Introduction
Trots den anmärkningsvärda regenereringskapacitet hepatocyter 1, som är den huvudsakliga parenkymal celltyp av levern, försämrar kronisk leversvikt denna förmåga, vilket leder till lever stamcellstransplantation (HPC) -beroende förnyelse 2.
Kronisk leverskada härrör huvudsakligen från alkoholmissbruk, kronisk hepatit C-virus (HCV) 3 och alkoholfria fettlever (NAFLD) 4. Det leder till ihållande leverfibros, som är associerad med ackumuleringen av extracellulära matrix (ECM) -proteiner. Ihållande ECM ackumulering snedvrider intakt lever arkitektur genom att bilda en fibrös ärrvävnad 5 senare resulterar i cirros med hög sjuklighet och dödlighet. Många försök har gjorts för att mildra den fibrotiska svar främst genom att fokusera på att hämma profibrogenic cytokiner och aktiverade myofibroblaster 6. Det senare är främst härrör från leverstel celler (HSCS), principen lever icke-parenkymala celler som ansvarar för lever ärrbildning 4. Ändå regenerativa terapier som stimulerar endogena cellulära källor inklusive HPC att regenerera leverceller i närvaro av ihållande fibrogena förolämpningar väntar ytterligare utredning.
Många experimentella modeller av leverfibros har beskrivits i däggdjur. Repetitiv injektion av koltetraklorid (CCI4) har använts i stor utsträckning för att framkalla leverfibros i murina och råttmodeller 7. När de kombineras med en fettrik (HF) diet, alkohol lett till en betydande uppreglering av profibrogenic genexpression och leverfibros 8. Medan leversteatos (fettinlagring) resultat från alkohol exponering akut, det gör levern mottagliga för mer allvarlig leverskada 9.
Zebrafisk, Danio rerio, har dykt upp som en ovärderlig ryggradsdjur modellsystem för att studera förnyelse. Fastandra lägre ryggradsdjur, såsom vattensalamandrar och axolotl har en anmärkningsvärd förmåga för regenerering, zebrafisk har fördelar jämfört med andra modellsystem när det gäller de genen manipulation och visualisering strategier som behövs för att manipulera potentiella regenerativ faktorer 10. Zebrafisk representerar också en attraktiv ryggradsdjur modell för att studera alkoholrelaterad leversjukdom (ALD) genom att helt enkelt lägga etanol (EtOH) till deras vatten. Akut EtOH exponering för larver och vuxna zebrafisk orsakade leversteatos 11-13. När vuxna zebrafisk fått utökad EtOH exponering, var kollagenavsättning observerades med uppreglering av fibros relaterade gener 14. Emellertid föreligger ett behov av att utveckla modeller för att studera leverregenerering i beroende av EtOH som ett fibrinogena stimulus.
Nyligen har vi utvecklat en EtOH-inducerad fibrotisk lever modell i zebrafisk 15. Vi kombinerat en hepatocyt-specifik genetisk ablation systemet med EtOH behandling i larv och adult zebrafisk. Vi genererade två transgena linjer, Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1 och Tg (fabp10a: mCherry-NTR) GT2, där E. coli nitroreduktas (NTR) är sammansmält med cyan och mCherry fluorescerande protein, respektive, under kontroll av hepatocyt-specifika fettsyrabindande protein 10a, lever basic (fabp10a) promotor. I detta system, NTR omvandlar en icke-toxisk prodrug metronidazol (MTZ) i en DNA-inter-strängtvärbindningsmedel 16, vilket inducerar explicit död av hepatocyter. Med hjälp av denna modell, visade vi att en population av leverceller, som är mottagliga för Notch-signalering, omvandlas till hepatocyter i den praktiskt taget obefintliga hepatocyter och överskottet av ECM. Vi betecknas dessa celler som HPC. Vidare genom kemiska skärmar, identifierade vi småmolekylära aktivatorer av Wnt signalering och hämmare av Notch-signalering som utökar hepatocyte förnyelse i fibrotisk lever. Therefore, vår fibrotisk lever modell i zebrafisk är en utmärkt kemisk screening system jämfört med cell kultur- eller däggdjursbaserad screening systemet. Det är ett system för med betydande kostnads- och tidsbesparande fördelar in vivo. Här beskriver vi de detaljerade förfaranden för att upprätta en EtOH-inducerad fibrotisk lever modell och för att utföra kemiska skärmar som använder denna modell i zebrafisk. Vidare har tidsförloppet analyser för att undersöka hur hepatocyt förnyelse sker i fibrotisk lever. Detta protokoll kommer att ge ett ovärderligt verktyg för att studera mekanismer och strategier för att förstärka hepatocyte förnyelse i fibrotisk lever.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Zebrafisk höjdes och uppvuxna med hjälp av ett standardprotokoll som uppfyller kriterierna i National Institutes of Health och godkänts av Georgia Institute of Technology Institutional Animal Care och användning kommittén.
1. Beredning av lösningar
- Förbered 20 L ägg vatten (omväxlande används med "embryo medium") för att upprätthålla embryonal / larver zebrafisk. Lös upp 1,5 g CaSO 4 och 6 g omedelbar ocean havssalt i 250 ml destillerat vatten. Häll i en damejeanne fylldes med 20 L destillerat vatten och skaka.
- Förbereda en L 1-fenyl-2-tiourea (PTU) stamlösning (20x). Lös upp 0,6 g PTU pulver i en L destillerat vatten. Tillsätt 1 ml av stamlösning per 20 ml embryo medium till en slutlig koncentration av 0,003% såsom en arbetslösning.
VARNING: PTU kan orsaka systemisk toxicitet efter inandning eller hudexponering. Förbered och använd i enlighet med lämpliga riktlinjer hanterings. - Förbereda ett L etyl 3-aminobenzoate metansulfonat (Tricaine) stamlösning (20x). Lös upp 4 g Tricaine pulver i destillerat vatten. Justera pH till 7 genom tillsats av 1 M Tris-buffert (pH 9), och bringa den slutliga volymen till 1 L med destillerat vatten. Alikvot i 50 ml och förvara vid -20 ° C. Tina före användning.
VARNING: Tricaine kan framkalla en förlust av känsel. Förbered och använd i enlighet med lämpliga riktlinjer hanterings. - Bered 100 ml larv metronidazol (MTZ) arbetslösning. Göra färsk 15 mM MTZ lösning genom upplösning av 0,25 g MTZ pulver i 0,1% dimetylsulfoxid (DMSO) i 100 ml embryo medium. Lös MTZ pulvret fullständigt genom kraftig skakning. Göra färskt MTZ lösning och använder aluminiumfolie för att förhindra fotokatalytisk nedbrytning av MTZ.
VARNING: MTZ kan orsaka irritation. Förbered och använd i enlighet med lämpliga riktlinjer hanterings. - Bered 100 ml larver etanol / metronidazol (EtOH / MTZ) arbetslösning. Göra färskt MTZ lösning och använder aluminiumfolie för att förhindra fotokatalytisk degradering av MTZ. Tillsätt 1,5 ml 100% etanol i 100 ml MTZ lösning till en slutlig koncentration av 1,5% strax före användning.
- Förbered 500 ml vuxen MTZ arbetslösning. Göra färsk 10 mM MTZ lösning genom att lösa 0,83 g MTZ pulver i 0,1% DMSO i 500 ml Vatten. Lös MTZ pulvret fullständigt genom kraftig skakning. Göra färskt MTZ lösning och använder aluminiumfolie för att förhindra fotokatalytisk nedbrytning av MTZ.
- Förbereda ett L PEM-buffert. Lös 30,2 g rör, 0,74 g EGTA och 0,12 g MgSO 4 i destillerat vatten. Justera pH till 7 med NaOH. Bringa den slutliga volymen till 1 L med destillerat vatten.
2. Framställning av Larvernas Zebrafish
- Inrätta parning av [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (TP1: mCherry) jh11] 15,17 vuxna zebrafisk med Tg (hand2: EGFP) pd24 13 vuxna zebrafisk i parning tankar. Använd avdelare för att utföra tidsinställd parning.
- Ta bort divider följande morgon och låt fisken att para sig utan avbrott. Skörd embryon två timmar senare genom att anstränga vattensystem och överföring av embryon till 100 mm petriskålar med embryo medium.
- Håll inte mer än 100 embryon per petriskål. Under ett stereomikroskop, ta bort obefruktade ägg med användning av en glaspipett. Växer embryon vid 28 ° C och tillsätt fenyltiokarbamid (PTU) till en slutlig koncentration av 0,003% efter 10 timmars-post-befruktning (HPF) för att inhibera pigmentutveckling.
3. Etanol, Metronidazol behandling och leverregenerering i Larvernas Zebrafisk
- Framställ färsk EtOH-lösning genom att tillsätta etanol i embryo medium till en slutlig koncentration av 1,5%. Inte lägga PTU.
- Behandla embryon med 20 ml etanollösning per petriskål 56-80 HPF. Täck petriskålar med plastfolie för att förhindra etanol avdunstning.
- Sortera ut [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (TP1: mCherry) jh11 sup>; Tg (hand2: EGFP) pd24] larver med likartad leverstorlek, bestämd genom GFP expression, vid 80 HPF. Använd inte Tricaine vid sortering EtOH behandlade larver eftersom detta kommer att orsaka hög dödlighet med påföljande EtOH / MTZ behandling. Hålla sorterad larver vid en densitet av 30 embryon per petriskål.
- Bered en färsk 15 mM MTZ i embryo medium i 0,1% DMSO. Lägga rätt mängd EtOH till MTZ lösning för att göra en slutlig koncentration av 1,5%. Inkubera larver i 20 ml EtOH / MTZ lösning per petriskål under 24 h vid 28 ° C. Täck petriskålar med plastfolie för att bibehålla EtOH koncentration och med aluminiumfolie för att skydda mot ljus.
- Vid slutet av behandlingen, ta bort EtOH / MTZ lösning genom att överföra larver till nya petriskålar med färskt embryo medium. Tvätta larver 3 gånger med embryo medium och hålla dem i 20 ml embryo medium utan PTU.
- Att reda ut larverna med nästan fullständig ablation av leverceller, observera fluorescensunder en epifluorescensmikroskop med GFP filtret vid en förstoring av 80X. Framgångsrika ablation resulterar i minimal GFP fluorescens i levern och kraftigt minskad levervolym.
- För att undvika död EtOH / MTZ-behandlade larver, inte använda Tricaine för sortering. Fäst larver för immunfärgning (se avsnitt 5) eller hålla sorterat larver i petriskålar vid 28 ° C för ytterligare analyser.
4. Kemiska Skärmar i EtOH / MTZ-behandlade Larvernas Zebrafish
- Ta med 96 brunnar innehållande 10 mM kemiska lager i DMSO (se Materials List för detaljer kring de kommersiella kemiska bibliotek) från -80 ° C frys. Täck med aluminiumfolie för att förhindra fotokatalytisk nedbrytning av kemikalier. Tina stamlösningarna vid RT med försiktig skakning.
- Förbereda kemiska lösningar genom att späda 10 mM stamlösningar med embryo medium till en slutlig koncentration av 50 ^ M (i plattor med 96 brunnar: initialer sCreen; i 1,5 ml rör: omprov). Kontroll larver behandlades med lika koncentrationer av DMSO i embryo medium.
- Transfer larver med nästan fullständig hepatocyte ablation, som behandlades med 1,5% EtOH / 15 mM MTZ och sorteras som tidigare nämnts antingen 96 brunnar (startskärmen) eller 24 brunnar (omprov) plattor förfylld med embryo medium vid en densitet av 5 larver per brunn. Använd dubbla brunnar för varje kemikalie.
- Avlägsna embryo medium och tillsätt antingen 250 | j, l (96-brunnars plattor) eller 500 | il (24-brunnars plattor) kemiska lösningar till varje brunn. Täckplåtar med aluminiumfolie och behandla larver för 50 timmar vid 28 ° C. Inspektera kemisk-blötläggning larver dagligen och ta bort eventuella döda larver från enskilda brunnar.
- Vid slutet av den kemiska behandlingen, observera antalet och / eller intensiteten av GFP-uttryckande hepatocyter under en epifluorescensmikroskop med GFP filtret vid en förstoring av 80X. Fotografi levande larver visar förbättrade eller minskad nummer och / eller intensiteten av GFP-uttryckande hepatocyter med en digitalkamera för poster.
- Bevara larver av formaldehyd fixering för konfokal avbildning som beskrivs i avsnitt 5.
- Att testa de kemikalier som underlättar hepatocyte förnyelse i den första skärmbilden, undersöka deras potens vid högre och lägre koncentrationer för att hitta den mest effektiva koncentrationen med de förfaranden som beskrivs i 4,1-4,5 (omprov).
5. Larvzebrafish Fixering, immunfärgning, och Confocal Imaging
- Söva larver genom tillsats Tricaine till en slutkoncentration av 0,02%. Överföra 10-15 larver till ett 1,5 ml rör och tvätta en gång med fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Ta bort PBS och tillsätt 1 ml av nyberedd 2% formaldehyd i PEM-buffert för att fixera O / N vid 4 ° C.
VARNING: Formaldehyd orsakar irritation och är känt för att vara en mänsklig carcinogen. Handtag i dragskåp. - Kasta fixeringslösning ordentligt och sedan wash 3 gånger med PBS vid RT. Fast larver kan hållas i PBS vid 4 ° C i upp till flera dagar. Fortsätter till nästa steg ger omedelbart bättre immunfärgning resultat.
- Försiktigt bort äggula och ytmaterial levern området med hjälp av en # 55 pincett under ett stereomikroskop.
- Permeabilisera och blockera larver i blockbuffert (4% bovint serumalbumin och 0,3% Triton X-100 i PBS) O / N vid 4 ° C.
- Inkubera med kanin anti-kollagen I-antikropp vid en utspädning av 1: 100 i blockeringsbuffert O / N vid 4 ° C. Tvätta 5 gånger under 15 minuter vardera med tvättbuffert (0,3% Triton X-100 i PBS).
- Inkubera med Alexafluor 647 konjugerad åsne-anti-kanin-antikropp vid en utspädning av 1: 200 i blockeringsbuffert O / N vid 4 ° C. Tvätta 5 gånger under 15 minuter vardera med tvättbuffert. Tvätta sedan en gång med PBS.
- Försiktigt överföra larver till objektglas med hjälp av en glaspipett, och orientera fast larver med vänster laterala sidan uppåt. Avlägsna överskott av PBS med hjälp av Kimwipes. Tillsätt en droppe monterings mediaOch tätningstäckglaset med nagellack. Genomföra konfokal avbildning omedelbart kraftigt rekommenderas.
- Använd ett konfokalt system utrustat med en 40X / 1.3 olje lins för att ta bilder. Använd laserstyrka på 20-50%. Fånga Z stack bilder på 1 pm intervaller.
6. Beredning av Adult Zebrafish
- Inrätta parning av [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (TP1: mCherry) jh11] 15,17 vuxna zebrafisk i parning tankar. Harvest embryon nästa morgon genom att anstränga vattensystem och överföring av embryon till 100 mm petriskålar med embryo medium.
- Håll inte mer än 100 embryon per petriskål. Under ett stereomikroskop, ta bort obefruktade ägg med användning av en glaspipett. Odla embryon vid 28 ° C och tillsätt PTU till en slutlig koncentration av 0,003% efter 10 HPF att inhibera pigment utveckling.
- Vid 4 dpf, använd Tricaine att söva larver och sortera ut [Tg (fabp10a: CFP-NTR)GT1; Tg (TP1: mCherry) jh11] larver. Tvätta Tricaine genom att byta till nya embryo medium flera gånger. Låt larver att återhämta sig vid 28 ° C tills de uppnår normal puls av 120-180 slag per minut 18.
- Höj sorterade larver till 6-12 månader gamla baserad på standardförfarandet 19.
7. Etanol, Metronidazol behandling, och leverregenerering hos vuxna Zebrafish
- Överför 6-12 månader gamla [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (TP1: mCherry) jh11] vuxna zebrafisk parning tankar med hjälp av ett nät. Håll fisk vid en densitet av högst 10 fiskar per tank.
- Framställ färsk EtOH-lösning genom att tillsätta EtOH i systemvattnet till en slutkoncentration av 1%. Behandla vuxna fiskar med 500 ml EtOH lösning i varje tank och hålla dem i en 28 ° C inkubator.
- Transfer vuxen fisk till färsk EtOH lösning dagligen, kassera död fisk properly som en biologisk fara. Kontinuerligt behandla djur för 72 timmar innan MTZ behandling.
- Bered en färsk 10 mM MTZ lösning i systemet vatten i 0,1% DMSO. Pre-värma MTZ lösning i en 28 ° C inkubator. Behandla fisk med 500 ml MTZ-lösning i 1 L korsning tank för 8 timmar vid 28 ° C, skyddat från ljus med hjälp av aluminiumfolie.
- Observera timme under behandlingen och avlägsna döda fiskar omedelbart. Kasta död fisk ordentligt som en biologiskt. Vid slutet av MTZ behandling, skölj MTZ genom att överföra djur till frisk systemet vatten två gånger.
- Låt djuren att återhämta sig och hålla dem i en inkubator vid 28 ° C. Foder och överföra fisk frisk systemet vatten dagligen tills tidpunkten för analyser.
8. Adult Zebrafish Lever Fixering, immunfärgning, och Confocal Imaging
- Söva vuxna fiskar med 0,02% Tricaine och avliva i isvatten under 15 min. Pat fisken torr på en pappershandduk och placera den på en dissekera matta.
- Exponera gastrointestinala organ genom att ta bort hud och muskler som tidigare beskrivits 20. Använda sax för att skära in i huden och underliggande muskeln längs magen från analfenan till kapseln, och sedan posteriort längs sidan av fisken tillbaka till analfena.
- Sätta fisken i ett 15 ml koniskt rör och tvätta en gång med PBS. Ta bort PBS och tillsätt 4 ml av nyframställd 2% formaldehyd i PEM-buffert för att fixera O / N vid 4 ° C.
- Kassera fixeringslösning på rätt sätt, och tvätta 3 gånger med PBS vid RT. Fasta prover kan hållas i PBS vid 4 ° C under flera dagar. Fortsätter till nästa steg omedelbart ger bättre immunfärgning resultat.
- Dissekera hela tarmen med levern från kroppshåligheten av fisken genom att skära matstrupen. Bädda in gastrointestinala organ med 4% låg smältpunkt agaros i en sektione mögel.
- Använda en vibratome att skära prov till tvärgående sektioner på 50 | j, m intervall i iskall PBS, med början från den främre änden. överföra sektioner till 6-brunnar med PBS med hjälp av en # 1 pensel.
- Permeabilisera och blockdelar i Block buffert O / N vid 4 ° C.
- Inkubera med kanin anti-kollagen I-antikropp vid en utspädning av 1: 100 i blockeringsbuffert O / N vid 4 ° C. Tvätta 5 gånger, 15 minuter vardera med tvättbuffert.
- Inkubera med Alexafluor 647 konjugerad åsne-anti-kanin-antikropp vid en utspädning av 1: 200 i blockeringsbuffert O / N vid 4 ° C. Tvätta 5 gånger, 15 min vardera med tvättbuffert och en gång med PBS.
- överföra försiktigt sektioner till objektglas med hjälp av en # 1 pensel. Ta bort överflödigt PBS med hjälp av Kimwipes, tillsätt en droppe monterings media, och tätningstäckglaset med nagellack. Genomföra konfokal avbildning omedelbart är mycket föreslås.
- Använd ett konfokalt system utrustat med en 40X / 1.3 olje lins för att ta bilder. Använd laserstyrka på 20-50%. Fånga Z stack bilder på 1 pm intervaller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar utvecklingen av en EtOH-inducerad fibrotisk lever modell larver zebrafisk. För att optimera ett protokoll för att exponera zebrafisk larver till EtOH, vi först utvärderas EtOH toxicitet. 2,5 dagar-post-befruktning (dpf) larver exponerades för EtOH koncentration 1%, 1,5% eller 2% under 24 timmar följt av en samtidig 24 hr EtOH / MTZ-behandling. Exponering för 2% EtOH orsakade hög dödlighet, medan nästan alla larver exponerades för 1% EtOH eller mindre visade minimala fibrogena förändringar med sällsynt avsättning av extracellulära matrixproteiner som kollagen. Baserat på dessa resultat var larverna förbehandlats med 1,5% EtOH under 24 timmar (2,5-3,5 dpf) och sedan samtidigt behandlas med MTZ under 24 timmar (3,5-4,5 DPF) (Figur 1A). EtOH / MTZ-behandlade larver uppvisade morfologiska abnormiteter inklusive uppåt krökning av bålen och svans, perikardiell ödem, och underlåtenhet att blåsa simblåsa. (Figur 1B). Vianvänds tre transgena linjer för att analysera fibrogena förändringar i EtOH / MTZ-behandlade larver lever: 1) Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1 linje uttrycker NTR-genen fuserad med cyan fluorescerande protein under hepatocyte specifika fabp10a promotorn 15; 2) Tg (TP1: mCherry) jh11 linjen markerar celler med aktiv Notch-signalering (Notch-responsiva celler, NRC) eller gall-epitelceller (BEC) med kärn mCherry 17, vilket uttryck är under kontroll av den TP1 modul som innehåller multipla RBP- jk-bindningsställen; och 3) Tg (hand2: EGFP) pd24 linje, vilka etiketter leverstel celler (HSCs) 13. DMSO-behandlad kontroll [Tg (fabp10a: GFP-NTR) GT1; Tg (TP1: mCherry) jh11; tg (hand2: EGFP) pd24] lever visade ingen fibrillära typ I-kollagen deponering 4,6,9 (Figur 1C, C), medan EtOH / MTZ-behandlade levrar visade förhöjd typ I kollagen ackumulering vid 25 och 50 h-efter ablation (HPA) (figur 1D, D ', E, E'). Dessutom, jämfört med DMSO-behandlade kontroll levrar (Figur 1C ''), ökad HSCs till antalet, med den ändrade morfologin från en stjärnliknande konfiguration till en myofibroblast liknande form med förlorade cytoplasmatiska processer i EtOH / MTZ-behandlade regenererande levrar ( Figur 1D '', E ''). Vi observerade två diskreta populationer av mCherry-uttryck NRC vid 25 hpa i EtOH / MTZ-behandlade regenere lever: dim röda NRC (Figur 1D '' ', inlägg, vita pilar) och röda NRC (Figur 1D' '', infälld , gul pilspetsar). Vid 50 hPa började hepatocyte specifika GFP att samuttrycka i NRC med dim mCherry uttryck i hela regenere lever (Figur 1E '' ', inlägg, vita pilar). Dessa GFP och dim mCherry-coexpressing NRC är uppenbarligen skiljer sig från ljusa röda NRC som är negativa för GFP (Figur 1E '' ', inlägg, gula pilar). Tidigare studier har visat att när hepatocytproliferation undertrycktes efter partiell hepatektomi (PHx), HPC utökas med åtföljande spridning av HSC: er 21. Dessutom är HPC och BEC delade histokemiska markörer 22. Därför, våra resultat indikerar att GFP och dim mCherry samuttrycker NRC skildra en zebrafisk-motsvarighet av HPC som skiljer i leverceller genom att stöta Notch nedreglering. De NRC upprätthålla högre nivåer av Notch-signalering kan kvarstå som cholangiocytes, som är differentierad BEC 23.
Figur 2 visar utvecklingen av en EtOH-inducerad fibrotisk lever modell i vuxen zebrafisk. Först utsätts vi vuxna zebrafisk till 1%, 1,5%, eller 2% EtOH för att bedöma lönsamheten. De flesta vuxna zebrafisk gjorde not överleva mer än 72 h av exponering för EtOH koncentrationer större än 1% (opublicerade data). Därför, för vuxna zebrafisk, förbehandlade vi fisken med ett% EtOH under 72 timmar och följdes med MTZ behandling (Figur 2A). Genom att utföra tidsförlopp analyser, visade vi markant förhöjd typ I kollagen deponering i de EtOH / MTZ-behandlade regenererande levrar vid 2, 3, och 4 dagar-efter ablation (dpa) (Figur 2C, D ', E') jämfört med DMSO-behandlade levrar (Figur 2B). I likhet med den som observerades i larverna ades GFP och dim mCherry co-uttryckande celler detekteras i EtOH / MTZ-behandlade regenere levrar av 12-månader gammal [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (TP1: mCherry) jh11] vuxen fisk på tre och fyra dpa (figur 2D, E, inlägg, vita pilar). Dessa data indikerar att HPC, som svarar på Notch-signalering, behålla sin förmåga att regenerera som hepatocyter inärvaron av fibrinogen förolämpning i vuxen zebrafisk.
Figur 3 visar representativa kemiska screeningresultat med hjälp av vår etanol-inducerad fibrotisk lever modell larver zebrafisk. Att sätta fingret på bioaktiva föreningar som påskyndar hepatocyte förnyelse i den fibrotiska levern, utförde vi kemiska genetiska skärmar. Vi screened ett bibliotek av 75 små molekyler med välkarakteriserade biologiska och farmaceutiska aktiviteter (Stem Cell Signaling Compound Bibliotek, Selleckchem) och ett bibliotek med 1000 färre karakteriserad små molekyler (ActiProbe-1K Library, TimTec) med användning av [Tg (fabp10a: CFP -NTR) GT1; Tg (TP1: mCherry) jh11] larver. Vi ablateras hepatocyterna i närvaro av 1,5% EtOH / 15 mM MTZ och sedan utsätts larverna till 50 | iM av föreningarna för 50 h (figur 3A). Ett antal Wnt agonister såsom SB 415.286 och CHIR-99021, inhibitorer av glykogensyntaskinas-3, främjas hepatocyt regenerering (figur 3C, D) jämfört med DMSO (figur 3B). Vidare [4- (1 H-1,2,3,4-tetraazol-5-yl) -1,2,5-oxadiazol-3-ylamin], förkortat HTOA, en roman Wnt pathway aktivator, förbättrad hepatocyt regenere i den fibrotiska lever som indikeras av större regenererad lever (figur 3E). Dessa data tyder på att vår ihållande fibrotisk modellen ger ett ovärderligt verktyg för att upptäcka små molekyler som förbättrar hepatocyte förnyelse.
Figur 1. Utveckling av en etanol-inducerad fibrotisk lever modell larver zebrafisk. (A) Scheme illustrerar perioder av EtOH och EtOH / MTZ behandling för att upprätta en fibrotisk lever modell larver. (B) på 50 timmar-post-ablation (HPA), EtOH / MTZ-behandlade larval zebrafisk utvecklat morfologiska abnormiteter inklusive uppåt krökning av bålen och svans, perikardiell ödem, och underlåtenhet att blåsa upp simblåsan. (CC '' ') i levern hos [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (TP1: mCherry) jh11; tg (hand2: EGFP) pd24] larver behandlades med DMSO, ECM proteinkollagen 1a var nästan odetekterbar (C, C ') och vilande HSCs visade en stjärnliknande konfiguration (C' '), medan NRC fördelade hepatocyter (C, C '' ', inlägg). (DE '' ') i levern hos EtOH / MTZ-behandlade larver, var förhöjd kollagen 1a avsättning observer (D, D', E, E '). HSCs ökat i antal och förlorade komplexa cytoplasmatiska processer (D '', E ''). Vid 25 hPa är mCherry-uttryck NRC sammansatt av två distinkta populationer. Gula pilarna visar ljusa röda NRC (D '' ', inlägg), medan vita pilar indikerar dim röda NRC (D' '', inlägg). Vid 50 hPa Tg (fabp10a: CFP-NTR) och Tg (TP1: mCherry) co-uttryckande celler började dyka upp i hela regenere lever (E '' ', infällda, vita pilar), medan de ljusa röda NRC hade ingen GFP uttryck (E '' ', inlägg, gula pilspetsar). Alla konfokala bilder är enda plan bilder utom C '', D ', E' ', som är projektionsbilder. Skalstrecken: B, 100 | j, m; CE '' ', 20 ^ m. EtOH, etanol; MTZ, metronidazol; hPa timmar-post-ablation; DPF, dagar-post befruktning. klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Utveckling av en etanol-inducerad fibrotisk lever modell i vuxen zebrafisk. (A) Scheme illustrerar perioder av EtOH och MTZ behandling för att upprätta en fibrotisk lever modell vuxen. (BE ') Tg (fabp10a: GFP-NTR), Tg (TP1: mCherry), och kollagen 1a expression i vibratome sektioner av DMSO (B och B') och EtOH / MTZ-behandlade (CE ") vuxna zebrafisk levrar. (BB) I DMSO-behandlade kontroller, kollagen 1a var nästan omöjlig att upptäcka (B) utan Tg (fabp10a: CFP-NTR) och Tg (TP1: mCherry) co-uttryckande celler (B). (CE) I EtOH / MTZ-behandlade regenere lever, var kollagen 1a nedfall markant förhöjt vid 2, 3 och 4 dpa (C, D ', E') med enpopulation av Tg (fabp10a: CFP-NTR) och Tg (TP1: mCherry) co-uttryckande celler vid tre och fyra dpa (D, E, inlägg, vita pilar). De ljusa röda NRC hade ingen GFP uttryck (D, E, inlägg, gula pilspetsar). BE, konfokala enda plan bilder. B'-E ", konfokala projektionsbilder. Skalstock, 20 | j, m. EtOH, etanol; MTZ, metronidazol; dpa, dagar-Post-ablation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Representativa kemiska screeningresultat med hjälp av etanol-inducerad fibrotisk lever modell larver zebrafisk. (A) System för hepatocyte regenere skärmen i fibrotisk lever. (BE) Kända och nya Wntaktivatorer öka hepatocyt förnyelse i fibrotisk lever. Konfokala projektionerna av EtOH / MTZ-behandlade levrar i [Tg (fabp10a: GFP-NTR) GT1; Tg (TP1: mCherry) jh11] larver som administrerades med DMSO (B), SB415286 (C), CHIR-99021 ( D), eller en roman Wnt aktivator [4- (1 H-1,2,3,4-tetraazol-5-yl) -1,2,5-oxadiazol-3-ylamin] (förkortat HTOA) (E). SB415286 och CHIR-99021 är glykogensyntaskinas-3-hämmare. Alla bilder är konfokala projektionsbilder. Skalstock, 20 | j, m. EtOH, etanol; MTZ, metronidazol; hPa timmar-post-ablation; DPF, dagar-post befruktning. klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi observerade HPC-medierad hepatocyt regenere i EtOH / MTZ-behandlade återhämtar levrar, vilket tyder på att även i närvaro av betydande mängd ECM-proteiner inklusive fibrillärt kollagen typ I, de HPC bibehåller sin kompetens för att regenerera som hepatocyter. Den MTZ endast behandling ökade inte avsättning av ECM-proteiner avsevärt, medan EtOH enda behandling inte framkalla HPC aktivering 15. Genom att använda den kombinerade EtOH / MTZ behandling, kunde vi undersöka HPC driven regenere i fibrotisk lever. Som nästan fullständig eliminering av hepatocyte framkallar HPC-driven hepatocyte förnyelse, är det viktigt att reda ut MTZ behandlade larver baserat på kriterierna i avsaknad av hepatocyte-specifik fluorescens och kraftigt nedsatt levervolymen med klustrade NRC. I fisk, blodkärlen i Gill och huden absorberar alkoholen 24, så att det inte finns något behov av att djuren dricka efter behag eller kräva intragastric infusion som i däggdjursmodeller. Vi inrymt EtOH- och efterföljande MTZ-behandlade vuxna fiskar i separata tankar utan att cirkulera vattnet. Det är väsentligt att överföra fisk till färsk EtOH-lösning dagligen och hålla locket på för att minimera avdunstning av EtOH. Även 48-72 tim EtOH / MTZ behandling effektivt inducerar ECM proteinsyntes i våra protokoll, har varken avancerad fibros eller cirros utvecklats i dessa fiskar. Därför kombination av MTZ med långvarig exponering av etanol som 12 veckors behandling 14, särskilt i vuxna fiskar, kan ge upphov till allvarligare leverskada att korrekt simulera och förhöra HPC-drivna förnyelse i kronisk leversvikt.
Zebrafisk fungerar som en utmärkt djurmodell för in vivo förening testning på grund av sin ringa storlek, stor avkomma, öppenhet och permeabilitet för små molekyler 25. Använda fibrotisk lever modell i zebrafisk, identifierade vi ett antal kända och nya Wnt ACTIvators och Notch-hämmare som accelererade hepatocyte regenere 15. Vår nuvarande fluorescens-baserad kemisk screening protokoll består av flera steg alla manuellt inklusive förberedelse av kemikalier, överföra EtOH-behandlade / hepatocyte-avlägsnade larver till 24-brunnsplattor, behandla kemikalier, och analys av effekterna av kemikalier på hepatocyte förnyelse. Den sysselsätter specifikt epifluorescence och / eller konfokalmikroskop att ta bilder för enskilt djur, som är arbetskrävande och tidskrävande. Hög genomströmning plattformar som automatiskt hanterar och förvärva cellulär upplösning avbildning av zebrafisk i kombination med kvantitativa datainsamling kommer att underlätta storskalig screening 26,27 .Dessa funktioner kommer att förstärkas om det kombineras med automatiserade läkemedelsdosering system som bestämmer olika kemiska koncentrationer 28, vilket kan ge minimal toxicitet med maximal effektivitet för att öka hepatocyte förnyelse. Trots dessa limitationer, som många kritiska spelare och huvudcelltyper i levern bevaras mellan zebrafisk och däggdjur 29 användning av in vivo-baserade liten molekyl screening med hjälp av zebrafisk fibrotiska lever modell katalyserar gäller upptäckten av nya terapeutiska strategier för kronisk leversjukdom.
Ytterligare två grupper oberoende har visat att efter nästan total förlust av hepatocyter utan fibrogena förolämpningar, BEC transdifferentiated i hepatocyte genom ett steg av dedifferentiering 30,31 med antagandet att cholangiocytes, fullt differentierade BEC, utgörs främst av NRC / BEC i zebrafisk. Även om transdifferentiering kan vara en av mekanismerna i körning hepatocyt regeneration, våra resultat indikerar att de HPC, vilka är kända för att utgöra huvuddelen av BEC i zebrafisk levern 32, nedreglera Notch-aktivitet att differentiera till hepatocyter. Samtidigt är det rimligt att spekulera i att the helt differentierade BEC, cholangiocytes, upprätthålla högre nivåer av Notch-aktivitet utan att konvertera till hepatocyter under regenerering. Fängslande, i närvaro av EtOH, som tidigare rapporterats 13, fann vi att HSC: er ökade i antal med det förändrade morfologin från en stjärnliknande konfiguration till en myofibroblast liknande form med förlorade cytoplasmatiska processer. De aktiverade HSCs kännetecknas av syntes av ECM-proteiner är principen skyldige ansvarig för onormal sårläkning under den integrerade processen för lever reparation 4. Även kronisk skada åsidosätter ofta leverns anmärkningsvärd förmåga till förnyelse, transplanterade HPC framgångsrikt repopulated den fibrotiska / cirrotisk råttlever 33. Därför kommer vår zebrafisk fibrotisk lever modell vara ett viktigt verktyg för att klargöra de molekylära och cellulära mekanismer som förmedlar effekterna av ihållande fibros på HPC-medierad hepatocyte förnyelse. Dessutom definierar flercelliga crosstalk som balanserar förnyelse och fibros genom att utnyttja vår zebrafisk fibrotisk lever modell kommer att ytterligare underlätta att utforma livskraftiga terapeutiska strategier för kronisk leversvikt in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av bidrag från GTEC (2731336 och 1411318), NIH (K01DK081351), och NSF (1.354.837) till CHS Vi tackar Alem Giorgis för kritisk läsning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium sulfate hemihydrate (CaSO4) | Acros | AC385355000 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | EMD | MX0075 | |
| 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid (PIPES) | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)- N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) |
Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-500 | |
| Metronidazole (MTZ) | Sigma-Aldrich | M3761 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) tablet | Amresco | E404 | Dissolve one tablet with 100 ml distilled water |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Low-melting agarose | Amresco | BP165 | |
| Stem Cell Signaling Compound Library | Selleck Chemicals | L2100 | 10 mM stock in DMSO |
| ActiProbe-1K Library | Timtec | ActiProbe-1K | 10 mM stock in DMSO |
| SB 415286 | Selleck Chemicals | S2729 | Dissolve with DMSO to 10 mM |
| CHIR-99021 | Selleck Chemicals | S2924 | Dissolve with DMSO to 10 mM |
| Anti-Collagen I antibody | Abcam | ab23730 | Use at 1:100 for immunostaining, reacts with fish |
| AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Molecular Probes | A31573 | Use at 1:200 for immunostaining |
| Mounting media (Vectorshield) | Vector Laboratories | H-1400 | |
| 100 mm Petri dish | VWR | 25384-088 | |
| 24-well plate | VWR | 10062-896 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | Dumont #55 |
| Glass slide | VWR | 48312-003 | 75x25 mm |
| Cover glass | VWR | 48366-045 | 18 mm |
| Plastic wrap | Fisher Scientific | 22305654 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 1213100 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Vibrotome | Leica | VT1000 S | |
| Stereo microscope | Leica | M80 | |
| Epifluoresence microscope | Leica | M205 FA | |
| Confocol microscope | Zeiss | LSM700 |
References
- Michalopoulos, G. K.
- Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. Stem cells and liver regeneration. Gastroenterology. 137 (2), 466-481 (2009).
- Shepard, C. W., Finelli, L., Alter, M. J. Global epidemiology of hepatitis C virus infection. Lancet Infect Dis. 5 (9), 558-567 (2005).
- Hernandez-Gea, V., Friedman, S. L.
- Bataller, R., Brenner, D. A.
- Kisseleva, T., Brenner, D. A. Anti-fibrogenic strategies and the regression of fibrosis. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 25 (2), 305-317 (2011).
- Constandinou, C., Henderson, N., Iredale, J. P.
- Gabele, E., et al. A new model of interactive effects of alcohol and high-fat diet on hepatic fibrosis. Alcohol Clin Exp Res. 35 (7), 1361-1367 (2011).
- Lieber, C. S. Alcoholic fatty liver: its pathogenesis and mechanism of progression to inflammation and fibrosis. Alcohol. 34 (1), 9-19 (2004).
- Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nat Rev Genet. 11 (10), 710-722 (2010).
- Jang, Z. H., et al. Metabolic profiling of an alcoholic fatty liver in zebrafish (Danio rerio). Mol Biosyst. 8 (7), 2001-2009 (2012).
- Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).
- Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. 56 (5), 1958-1970 (2012).
- Lin, J. N., et al. Development of an animal model for alcoholic liver disease in zebrafish. Zebrafish. 12 (4), 271-280 (2015).
- Huang, M., et al. Antagonistic interaction between Wnt and Notch activity modulates the regenerative capacity of a zebrafish fibrotic liver model. Hepatology. 60 (5), 1753-1766 (2014).
- Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3 (6), 948-954 (2008).
- Parsons, M. J., et al. Notch-responsive cells initiate the secondary transition in larval zebrafish pancreas. Mech Dev. 126 (10), 898-912 (2009).
- Baker, K., Warren, K. S., Yellen, G., Fishman, M. C. Defective 'pacemaker' current (Ih) in a zebrafish mutant with a slow heart rate. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (9), 4554-4559 (1997).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196 (2012).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp. (37), (2010).
- Paku, S., Schnur, J., Nagy, P., Thorgeirsson, S. S. Origin and structural evolution of the early proliferating oval cells in rat liver. Am J Pathol. 158 (4), 1313-1323 (2001).
- Turner, R., et al. Human hepatic stem cell and maturational liver lineage biology. Hepatology. 53 (3), 1035-1045 (2011).
- Kodama, Y., Hijikata, M., Kageyama, R., Shimotohno, K., Chiba, T. The role of notch signaling in the development of intrahepatic bile ducts. Gastroenterology. 127 (6), 1775-1786 (2004).
- Ryback, R., Percarpio, B., Vitale, J. Equilibration and metabolism of ethanol in the goldfish. Nature. 222 (5198), 1068-1070 (1969).
- Mathias, J. R., Saxena, M. T., Mumm, J. S. Advances in zebrafish chemical screening technologies. Future Med Chem. 4 (14), 1811-1822 (2012).
- Chen, C. H., Durand, E., Wang, J., Zon, L. I., Poss, K. D. zebraflash transgenic lines for in vivo bioluminescence imaging of stem cells and regeneration in adult zebrafish. Development. 140 (24), 4988-4997 (2013).
- Westhoff, J. H., et al. Development of an automated imaging pipeline for the analysis of the zebrafish larval kidney. PLoS One. 8 (12), e82137 (2013).
- Perlman, Z. E., et al. Multidimensional drug profiling by automated microscopy. Science. 306 (5699), 1194-1198 (2004).
- Chu, J., Sadler, K. C. New school in liver development: lessons from zebrafish. Hepatology. 50 (5), 1656-1663 (2009).
- Choi, T. Y., Ninov, N., Stainier, D. Y., Shin, D. Extensive conversion of hepatic biliary epithelial cells to hepatocytes after near total loss of hepatocytes in zebrafish. Gastroenterology. 146 (3), 776-788 (2014).
- He, J., Lu, H., Zou, Q., Luo, L. Regeneration of liver after extreme hepatocyte loss occurs mainly via biliary transdifferentiation in zebrafish. Gastroenterology. 146 (3), 789-800 (2014).
- Yao, Y., et al. Fine structure, enzyme histochemistry, and immunohistochemistry of liver in zebrafish. Anat Rec (Hoboken). 295 (4), 567-576 (2012).
- Yovchev, M. I., Xue, Y., Shafritz, D. A., Locker, J., Oertel, M. Repopulation of the fibrotic/cirrhotic rat liver by transplanted hepatic stem/progenitor cells and mature hepatocytes. Hepatology. 59 (1), 284-295 (2014).
