काम कर समाधान तैयार है। 500 मिलीलीटर पानी प्रणाली में 0.1% DMSO में 0.83 जी MTZ पाउडर भंग द्वारा नए सिरे से 10 मिमी MTZ समाधान करें। MTZ पाउडर जोरदार झटकों से पूरी तरह से भंग। ताजा MTZ समाधान करें और एल्यूमीनियम पन्नी का उपयोग MTZ के photocatalytic गिरावट को रोकने के लिए।
  7. 1 एल पीईएम बफर तैयार करें। 30.2 जी पाइप, 0.74 छ EGTA, और 0.12 छ आसुत जल में MgSO 4 भंग। NaOH के साथ पीएच 7 समायोजित करें। आसुत जल के साथ 1 एल के लिए अंतिम मात्रा लाओ।

2. लार्वा zebrafish की तैयारी

  1. [टीजी (fabp10a: CFP-एनटीआर) के संभोग सेट अप GT1; टीजी (टीपी 1: mCherry) jh11] टीजी (hand2: EGFP) के साथ 15,17 वयस्क zebrafish संभोग टैंक में 13 वयस्क zebrafish pd24। समय पर संभोग के संचालन करने के लिए डिवाइडर का प्रयोग करें।
  2. डी हटायेivider के बाद सुबह और मछली व्यवधान के बिना दोस्त के लिए अनुमति देते हैं। हार्वेस्ट भ्रूण 2 घंटा बाद में सिस्टम पानी के दबाव और भ्रूण मध्यम के साथ 100 मिमी पेट्री डिश में भ्रूण के हस्तांतरण से।
  3. पेट्री डिश प्रति कोई 100 से अधिक भ्रूण रखें। एक stereomicroscope के तहत, एक गिलास पिपेट का उपयोग unfertilized अंडे को हटा दें। 28 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण आगे बढ़ें और 10 घंटे के बाद-बाद निषेचन (HPF) 0.003% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए phenylthiourea (पीटीयू) जोड़ने वर्णक विकास को बाधित करने के लिए।

3. इथेनॉल, Metronidazole उपचार और लिवर लार्वा zebrafish में पुनर्जनन

  1. 1.5% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए भ्रूण माध्यम में इथेनॉल जोड़कर ताजा EtOH समाधान तैयार है। पीटीयू न जोड़ें।
  2. पेट्री डिश प्रति 20 मिलीलीटर इथेनॉल समाधान 56 से 80 HPF करने के साथ भ्रूण समझो। इथेनॉल वाष्पीकरण को रोकने के लिए प्लास्टिक की चादर के साथ पेट्री डिश को कवर किया।
  3. बाहर क्रमबद्ध [टीजी (fabp10a: CFP-एनटीआर) GT1; टीजी (टीपी 1: mCherry) jh11 sup>; टीजी (hand2: EGFP) pd24] समान जिगर के आकार के साथ लार्वा, के रूप में 80 HPF पर, CFP अभिव्यक्ति द्वारा निर्धारित की। जब EtOH इलाज लार्वा छँटाई Tricaine उपयोग करें, क्योंकि यह बाद में EtOH / MTZ उपचार के साथ उच्च मृत्यु दर का कारण बन जाएगा। पेट्री डिश प्रति 30 भ्रूण के घनत्व पर हल लार्वा रखें।
  4. 0.1% DMSO में भ्रूण माध्यम में ताजा 15 मिमी MTZ तैयार करें। MTZ समाधान में EtOH की उचित मात्रा मे 1.5% की एक अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए। 28 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए पेट्री डिश प्रति 20 मिलीलीटर EtOH / MTZ समाधान में लार्वा सेते हैं। प्लास्टिक की चादर के साथ पेट्री डिश कवर EtOH एकाग्रता और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्रकाश से बचाने के लिए बनाए रखने के लिए।
  5. उपचार के अंत में, ताजा भ्रूण माध्यम से नई पेट्री डिश के लिए लार्वा स्थानांतरित द्वारा EtOH / MTZ समाधान निकालने। भ्रूण माध्यम से लार्वा 3 बार धोएं और 20 मिलीलीटर भ्रूण माध्यम में उन्हें पीटीयू के बिना रहते हैं।
  6. hepatocytes के पास पूरा पृथक साथ लार्वा को सुलझाने के लिए, प्रतिदीप्ति का निरीक्षण80X की एक बढ़ाई सीएफपी फिल्टर के साथ एक epifluorescence खुर्दबीन के नीचे। जिगर में न्यूनतम सीएफपी प्रतिदीप्ति में सफल पृथक परिणाम और काफी कम मात्रा जिगर।
  7. EtOH / MTZ इलाज लार्वा की मौत से बचने के लिए, छंटाई के लिए Tricaine का उपयोग नहीं करते। immunostaining के लिए लार्वा को ठीक करें (धारा 5 को देखें) या आगे के विश्लेषण के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर पेट्री डिश में हल लार्वा रखने के लिए।

4. EtOH / MTZ इलाज लार्वा zebrafish में रासायनिक स्क्रीन

  1. 96 अच्छी तरह से DMSO में 10 मिमी रासायनिक शेयरों युक्त प्लेटें लाओ -80 से सेल्सियस फ्रीजर (वाणिज्यिक रासायनिक पुस्तकालयों के बारे में जानकारी के लिए सामग्री सूची को देखें)। रसायनों के photocatalytic गिरावट को रोकने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर। कोमल कमाल के साथ आरटी पर स्टॉक समाधान गला लें।
  2. 50 माइक्रोन के (96 अच्छी तरह प्लेटों में से एक अंतिम एकाग्रता के लिए भ्रूण माध्यम से 10 मिमी स्टॉक समाधान गिराए द्वारा रासायनिक समाधान तैयार: प्रारंभिक रोंcreen; 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में: retesting)। नियंत्रण लार्वा भ्रूण माध्यम में DMSO के बराबर सांद्रता के साथ इलाज किया गया।
  3. पास-पूरा hepatocyte पृथक, जो या तो 96 अच्छी तरह से (प्रारंभिक स्क्रीन) 1.5% EtOH / 15 मिमी MTZ के साथ इलाज किया और ऊपर उल्लिखित के रूप में हल कर रहे थे, या 24 अच्छी तरह से स्थानांतरण लार्वा (retesting) प्लेटों के घनत्व पर भ्रूण माध्यम साथ प्रीफिल्ड अच्छी तरह से प्रति 5 लार्वा। प्रत्येक रसायन के लिए डुप्लिकेट कुओं का प्रयोग करें।
  4. भ्रूण के माध्यम से निकालें और या तो 250 μl (96 अच्छी तरह प्लेटें) या अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 500 μl (24 अच्छी तरह प्लेटें) रासायनिक समाधान जोड़ें। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर प्लेट और 28 डिग्री सेल्सियस पर 50 घंटे के लिए लार्वा का इलाज। दैनिक निरीक्षण रासायनिक भिगोने लार्वा और व्यक्तिगत कुओं से किसी भी मृत लार्वा को हटा दें।
  5. रासायनिक उपचार के अंत में, 80X की एक बढ़ाई सीएफपी फिल्टर के साथ एक epifluorescence खुर्दबीन के नीचे संख्या और / या CFP व्यक्त hepatocytes की तीव्रता निरीक्षण करते हैं। फोटोग्राफ लाइव लार्वा दिखा बढ़ाया या कम करने के लिएघ संख्या और / या रिकॉर्ड के लिए एक डिजिटल कैमरा के साथ सीएफपी व्यक्त hepatocytes की तीव्रता।
  6. धारा 5 में वर्णित के रूप में confocal इमेजिंग के लिए formaldehyde के निर्धारण द्वारा लार्वा को बचाना।
  7. रसायन है कि प्रारंभिक स्क्रीन में hepatocyte उत्थान की सुविधा जांचना, प्रक्रियाओं 4.1-4.5 ( 'retesting') में वर्णित के साथ सबसे अधिक प्रभावशाली एकाग्रता लगाने के लिए उच्च और निम्न सांद्रता में अपनी शक्ति की जांच।

5. लार्वा zebrafish फिक्सेशन, immunostaining, और confocal इमेजिंग

  1. 0.02% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए Tricaine जोड़कर लार्वा anesthetize। एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब को 10-15 लार्वा स्थानांतरण और फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ एक बार धो लें। पीबीएस निकालें और पीईएम बफर में हौसले से तैयार 2% formaldehyde के 1 मिलीलीटर जोड़ने 4 डिग्री सेल्सियस पर ठीक करने के लिए हे / एन।
    चेतावनी: संक्रामक जलन का कारण बनता है और एक मानव कैसरजन होने के लिए जाना जाता है। एक रासायनिक धूआं हुड में संभाल लेना।
  2. समाधान ठीक से और फिर फिक्सिंग त्यागें वाश 3 आरटी पर पीबीएस के साथ बार। फिक्स्ड लार्वा कई दिनों तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में रखा जा सकता है। अगले कदम के लिए आगे बढ़ने से तुरंत बेहतर immunostaining परिणाम देता है।
  3. ध्यान की जर्दी और त्वचा एक stereomicroscope के तहत एक # 55 संदंश का उपयोग जिगर क्षेत्र को कवर हटा दें।
  4. Permeabilize और ब्लॉक बफर में ब्लॉक लार्वा (4% गोजातीय सीरम albumin और 0.3% ट्राइटन X-100 पीबीएस में) हे / एन 4 डिग्री सेल्सियस पर।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर / ब्लॉक बफर हे में 100 N: खरगोश विरोधी कोलेजन मैं एंटीबॉडी के साथ 1 के कमजोर पड़ने पर सेते हैं। धो बफर (पीबीएस में 0.3% ट्राइटन X-100) के साथ 15 मिनट प्रत्येक के लिए 5 बार धोएं।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर / ब्लॉक बफर हे में 200 N: AlexaFluor साथ 647 संयुग्मित गधा विरोधी खरगोश एंटीबॉडी 1 के कमजोर पड़ने पर सेते हैं। धो बफर के साथ 15 मिनट प्रत्येक के लिए 5 बार धोएं। तो पीबीएस के साथ एक बार धो लें।
  7. धीरे एक गिलास पिपेट, और बाएं पार्श्व पक्ष का सामना करना पड़ के साथ ओरिएंट तय लार्वा का उपयोग कर गिलास स्लाइड के लिए लार्वा हस्तांतरण। अतिरिक्त Kimwipes का उपयोग कर पीबीएस निकालें। बढ़ते मीडिया की एक बूंद जोड़ेंनेल पॉलिश के साथ, और सील कवर गिलास। आयोजन confocal इमेजिंग तुरंत बहुत सिफारिश की है।
  8. एक confocal एक 40X / 1.3 लेंस तेल छवियों पर कब्जा करने के साथ सुसज्जित प्रणाली का प्रयोग करें। 20-50% पर लेजर शक्ति का प्रयोग करें। 1 माइक्रोन अंतराल पर जेड ढेर छवियों पर कब्जा।

6. वयस्क Zebrafish की तैयारी

  1. [टीजी (fabp10a: CFP-एनटीआर) के संभोग सेट अप GT1; टीजी (टीपी 1: mCherry) jh11] 15,17 वयस्क संभोग टैंक में zebrafish। फसल प्रणाली पानी के दबाव और भ्रूण मध्यम के साथ 100 मिमी पेट्री डिश में भ्रूण के हस्तांतरण से अगली सुबह भ्रूण।
  2. पेट्री डिश प्रति कोई 100 से अधिक भ्रूण रखें। एक stereomicroscope के तहत, एक गिलास पिपेट का उपयोग unfertilized अंडे को हटा दें। 28 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण आगे बढ़ें और वर्णक विकास को बाधित करने के लिए 10 HPF के बाद 0.003% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए पीटीयू जोड़ें।
  3. 4 DPF पर, Tricaine का उपयोग लार्वा anesthetize और सुलझाने के लिए [टीजी (fabp10a: CFP-एनटीआर)GT1; टीजी (टीपी 1: mCherry) jh11] लार्वा। ताजा भ्रूण माध्यम से कई बार करने के लिए बदलकर Tricaine बाहर धो लें। लार्वा 28 डिग्री सेल्सियस पर ठीक करने के लिए जब तक वे प्रति मिनट 18 धड़कता 120-180 के सामान्य दिल की दर को प्राप्त करने की अनुमति दें।
  4. 6-12 महीने पुराने मानक प्रक्रिया 19 के आधार पर हल लार्वा उठाएँ।

7. इथेनॉल, Metronidazole उपचार, और वयस्क Zebrafish में जिगर पुनर्जनन

  1. स्थानांतरण 6-12 महीने पुरानी [टीजी (fabp10a: CFP-एनटीआर) GT1; टीजी (टीपी 1: mCherry) jh11] वयस्क एक नेट का उपयोग करने के लिए संभोग टैंक zebrafish। टैंक प्रति कोई 10 से अधिक मछली के घनत्व पर मछली रखें।
  2. 1% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए प्रणाली में पानी EtOH जोड़कर ताजा EtOH समाधान तैयार है। प्रत्येक टैंक में 500 मिलीलीटर EtOH समाधान के साथ वयस्क मछली समझो और उन्हें एक 28 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में बनाए रखें।
  3. ताजा EtOH समाधान के लिए स्थानांतरण वयस्क मछली दैनिक त्यागें मरी हुई मछलियों को सहाराएक biohazard रूप erly। लगातार MTZ इलाज से पहले 72 घंटे के लिए पशुओं का इलाज।
  4. 0.1% DMSO में सिस्टम पानी में ताजा 10 मिमी MTZ समाधान तैयार है। पूर्व गर्म एक 28 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में MTZ समाधान। 28 डिग्री सेल्सियस पर 8 घंटे के लिए 1 एल क्रासिंग टैंक में 500 मिलीलीटर MTZ समाधान के साथ मछली का इलाज, एल्यूमीनियम पन्नी का उपयोग कर प्रकाश से बचाने के लिए।
  5. उपचार के दौरान प्रति घंटा का निरीक्षण करें और तुरंत मरी हुई मछलियों को निकाल दें। एक biohazard के रूप में ठीक से मरी हुई मछलियों को त्यागें। MTZ उपचार के अंत में, दो बार ताजा प्रणाली पानी के लिए जानवरों के हस्तांतरण से MTZ बाहर धो लें।
  6. जानवरों 28 डिग्री सेल्सियस पर वसूली और एक मशीन में उन्हें बनाए रखने के लिए अनुमति दें। फ़ीड और दैनिक ताजा प्रणाली पानी के लिए मछली हस्तांतरण विश्लेषण के लिए समय बिंदु तक।

8. वयस्क Zebrafish लिवर फिक्सेशन, immunostaining, और confocal इमेजिंग

  1. 0.02% Tricaine के साथ वयस्क मछली anesthetize और 15 मिनट के लिए बर्फ के पानी में euthanize। पैट एक कागज तौलिया पर सूखी मछली और एक विदारक चटाई पर जगह है।
  2. पहले से ही त्वचा और मांसपेशियों को हटाने के द्वारा जठरांत्र अंगों को बेनकाब वर्णित 20। कैंची गुदा फिन को वापस पीछे मछली के पक्ष के साथ गुदा फिन से operculum करने के लिए त्वचा और पेट के साथ अंतर्निहित मांसपेशियों में कटौती करने के लिए उपयोग करें, और उसके बाद।
  3. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में मछली डाल और पीबीएस के साथ एक बार धो लें। पीबीएस निकालें और पीईएम बफर में हौसले से तैयार 2% formaldehyde के 4 मिलीलीटर जोड़ने 4 डिग्री सेल्सियस पर ठीक करने के लिए हे / एन।
  4. समाधान ठीक से फिक्सिंग त्यागें, और आरटी पर पीबीएस के साथ 3 बार धोएं। फिक्स्ड नमूने कई दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में रखा जा सकता है। अगले कदम के लिए आगे बढ़ने से तुरंत बेहतर immunostaining परिणाम देता है।
  5. घेघा काटने से मछली के शरीर गुहा से जिगर के साथ पूरे पेट काटना। 4% एक सेक्शनिंग मोल्ड में agarose कम पिघलने के साथ जठरांत्र अंगों शामिल करें।
  6. एक vibratome का प्रयोग बर्फ के ठंडे पीबीएस में 50 माइक्रोन अंतराल पर अनुप्रस्थ वर्गों में कटौती करने के लिए नमूने, पूर्वकाल अंत से शुरू। स्थानांतरण सेकंडपीबीएस के साथ 6 अच्छी तरह से थाली करने के लिए माहौल एक # 1 पेंट ब्रश का उपयोग कर।
  7. Permeabilize और ब्लॉक बफर हे में ब्लॉक वर्गों / एन 4 डिग्री सेल्सियस पर।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर / ब्लॉक बफर हे में 100 N: खरगोश विरोधी कोलेजन मैं एंटीबॉडी के साथ 1 के कमजोर पड़ने पर सेते हैं। 5 बार, 15 मिनट धो बफर के साथ प्रत्येक को धो लें।
  9. 4 डिग्री सेल्सियस पर / ब्लॉक बफर हे में 200 N: AlexaFluor साथ 647 संयुग्मित गधा विरोधी खरगोश एंटीबॉडी 1 के कमजोर पड़ने पर सेते हैं। धो बफर के साथ और एक बार पीबीएस के साथ 5 बार, 15 मिनट प्रत्येक धो लें।
  10. धीरे एक # 1 पेंट ब्रश का उपयोग गिलास स्लाइड के लिए वर्गों हस्तांतरण। , Kimwipes का उपयोग करते हुए अतिरिक्त पीबीएस निकालें बढ़ते मीडिया की एक बूंद को जोड़ने, और नेल पॉलिश के साथ सील कवर गिलास। आयोजन confocal इमेजिंग तुरंत अत्यधिक सुझाव दिया है।
  11. एक confocal एक 40X / 1.3 लेंस तेल छवियों पर कब्जा करने के साथ सुसज्जित प्रणाली का प्रयोग करें। 20-50% पर लेजर शक्ति का प्रयोग करें। 1 माइक्रोन अंतराल पर जेड ढेर छवियों पर कब्जा।

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Representative Results

चित्रा 1 लार्वा zebrafish में एक EtOH प्रेरित fibrotic जिगर मॉडल के विकास से पता चलता है। EtOH के लिए zebrafish लार्वा को प्रकाश में लाने के लिए एक प्रोटोकॉल का अनुकूलन करने के लिए, हम पहले EtOH विषाक्तता का आकलन किया। 2.5 दिन-पोस्ट निषेचन (DPF) लार्वा 24 घंटा एक समवर्ती 24 घंटा EtOH / MTZ उपचार के बाद के लिए EtOH एकाग्रता से अवगत कराया गया 1%, 1.5%, या 2%। 2% EtOH के संपर्क में, उच्च मृत्यु का कारण बना है, जबकि लगभग सभी लार्वा 1% EtOH या उससे कम के संपर्क में कोलेजन की तरह बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन की दुर्लभ बयान के साथ कम से कम fibrogenic परिवर्तन दिखाया। इन परिणामों के आधार पर, लार्वा 24 घंटा (2.5-3.5 DPF) और फिर एक साथ 24 घंटे (3.5-4.5 DPF) (चित्रा 1 ए) के लिए MTZ के साथ इलाज के लिए 1.5% EtOH के साथ pretreated थे। EtOH / MTZ इलाज लार्वा ट्रंक और पूंछ ऊपर की ओर वक्रता, पेरिकार्डियल शोफ, और तैरने मूत्राशय बढ़ करने के लिए विफलता सहित रूपात्मक असामान्यताएं दिखाया। (चित्रा 1 बी)। हम1) टीजी (fabp10a: EtOH / MTZ इलाज लार्वा यकृत में fibrogenic परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए तीन ट्रांसजेनिक लाइनों का इस्तेमाल किया CFP-एनटीआर) GT1 लाइन एनटीआर जीन hepatocyte विशेष fabp10a प्रमोटर 15 के तहत सियान प्रतिदीप्ति प्रोटीन के साथ जुड़े हुए व्यक्त करता है; 2) टीजी (टीपी 1: mCherry) jh11 लाइन सक्रिय पायदान संकेतन (पायदान जिम्मेदार कोशिकाओं, NRCS) या पित्त उपकला कोशिकाओं (BECs) परमाणु mCherry 17 है, जो अभिव्यक्ति कई RBP- युक्त टीपी 1 मॉड्यूल के नियंत्रण में है, के साथ साथ कोशिकाओं के निशान JK-बाध्यकारी साइटों; और 3) टीजी (hand2: EGFP) pd24 लाइन है, जो यकृत तारामय कोशिकाओं (एचएससी) 13 लेबल। DMSO के इलाज नियंत्रण [टीजी (fabp10a: CFP-एनटीआर) GT1; टीजी (टीपी 1: mCherry) jh11, टीजी (hand2: EGFP) pd24] यकृत कोई fibrillar प्रकार से पता चला है कि मैं बयान 4,6,9 (चित्रा 1 सी, सी ') कोलेजन, जबकि EtOH / मीट्रिक टनजेड इलाज यकृत ऊंचा प्रकार प्रदर्शित किया मैं 25 और 50 HR-पोस्ट-पृथक (एचपीए) (चित्रा -1, डी, ई, ई ') पर संचय कोलेजन। इसके अतिरिक्त, DMSO के इलाज नियंत्रण यकृत (चित्रा 1C '') की तुलना में, एचएससी संख्या में बदल आकृति विज्ञान के साथ एक स्टार की तरह विन्यास से एक myofibroblast के आकार की तरह करने के लिए EtOH / MTZ इलाज regenerating यकृत में खो cytoplasmic प्रक्रियाओं (के साथ वृद्धि हुई चित्रा 1 डी ',' ई ')। हम EtOH / MTZ इलाज regenerating यकृत में 25 एचपीए पर mCherry व्यक्त NRCS के दो असतत आबादी मनाया: लाल NRCS (चित्रा -1 '', इनसेट, सफेद तीर) और चमकदार लाल NRCS (चित्रा -1 '' 'मंद, इनसेट , पीले तीर)। 50 एचपीए में hepatocyte विशेष सीएफपी सह-एक्सप्रेस को regenerating यकृत (चित्रा 1E '', इनसेट, सफेद तीर) के दौरान मंद mCherry अभिव्यक्ति के साथ NRCS में शुरू हुआ। ये सीएफपी और मंद mCherry-coexpressing NRCS चमकदार लाल NRCS कि सीएफपी (चित्रा 1E '', इनसेट, पीले तीर) के लिए नकारात्मक हैं से जाहिर साफ़ कर रहे हैं। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि जब hepatocyte प्रसार आंशिक hepatectomy (PHX) के बाद दबा दिया गया था, HPCs एचएससी 21 के सहवर्ती प्रसार के साथ विस्तार किया। इसके अतिरिक्त, HPCs और BECs histochemical मार्करों 22 साझा की है। इसलिए, हमारे परिणामों से संकेत मिलता है कि सीएफपी और मंद mCherry सह व्यक्त NRCS HPCs कि पायदान डाउनरेगुलेशन का सामना करके hepatocytes में अंतर का एक zebrafish-समकक्ष चित्रित। NRCS पायदान संकेतन के उच्च स्तर को बनाए रखने के cholangiocytes है, जो अलग-अलग हैं BECs 23 के रूप में रह सकती है।

चित्रा 2 वयस्क zebrafish में एक EtOH प्रेरित fibrotic जिगर मॉडल के विकास से पता चलता है। सबसे पहले, हम व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए 1%, 1.5%, या 2% करने के लिए वयस्क zebrafish उजागर EtOH। ज्यादातर वयस्क zebrafish n कियाओटी EtOH सांद्रता के लिए जोखिम 1% से अधिक (अप्रकाशित डेटा) के 72 से अधिक मानव संसाधन जीवित रहते हैं। इसलिए, वयस्क zebrafish के लिए, हम मछली 1% EtOH के साथ 72 घंटे के लिए pretreated और MTZ उपचार (2A चित्रा) के साथ पीछा किया। प्रदर्शन कर समय पाठ्यक्रम का विश्लेषण करती करके, हम काफी ऊंचा प्रकार से पता चला है कि मैं 2, 3 में EtOH / MTZ इलाज regenerating यकृत में बयान कोलेजन, और 4 दिन-पोस्ट-पृथक (डीपीए) (चित्रा -2 ', डी', 'ई) DMSO के इलाज यकृत (चित्रा 2 बी ') की तुलना में। लार्वा में मनाया समान, सीएफपी और मंद mCherry सह व्यक्त कोशिकाओं 12 महीने की उम्र में [टीजी (fabp10a: CFP-एनटीआर) की EtOH / MTZ इलाज regenerating यकृत में पाया गया GT1; टीजी (टीपी 1: mCherry) 3 और 4 डीपीए (चित्रा 2 डी, ई, insets, सफेद तीर) पर jh11] वयस्क मछली। इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि HPCs, उत्तरदायी सिगनल पायदान में hepatocytes के रूप में पुनर्जीवित करने के लिए अपनी क्षमता को बनाए रखने केवयस्क zebrafish में fibrogenic अपमान की उपस्थिति।

चित्रा 3 प्रतिनिधि रासायनिक स्क्रीनिंग लार्वा zebrafish में हमारे इथेनॉल प्रेरित fibrotic जिगर मॉडल का उपयोग कर परिणाम दिखाता है। बायोएक्टिव यौगिकों कि fibrotic जिगर में hepatocyte उत्थान में तेजी लाने इंगित करने के लिए, हम रासायनिक आनुवंशिक स्क्रीन प्रदर्शन किया। हम अच्छी तरह से विशेषता जैविक और दवा गतिविधियों (स्टेम सेल परिसर पुस्तकालय संकेतन, Selleckchem) और 1000 में कम से विशेषता छोटे अणुओं (ActiProbe-1K लाइब्रेरी, TimTec) का उपयोग [टीजी (fabp10a के एक पुस्तकालय के साथ 75 छोटे अणुओं के एक पुस्तकालय की जांच: सीएफपी -NTR) GT1; टीजी (टीपी 1: mCherry) jh11] लार्वा। हम 1.5% EtOH / 15 मिमी MTZ की उपस्थिति में hepatocytes ablated और फिर 50 घंटा (चित्रा 3) के लिए यौगिकों के 50 माइक्रोन के लिए लार्वा अवगत कराया। ऐसे एसबी 415286 और चीड़-990 के रूप में Wnt एगोनिस्ट के एक नंबर21, ग्लाइकोजन synthase काइनेज-3, पदोन्नत hepatocyte उत्थान (चित्रा -3 सी, डी) DMSO (चित्रा 3 बी) की तुलना की अवरोधकों। इसके अलावा, [4- (1H-1,2,3,4-tetraazol-5-YL) -1,2,5-oxadiazole-3-ylamine], HTOA, एक उपन्यास Wnt मार्ग उत्प्रेरक के रूप में संक्षिप्त, बढ़ाया hepatocyte में उत्थान fibrotic जिगर के रूप में बड़ा पुनर्जीवित जिगर (चित्रा 3E) ने संकेत दिया। ये आंकड़े बताते हैं कि हमारे निरंतर fibrotic मॉडल छोटे अणुओं है कि hepatocyte उत्थान बढ़ाने को खोजने के लिए एक अमूल्य उपकरण प्रदान करता है।

आकृति 1
चित्रा 1. लार्वा zebrafish में एक इथेनॉल प्रेरित fibrotic जिगर मॉडल का विकास। (ए) योजना के लार्वा में एक fibrotic जिगर मॉडल की स्थापना के लिए EtOH और EtOH / MTZ उपचार की अवधि को दर्शाता हुआ। (बी), 50 घंटे के बाद पृथक (एचपीए) में EtOH / MTZ इलाज एलarval zebrafish ट्रंक और पूंछ ऊपर की ओर वक्रता, पेरिकार्डियल शोफ, और तैरने मूत्राशय बढ़ करने के लिए विफलता सहित रूपात्मक असामान्यताएं विकसित की है। (सीसी '' ') [टीजी के यकृत में (fabp10a: CFP-एनटीआर) GT1; टीजी (टीपी 1: mCherry) jh11, टीजी (hand2: EGFP) pd24] लार्वा DMSO के साथ इलाज किया, ईसीएम प्रोटीन कोलेजन 1A था लगभग undetectable (सी, सी ') और मौन एचएससी एक स्टार की तरह विन्यास से पता चला है (सी' '), जबकि NRCS hepatocytes (सी, सी '', इनसेट) के बीच वितरित किया। (डे '' ') EtOH / MTZ इलाज लार्वा के यकृत में, ऊंचा कोलेजन 1 ए बयान मनाया गया (डी, डी, ई, ई')। एचएससी संख्या में वृद्धि हुई है और जटिल प्रक्रियाओं cytoplasmic (डी ',' ई ') को खो दिया। 25 एचपीए में mCherry व्यक्त NRCS दो अलग आबादी से बना रहे हैं। पीला तीर ', (इनसेट जबकि सफेद तीर मंद लाल NRCS (डी से संकेत मिलता है चमकदार लाल NRCS डी' ')' से संकेत मिलता है ', इनसेट)। 50 एचपीए में टीजी (fabp10a: CFP-एनटीआर) और टीजी (टीपी 1: mCherry) के सह व्यक्त कोशिकाओं, regenerating यकृत (ई '', इनसेट, सफेद तीर) भर में उभरते शुरू कर दिया है, जबकि चमकदार लाल NRCS कोई सीएफपी अभिव्यक्ति थी (ई '', इनसेट, पीले तीर)। सभी confocal छवियों सी ',' डी ',' ई 'को छोड़कर एकल विमान छवियों, जो प्रक्षेपण छवियों रहे हैं। स्केल सलाखों: बी, 100 माइक्रोन; सीई '', 20 माइक्रोन। EtOH, इथेनॉल; MTZ, metronidazole; एचपीए, घंटे-पोस्ट-पृथक; DPF, दिन-बाद निषेचन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 2 वयस्क zebrafish में एक इथेनॉल प्रेरित fibrotic जिगर मॉडल का विकास। (ए) योजना वयस्क में एक fibrotic जिगर मॉडल की स्थापना के लिए EtOH और MTZ उपचार की अवधि को दर्शाता हुआ। (इ ') (और EtOH / टीजी (fabp10a: CFP-एनटीआर), टीजी (टीपी 1 mCherry) DMSO- बी और बी) के vibratome वर्गों में, और कोलेजन 1 ए अभिव्यक्ति' MTZ का इलाज (सीई ') वयस्क zebrafish यकृत। कोई टीजी के साथ (बी बी ') DMSO के इलाज नियंत्रण में, कोलेजन 1A लगभग undetectable था (बी) (fabp10a: CFP-एनटीआर) और टीजी (टीपी 1: mCherry) सह व्यक्त कोशिकाओं (बी)। (सीई ') एक साथ (डी', 'ई EtOH / MTZ इलाज regenerating यकृत में, कोलेजन 1 ए बयान स्पष्ट रूप से 2, 3, और 4 डीपीए सेल्सियस) पर उठाया गया था'3 और 4 डीपीए (डी, ई, insets, सफेद तीर) में सह व्यक्त कोशिकाओं: और टीजी (mCherry टीपी 1): टीजी (सीएफपी-एनटीआर fabp10a) की आबादी। चमकदार लाल NRCS कोई सीएफपी अभिव्यक्ति (डी, ई, insets, पीले तीर)। बीई, confocal एकल विमान छवियों। B 'ई', confocal प्रक्षेपण छवियों था। स्केल बार, 20 माइक्रोन। EtOH, इथेनॉल; MTZ, metronidazole; समाचार एजेंसी डीपीए, दिन-पोस्ट-पृथक। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. प्रतिनिधि रासायनिक स्क्रीनिंग लार्वा zebrafish में इथेनॉल प्रेरित fibrotic जिगर मॉडल का उपयोग कर परिणाम है। (ए) fibrotic जिगर में hepatocyte उत्थान स्क्रीन के लिए योजना। (इ) में जाना जाता है और उपन्यास Wntactivators fibrotic जिगर में hepatocyte उत्थान बढ़ाने के। [: GT1, टीजी (टीपी 1: mCherry) टीजी (सीएफपी-एनटीआर fabp10a) jh11] में EtOH / MTZ इलाज यकृत के Confocal अनुमानों लार्वा कि DMSO (बी), SB415286 (सी), चीड़-99021 के साथ (दिलाई गई डी), या एक उपन्यास Wnt उत्प्रेरक [4- (1H-1,2,3,4-tetraazol-5-YL) -1,2,5-oxadiazole-3-ylamine] (HTOA रूप में संक्षिप्त) (ई)। SB415286 और चीड़-99021 synthase काइनेज -3 अवरोधकों ग्लाइकोजन रहे हैं। सभी छवियों confocal प्रक्षेपण चित्र हैं। स्केल बार, 20 माइक्रोन। EtOH, इथेनॉल; MTZ, metronidazole; एचपीए, घंटे-पोस्ट-पृथक; DPF, दिन-बाद निषेचन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

हम EtOH / MTZ इलाज उबरने के यकृत में एचपीसी की मध्यस्थता hepatocyte उत्थान मनाया, सुझाव है कि यहां तक ​​कि fibrillar प्रकार मैं कोलेजन सहित ईसीएम प्रोटीन की पर्याप्त मात्रा की उपस्थिति में, HPCs hepatocytes के रूप में पुनर्जीवित करने के लिए उनकी योग्यता बरकरार रहती है। MTZ केवल उपचार काफी ईसीएम प्रोटीन के बयान में वृद्धि नहीं था, जबकि EtOH केवल उपचार एचपीसी सक्रियण 15 के लिए प्रेरित नहीं किया। संयुक्त EtOH / MTZ उपचार का उपयोग करके, हम fibrotic जिगर में एचपीसी संचालित उत्थान की जांच करने में सक्षम थे। hepatocyte के पास पूर्ण उन्मूलन elicits एचपीसी संचालित hepatocyte उत्थान के रूप में, यह संकुल NRCS द्वारा MTZ इलाज लार्वा hepatocyte विशेष प्रतिदीप्ति के अभाव के मानदंडों पर आधारित है और काफी कम मात्रा जिगर को सुलझाने के लिए महत्वपूर्ण है। मछली में, गिल और त्वचा की रक्त वाहिकाओं, शराब 24 को अवशोषित इतना है कि जानवरों को जी भरकर पीने या intraga की आवश्यकता के लिए अनुमति देने के लिए कोई जरूरत नहीं हैस्तनधारी मॉडल के रूप में stric अर्क। हम पानी घूम बिना EtOH- और अलग टैंक में बाद में MTZ इलाज वयस्क मछली रखे। यह दैनिक ताजा EtOH समाधान के लिए मछली हस्तांतरण और EtOH के वाष्पीकरण को कम करने पर ढक्कन रखने के लिए आवश्यक है। हालांकि 48-72 मानव संसाधन EtOH / MTZ उपचार कुशलता से हमारे प्रोटोकॉल में ईसीएम प्रोटीन संश्लेषण लाती है, न तो उन्नत फाइब्रोसिस और न ही सिरोसिस इन मछलियों में विकसित किया गया है। इसलिए, इथेनॉल के लंबे समय तक निवेश जैसे 12 सप्ताह के उपचार के साथ 14 MTZ के संयोजन, विशेष रूप से वयस्क मछली में, और अधिक गंभीर जिगर की क्षति को ठीक से अनुकरण और पूछताछ जीर्ण जिगर की विफलता में एचपीसी संचालित उत्थान के लिए प्रेरित कर सकते हैं।

Zebrafish अपने छोटे आकार, बड़े संतान, पारदर्शिता, और पारगम्यता छोटे अणुओं से 25 के कारण इन विवो परिसर के परीक्षण के लिए एक उत्कृष्ट पशु मॉडल के रूप में कार्य करता है। zebrafish में fibrotic जिगर मॉडल का उपयोग करना, हम जानते और उपन्यास Wnt acti के एक नंबर की पहचानvators और पायदान अवरोधकों कि hepatocyte उत्थान 15 त्वरित। हमारे वर्तमान प्रतिदीप्ति आधारित रासायनिक स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल कई चरणों के होते हैं सब मैन्युअल hepatocyte उत्थान पर रसायनों के प्रभाव के रसायनों की तैयारी, 24 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए EtOH इलाज / hepatocyte-ablated लार्वा स्थानांतरित, रसायन इलाज, और विश्लेषण सहित प्रदर्शन किया। यह विशेष रूप से अलग-अलग जानवर है, जो कठिन और समय लेने वाली है के लिए छवियों पर कब्जा करने epifluorescence और / या confocal खुर्दबीन कार्यरत हैं। अगर स्वचालित दवा खुराक प्रणाली है कि रासायनिक सांद्रता की सीमा निर्धारित करता है के साथ संयुक्त उच्च throughput प्लेटफॉर्म है कि स्वचालित रूप से संभाल और मात्रात्मक डेटा संग्रह बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग 26,27 ये सुविधाओं की सुविधा होगी साथ संयोजन में zebrafish के सेलुलर संकल्प इमेजिंग के अधिग्रहण को मजबूत किया जायेगा 28, hepatocyte उत्थान को बढ़ाने के लिए अधिकतम प्रभावकारिता के साथ कम से कम विषाक्तता दे सकता है। इन limita के बावजूदमाहौल, के रूप में कई महत्वपूर्ण खिलाड़ियों और जिगर का मुख्य प्रकार की कोशिकाओं zebrafish और स्तनधारियों 29 के बीच संरक्षित कर रहे हैं, रोजगार में विवो छोटे अणु zebrafish fibrotic जिगर मॉडल का उपयोग जीर्ण जिगर की बीमारी के लिए उपन्यास चिकित्सकीय रणनीति के वैध खोज उत्प्रेरित करेगा स्क्रीनिंग आधारित।

दो अतिरिक्त समूहों स्वतंत्र रूप से दिखा दिया है कि fibrogenic अपमान के बिना hepatocytes के पास कुल नुकसान के बाद, BECs धारणा के साथ dedifferentiation 30,31 के एक कदम के माध्यम से hepatocyte में transdifferentiated कि cholangiocytes, पूरी तरह से अलग-अलग BECs, मुख्य रूप से zebrafish में NRCS / BECs शामिल। Transdifferentiation hepatocyte उत्थान ड्राइविंग के तंत्र में से एक हो सकता है, हमारे परिणामों से संकेत मिलता है कि HPCs, जो जाना जाता है zebrafish जिगर 32 में BECs के बहुमत का गठन करने के लिए, पायदान गतिविधि downregulate hepatocytes में अंतर करने के लिए। इस बीच, यह अटकलें हैं कि वें प्रशंसनीय हैई पूरी तरह से विभेदित BECs, cholangiocytes, पायदान गतिविधि का उच्च स्तर उत्थान के दौरान hepatocytes को बदलने के बिना बनाए रखें। दिलचस्प, EtOH की उपस्थिति में, जैसा कि पहले 13 सूचना दी, हमने पाया कि एचएससी खो cytoplasmic प्रक्रियाओं के साथ एक myofibroblast के आकार की तरह करने के लिए एक स्टार की तरह विन्यास से बदल आकृति विज्ञान के साथ संख्या में वृद्धि हुई है। ईसीएम प्रोटीन के संश्लेषण की विशेषता सक्रिय एचएससी सिद्धांत अपराधी जिगर की मरम्मत 4 की एकीकृत प्रक्रिया के दौरान असामान्य घाव भरने के लिए जिम्मेदार हैं। हालांकि पुरानी चोट अक्सर उत्थान के लिए जिगर की उल्लेखनीय क्षमता ओवरराइड प्रत्यारोपित HPCs सफलतापूर्वक fibrotic / cirrhotic चूहा जिगर 33 repopulated। इसलिए, हमारे zebrafish fibrotic जिगर मॉडल आणविक और सेलुलर तंत्र है कि एचपीसी की मध्यस्थता hepatocyte उत्थान पर निरंतर फाइब्रोसिस के प्रभाव मध्यस्थता elucidating के लिए एक अनिवार्य उपकरण हो जाएगा। इसके अलावा, परिभाषित बहु-कोशिकीय गrosstalk कि हमारे zebrafish fibrotic जिगर मॉडल के उपयोग के द्वारा उत्थान और फाइब्रोसिस संतुलन आगे विवो में जीर्ण जिगर की विफलता के लिए व्यवहार्य चिकित्सकीय रणनीति डिजाइन करने की सुविधा होगी।

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Acknowledgments

इस काम GTEC (2731336 और 1411318), एनआईएच (K01DK081351), और NSF (1354837) सीएचएस करने से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए Alem Giorgis धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Calcium sulfate hemihydrate (CaSO4) Acros AC385355000
Magnesium sulfate (MgSO4) EMD MX0075
1,4-Piperazinediethanesulfonic acid (PIPES) Sigma-Aldrich P6757
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-
N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)		 Sigma-Aldrich E3889
Ethanol Sigma-Aldrich E7023 200 proof
Formaldehyde Fisher Scientific F79-500
Metronidazole (MTZ) Sigma-Aldrich M3761
1-phenyl-2-thiourea (PTU) Sigma-Aldrich P7629
3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040
Phosphate-buffered saline (PBS) tablet Amresco E404 Dissolve one tablet with 100 ml distilled water
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2438
Bovine serum albumin Fisher Scientific BP1600
Triton X-100 Fisher Scientific BP151
Low-melting agarose  Amresco BP165
Stem Cell Signaling Compound Library Selleck Chemicals L2100 10 mM stock in DMSO
ActiProbe-1K Library Timtec ActiProbe-1K 10 mM stock in DMSO
SB 415286 Selleck Chemicals S2729 Dissolve with DMSO to 10 mM
CHIR-99021 Selleck Chemicals S2924 Dissolve with DMSO to 10 mM
Anti-Collagen I antibody Abcam ab23730 Use at 1:100 for immunostaining, reacts with fish
AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Molecular Probes A31573 Use at 1:200 for immunostaining
Mounting media (Vectorshield) Vector Laboratories H-1400
100 mm Petri dish VWR 25384-088
24-well plate VWR 10062-896
Forceps Fine Science Tools 11255-20 Dumont #55
Glass slide VWR 48312-003 75x25 mm
Cover glass VWR 48366-045 18 mm
Plastic wrap Fisher Scientific 22305654
Aluminum foil Fisher Scientific 1213100
Kimwipes Kimberly-Clark 34155
Vibrotome Leica VT1000 S
Stereo microscope Leica M80
Epifluoresence microscope Leica M205 FA
Confocol microscope Zeiss LSM700

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 111 जिगर फाइब्रोसिस zebrafish जिगर उत्थान यकृत पूर्वज सेल nitroreductase metronidazole यकृत तारामय सेल रासायनिक स्क्रीनिंग
Zebrafish में एक इथेनॉल प्रेरित fibrotic लिवर मॉडल के विकास का अध्ययन करने के पूर्वज सेल की मध्यस्थता Hepatocyte पुनर्जनन
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Huang, M., Xu, J., Shin, C. H.… More

Huang, M., Xu, J., Shin, C. H. Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration. J. Vis. Exp. (111), e54002, doi:10.3791/54002 (2016).

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