Introduction
간 실질 주요 세포 타입 간세포 하나의 놀라운 재생 능력에도 불구하고, 만성 간부전 간장 전구 세포 (HPC) 의존성이 재생 선도,이 능력을 손상시킨다.
만성 간 손상은 주로 알코올 남용, 만성 C 형 간염 바이러스 (HCV) 감염 (3) 및 비 - 알코올성 지방 간 질환 (NAFLD) (4)로부터 유도된다. 이 세포 외 기질 (ECM) 단백질의 축적과 연관되어 유지 간 섬유증으로 이끈다. 지속 ECM 축적 이후 높은 이환율과 사망률과 간경변의 결과로, 섬유 반흔 조직 (5)을 형성하여 그대로 간 구조를 왜곡. 많은 시도가 profibrogenic 사이토 카인 활성을 억제 근섬유 6에 초점을 주로 섬유 성 반응을 완화하기 위해 이루어졌다. 후자는 주로 H (간 성상 세포에서 유래희주), 간 흉터 형성 (4)에 대한 책임 원칙 간 비 실질 세포. 그럼에도 불구하고, 지속적인 폐의 섬유 성 모욕의 존재 간세포를 재생하는 HPC의 등 내인성 세포 소스를 자극 재생 치료법은 추가 조사를 기다리고 있습니다.
간 섬유화 많은 실험 모델은 포유류에 기재되어있다. 사염화탄소 (사염화탄소)의 반복적 인 주입 널리 뮤린 및 래트 모델 7 간 섬유화를 유도하는 데 사용되어왔다. 높은 지방 (HF)식이 요법과 함께 사용하면 알코올 profibrogenic 유전자 발현 및 간 섬유화 (8)의 실질적인 상향 조절되었다. 지방증 (지질 축적) 급성 알코올 노출의 결과이지만, 더 심각한 간 손상에 취약 9 간을 만든다.
제브라 피쉬, 다니오 레 리오는 재생 연구를위한 귀중한 척추 동물 모델 시스템으로 떠오르고있다. 그래도이러한 도롱뇽과 axolotls 같은 다른 낮은 척추 동물은 제브라 피쉬는 잠재적 인 재생을 조작하는 데 필요한 유전자 조작 및 시각화 전략에 관해서 다른 모델 시스템에 비해 장점이 있습니다 (10) 요인, 재생에 놀라운 능력을 가지고있다. 제브라 피쉬는 단순히 물에 에탄올 (EtOH로)를 추가하여 알코올성 간 질환 (ALD)을 연구하는 매력적인 척추 동물 모델을 나타냅니다. 애벌레와 성인 제브라 피쉬에 급성 EtOH로 노출 간 지방증 11-13 발생했습니다. 성인 지브라 피쉬가 확장을 EtOH 노출을 수신하면, 콜라겐 침착은 섬유증 관련 유전자 (14)의 상향 조절을 관찰 하였다. 그러나, 필요는 폐의 섬유 자극 등의 EtOH에 응답 간 재생을 연구 모델의 개발에 대한 필요성이 존재한다.
최근에는 제브라 15에서 EtOH로 인한 간 섬유화 모델을 개발 하였다. 우리는 애벌레 및 adul에 EtOH로 처리와 간세포 특이 유전자 제거 시스템을 결합t의 제브라 피쉬. 우리가 두 개의 형질 전환 라인을 생성, Tg는 (fabp10a : CFP-NTR) GT1, Tg 및 (fabp10a : mCherry-NTR) GT2, 대장균 nitroreductase (NTR)의 제어하에 각각 시안 mCherry 형광 단백질에 융합 된 단백질 10A, 간 기본 (fabp10a) 프로모터 바인딩 간세포 특이 지방산. 이 시스템에서, NTR은 간세포의 명시 적 죽음을 유도하는 DNA 간 가닥 가교제 (16)로 독성 전구 약물 메트로니다졸 (MTZ)을 변환합니다. 이 모델을 사용하여, 우리는 노치 신호 전달에 반응하는 간 세포의 집단은 간세포의 근처에 부재와 ECM의 초과 간세포로 변환하는 것이 보였다. 우리는 HPC의 이러한 세포를 지정. 또한, 화학 화면을 통해, 우리는 섬유 성 간에서 간세포의 재생을 증가 작은 분자 Wnt 신호의 활성화 및 노치 신호 전달의 억제를 확인 하였다. Therefo다시는 제브라 피쉬에서 우리의 섬유 성 간 모델은 셀 문화 - 또는 포유류 기반 검사 시스템에 비해 뛰어난 화학 검사 시스템을 나타냅니다. 그것은 상당한 비용과 시간을 절약 혜택을 생체 시스템입니다. 여기에서 우리는 EtOH로 유도 된 섬유 성 간 모델을 확립하고 제브라 피쉬에서이 모델을 사용하여 화학 화면을 수행하기위한 세부 절차에 대해 설명합니다. 또한, 시간 코스 분석은 섬유 성 간에서 발생하는 방법 간세포 재생 조사를 실시 하였다. 이 프로토콜은 메커니즘과 섬유 성 간에서 간세포의 재생을 향상시키는 전략을 연구하는 귀중한 도구를 제공합니다.
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Protocol
Zebrafish의 제기 및 기술 기관 동물 관리 및 사용위원회의 조지아 연구소의 승인을 국민 건강의 연구소와의 기준을 충족하는 표준 프로토콜을 사용하여 사육 하였다.
솔루션 1. 준비
- 배아 / 애벌레 제브라 피쉬를 유지하기 위해 (상호 교환 '배아 매체'와 함께 사용) 20 L 계란 물을 준비합니다. 증류수 250 ml의 1.5 g CASO 4, 6 g 즉시 바다 바다 소금을 녹여. 20 L 증류수와 선동으로 가득 찬 상자 속에 든 대형 유리 병에 붓는다.
- 1 L 준비 1- 페닐 -2- 티오 우레아 (PTU) 스톡 용액 (20 배). 1 L 증류수에 0.6 g의 PTU 분말을 녹여. 작업 용액 0.003 %의 최종 농도로 20 ml의 배아 매체 당 스톡 용액 1 ㎖를 추가한다.
주의 : PTU는 흡입 또는 피부 노출 다음 전신 독성을 일으킬 수 있습니다. 준비하고 적절한 처리 지침에 따라 사용합니다. - 1 L의 에틸 3- aminobe 준비nzoate 메탄 (Tricaine) 원액 (20 배). 증류수에 4g의 Tricaine 분말을 녹여. 1 M 트리스 완충액 (pH 9)을 첨가하여 pH를 7로 조정하고, 증류수 1 L에 최종 부피를 가져온다. -20 ℃에서 50 ㎖로 나누어 저장. 사용하기 전에 해동.
주의 : Tricaine는 감각의 손실을 유도 할 수있다. 준비하고 적절한 처리 지침에 따라 사용합니다. - 100 ml의 애벌레 메트로니다졸 (MTZ) 작업 솔루션을 준비합니다. 100 ㎖의 배지에서 배아 0.1 % 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)를 0.25 g의 MTZ 분말을 용해시켜 신선한 MTZ 15mM의 용액을 만든다. 격렬한 흔들림에 의해 완전히 MTZ 분말을 녹여. 신선한 MTZ 용액을 만들고 MTZ의 광촉매 열화를 방지하기 위해 알루미늄 박을 사용한다.
주의 : MTZ는 자극의 원인이 될 수 있습니다. 준비하고 적절한 처리 지침에 따라 사용합니다. - 100 ml의 유충 에탄올 / 메트로니다졸 (EtOH로 / MTZ) 작업 솔루션을 준비합니다. 신선한 MTZ 용액을 광촉매 드 않도록 알루미늄 호일을 사용MTZ의 그라데이션. 사용 직전 1.5 %의 최종 농도로 100 ml의 MTZ 용액에 1.5 ml의 100 % 에탄올을 추가한다.
- 500 ml의 성인 MTZ 작업 솔루션을 준비합니다. 500 ml의 시스템을 물에 0.1 % DMSO에 0.83 g의 MTZ 분말을 용해하여 신선한 10 mM의 MTZ 솔루션을합니다. 격렬한 흔들림에 의해 완전히 MTZ 분말을 녹여. 신선한 MTZ 용액을 만들고 MTZ의 광촉매 열화를 방지하기 위해 알루미늄 박을 사용한다.
- 1 L PEM 버퍼를 준비합니다. 30.2 g 파이프, 0.74 g의 EGTA, 0.12 g의 증류수에 황산을 녹인다. NaOH를 사용하여 pH 7을 조정합니다. 증류수 1 L에 최종 볼륨을 가져와.
애벌레 Zebrafish의 2. 준비
- [Tg는 (fabp10a : CFP-NTR)의 설정 결합 GT1; TG (TP1 : mCherry) jh11] TG (hand2 : EGFP)와 15,17 성인 제브라 피쉬는 짝짓기 탱크 (13) 성인 제브라 피쉬를 PD24. 시간 제한 짝짓기를 수행하는 디바이더를 사용합니다.
- 는 D를 제거다음 아침 ivider 것은 물고기가 중단없이 짝짓기를 할 수 있습니다. 2 시간 후 시스템 물 긴장과 배아 매체와 100mm 배양 접시에 배아를 전송하여 수확 배아.
- 페트리 접시 당에는 100 개 이상의 배아를 보관하십시오. 실체 현미경에서 유리 피펫을 사용하여 미 수정 난자를 제거합니다. 28 ° C에서 배아 성장 및 안료 개발을 억제 10 시간-후 수정 (HPF) 후 0.003 %의 최종 농도 페닐 티오 요소 (Phenylthiourea) (PTU)를 추가합니다.
애벌레 Zebrafish의 3. 에탄올, 메트로니다졸 치료 및 간 재생
- 1.5 %의 최종 농도로 배아 매체에 에탄올을 첨가하여 신선한의 EtOH 용액을 제조 하였다. PTU를 추가하지 마십시오.
- 56 80 HPF에 페트리 접시 당 20 ml의 에탄올 용액으로 배아를 취급합니다. 에탄올의 증발을 방지하기 위해 플라스틱 포장으로 배양 접시를 커버.
- 정렬 아웃 [Tg는 (fabp10a : CFP-NTR) GT1; TG (TP1 : mCherry) jh11 SUP>; TG (hand2 : EGFP) 80 HPF에서, CFP의 식에 의해 결정되는 비슷한 간 크기 PD24] 애벌레. EtOH로 처리 된 애벌레를 정렬 할 때이 이후의 EtOH / MTZ 처리와 높은 사망률의 원인이되므로 Tricaine을 사용하지 마십시오. 페트리 접시 당 30 배아의 밀도로 정렬 된 유충을 유지합니다.
- 0.1 % DMSO에 배아 매체에 신선한 15 mM의 MTZ를 준비합니다. 1.5 %의 최종 농도를 만들어 MTZ 용액에 적당량의 EtOH를 추가한다. 28 ° C에서 24 시간 동안 배양 접시 당 20 ㎖의 EtOH / MTZ 솔루션의 애벌레를 품어. 빛으로부터 보호하기 위해 EtOH로 농도와 알루미늄 호일로를 유지하기 위해 플라스틱 포장으로 배양 접시를 커버.
- 처리의 끝에서, 신선한 배아 매체 새로운 배양 접시에 애벌레를 전송하여를 EtOH / MTZ 용액을 제거한다. 배아 매체와 유충을 3 회 세척하고 PTU없이 20 ㎖ 배아 매체에 보관하십시오.
- 형광을 관찰, 간세포의 거의 완전한 제거와 유충을 정렬하려면80X의 배율에서 CFP 필터와 표면 형광 현미경. 간에서 최소한의 CFP 형광의 성공적인 절제의 결과와 크게 감소 간 볼륨.
- 의 EtOH / MTZ 처리 유충의 죽음을 방지하기 위해, 정렬 Tricaine을 사용하지 마십시오. 면역 염색의 유충을 수정 (5 장 참조) 또는 추가 분석을 위해 28 ° C에서 배양 접시에 정렬 된 유충을 유지합니다.
EtOH로 / MTZ 처리 애벌레 Zebrafish의 4. 화학 화면
- DMSO에 10 밀리미터에게 화학 주식을 포함하는 96 웰 플레이트를 가지고 ° C의 냉동고에서 -80 (상용 화학 라이브러리에 대한 자세한 내용은 재료 목록 참조). 화학 물질의 광촉매 열화를 방지하기 위해 알루미늄 호일로 커버. 부드러운 락으로 실온에서 재고 솔루션을 녹여.
- 96 웰 플레이트에서 50 μM (최종 농도 배아 배지 10 mM의 스톡 용액을 희석 한 약액을 조제 : 초기들creen; 1.5 ml의 튜브 : 재시험). 제어 유충은 배아 매체에서 DMSO의 동일한 농도로 처리 하였다.
- 중 96 웰 (초기 화면)에, 1.5 %의 EtOH / 15 mM의 MTZ로 처리하고 전술로 분류 된 거의 완전한 간세포 절제, 또는 24 웰와 전송 유충 (재시험) 판의 밀도로 배아 매체로 채워져 물론 당 5 애벌레. 각 화학 물질에 대해 중복 우물을 사용합니다.
- 배아 매체를 제거하고 250 μL (96 웰 플레이트) 또는 각 웰에 500 μL (24 웰 플레이트) 화학 솔루션 중 하나를 추가 할 수 있습니다. 알루미늄 호일 커버 플레이트 및 28 ° C에서 50 시간 동안 유충을 취급합니다. 매일 화학 몸을 담글 유충을 검사하고 개별 우물에서 죽은 유충을 제거합니다.
- 화학 처리의 끝에서, 80X의 배율로 CFP 필터와 표면 형광 현미경 CFP 발현 간세포의 수 및 / 또는 강도를 관찰한다. 사진 라이브 애벌레를 보여주는 향상 또는 감소D 번호 및 / 또는 기록을 위해 디지털 카메라와 CFP 발현 간세포의 강도.
- 섹션 5에 설명 된대로 공 촛점 이미징을위한 포름 알데히드 고정하여 유충을 보존합니다.
- 초기 화면에서 간세포 재생을 촉진 화학 물질을 다시 테스트하기 위해, 4.1-4.5 ( '재시험')에 설명 된 절차에 가장 효과적인 농도를 찾기 위해 더 낮은 농도에서 자신의 힘을 확인합니다.
5. 애벌레 Zebrafish의 고정, 면역 염색 및 공 촛점 이미징
- 0.02 %의 최종 농도로 첨가하여 Tricaine 유충 마취. 1.5 ㎖의 튜브에 10-15 유충을 전송하고 인산 완충 식염수 (PBS)로 한번 세척 하였다. PBS를 제거하고 4 ℃에서 O / N를 해결하기 위해 PEM 버퍼에 새로 제조 된 2 %의 포름 알데히드 1 ㎖를 추가합니다.
주의 : 포름 알데히드가 자극을 원인과 인간 발암 물질로 알려져있다. 화학 흄 후드에서 처리합니다. - 워싱턴 제대로하고 솔루션을 고정 폐기RT에서 PBS와 SH 3 번. 고정 유충 수일까지 4 ℃에서 PBS에 보관 될 수있다. 다음 단계로 진행 즉시 면역 더 나은 결과를 제공한다.
- 조심스럽게 실체 현미경 하에서 # 55 집게를 사용하여 간 영역을 다루는 노른자 피부를 제거합니다.
- Permeabilize 하시려면 및 블록 버퍼 블록 유충 (4 % 소 혈청 알부민 0.3 % PBS에 트리톤 X-100) O / N 4 ° C에서.
- 1의 희석에 토끼 항 - 콜라겐 I 항체와 함께 품어 : (100)를 블록 버퍼 O에서 / N을 4 ℃에서. 세척 버퍼 (PBS에서 0.3 % 트리톤 X-100)를 15 분마다 5 회 반복한다.
- 1의 희석에 AlexaFluor와 647 복합 당나귀 항 - 토끼 항체를 품어 : 200 블록 버퍼 O에서 / N을 4 ℃에서. 세척 버퍼와 15 분마다 5 회 반복한다. 그 후 PBS로 한번 씻어.
- 조심스럽게 왼쪽 측면이 위를 향하도록 유리 피펫 및 동양 고정 애벌레를 사용하여 유리 슬라이드에 애벌레를 전송합니다. 초과 PBS 사용하여 매직 잉크를 킴 와이프를 제거합니다. 장착 미디어 방울을 추가매니큐어와 및 밀봉 용 커버 유리. 실시 공 촛점 영상은 즉시 매우 좋습니다.
- 이미지를 캡처하는 40X / 1.3 오일 렌즈가 장착 된 공 초점 시스템을 사용합니다. 20-50%에서 레이저 강도를 사용합니다. 1 ㎛ 간격으로 Z 스택 이미지를 캡처합니다.
성인 Zebrafish의 6. 준비
- [Tg는 (fabp10a : CFP-NTR)의 설정 결합 GT1; TG : 상대 탱크 (TP1 mCherry) jh11] 15,17 성인 제브라 피쉬. 수확 시스템 물 긴장과 배아 매체와 100mm 배양 접시에 배아를 전송하여 다음 날 아침 배아.
- 페트리 접시 당에는 100 개 이상의 배아를 보관하십시오. 실체 현미경에서 유리 피펫을 사용하여 미 수정 난자를 제거합니다. 28 ° C에서 배아 성장 및 안료 개발을 억제하기 위해 10 HPF 후 0.003 %의 최종 농도 PTU를 추가합니다.
- 4 DPF에서 애벌레를 마취하고 분류하는 Tricaine를 사용하여 [Tg는 (fabp10a : CFP-NTR)GT1; TG (TP1 : mCherry) jh11] 애벌레. 신선한 배아 매체를 여러 번 변경하여 Tricaine을 씻으십시오. 그들이 분 18 당 120-180 비트의 정상적인 심장 박동을 달성 할 때까지 애벌레가 28 ° C에서 복구 할 수 있습니다.
- 표준 절차 (19)에 따라 6-12개월 이전에 정렬 된 유충을 올립니다.
성인 Zebrafish의 7. 에탄올, 메트로니다졸 치료 및 간 재생
- 6~12개월 된 [Tg는 (fabp10a : CFP-NTR)로 이동 GT1을; TG : 그물을 사용하여 상대 탱크 (TP1 mCherry) jh11] 성인 제브라 피쉬. 탱크 당 10 개 이상의 물고기의 밀도로 물고기를 유지합니다.
- 1 %의 최종 농도 시스템 물을 EtOH을 첨가하여 신선한의 EtOH 용액을 제조 하였다. 각 탱크에 500 ml의 EtOH를 용액으로 성인 물고기를 치료하고 28 ° C 배양기에서 그들을 유지합니다.
- 매일 신선한 EtOH로 솔루션에 전송 성인 물고기, 폐기 죽은 물고기 소품생물 학적으로 지함. 지속적으로 MTZ 처리하기 전에 72 시간 동안 동물을 취급합니다.
- 0.1 % DMSO의 시스템 물에 신선한 10 mM의 MTZ 솔루션을 준비합니다. 28 ° C를 인큐베이터에서 MTZ 솔루션을 미리 따뜻하게. 28 ° C에서 8 시간 동안 1 L 횡단 탱크에서 500 ml의 MTZ 솔루션으로 물고기를 치료 알루미늄 호일을 사용하여 빛으로부터 보호합니다.
- 치료 기간 동안 매 시간 관찰하고 즉시 죽은 물고기를 제거합니다. 생물 학적으로 제대로 죽은 물고기를 폐기하십시오. MTZ 처리의 끝에서 두 시스템 신선한 물 동물 전사함으로써 MTZ 씻어.
- 동물이 28 ° C에서 인큐베이터에서 회복하고 유지 할 수 있습니다. 피드 및 분석을위한 시점까지 매일 신선한 시스템 물에 물고기를 전송합니다.
8. 성인 Zebrafish의 간 고정, 면역 염색 및 공 촛점 이미징
- 0.02 % Tricaine와 성인 물고기를 마취하고 15 분 동안 얼음 물에 안락사. 팻 물고기 종이 타월에 건조하고 해부 매트에 놓습니다.
- 이전으로 피부와 근육을 제거하여 위장 기관을 노출 20을 설명했다. 항문 지느러미로 다시 후방 물고기의 측면을 따라 다음 아가미에 뒷 지느러미에서 배를 따라 피부와 기본 근육을 잘라 가위를 사용합니다.
- 15 ML 원뿔 튜브에 물고기를 넣고 PBS로 한번 씻어. PBS를 제거하고 4 ℃에서 O / N를 해결하기 위해 PEM 버퍼에 새로 제조 된 2 %의 포름 알데히드의 4를 가하여.
- 제대로 솔루션을 고정 폐기하고, RT에서 PBS로 3 회 세척한다. 고정 된 샘플은 수일 동안 4 ℃에서 PBS에 보관 될 수있다. 다음 단계로 진행하기 바로 면역 더 나은 결과를 제공한다.
- 식도를 잘라 물고기의 체강 내에서 간과 전체 장 해부. 4 %가 절편 금형에 아가로 오스 저 융점와 위장 기관을 포함.
- 앞쪽 끝에서 시작하여 얼음 차가운 PBS에 50 μm의 간격으로 가로 섹션으로 샘플을 잘라 vibratome를 사용합니다. 초 이동A # 1 페인트 브러시를 사용하여 PBS 6 웰 플레이트에 TIONS.
- Permeabilize 하시려면 및 블록 버퍼 O에서 블록 섹션 / N 4 ° C에서.
- 1의 희석에 토끼 항 - 콜라겐 I 항체와 함께 품어 : (100)를 블록 버퍼 O에서 / N을 4 ℃에서. 5 회, 15 분 세척 버퍼와 각을 씻으십시오.
- 1의 희석에 AlexaFluor와 647 복합 당나귀 항 - 토끼 항체를 품어 : 200 블록 버퍼 O에서 / N을 4 ℃에서. 세척 완충액으로 한 번 PBS로 5 회, 15 분 각각을 씻으십시오.
- 조심스럽게 # 1 페인트 브러시를 사용하여 유리 슬라이드에 섹션을 전송합니다. , 매직 잉크를 킴 와이프를 사용하여 여분의 PBS를 제거 설치 미디어의 한 방울을 추가하고, 매니큐어와 인감 커버 유리. 실시 공 촛점 영상은 즉시 매우 좋습니다.
- 이미지를 캡처하는 40X / 1.3 오일 렌즈가 장착 된 공 초점 시스템을 사용합니다. 20-50%에서 레이저 강도를 사용합니다. 1 ㎛ 간격으로 Z 스택 이미지를 캡처합니다.
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Representative Results
도 1은 유충 지브라 피쉬의 EtOH로 인한 간 섬유화 모델의 개발을 도시한다. 의 EtOH에 제브라 피쉬 애벌레를 노출 프로토콜을 최적화하기 위해, 우리는 먼저 EtOH로 독성을 평가 하였다. 2.5 일 후 - 수정 (DPF) 유충은 동시 24 시간을 EtOH / MTZ 처리 한 다음 24 시간 동안 EtOH 중 농도 1 %, 1.5 %, 2 %를 노출시켰다. 거의 모든 애벌레 콜라겐 등 세포 외 기질 단백질의 희귀 증착 최소한의 폐의 섬유 성 변화를 보여 1 %의 EtOH 이하로 노출 동안 2 %의 EtOH에 노출, 높은 사망률을 일으키는 원인이되었다. 이러한 결과에 기초하여, 유충 24 시간 (2.5-3.5 DPF), 그리고, 동시에 24 시간 (3.5-4.5 DPF) (도 1A)에 대해 MTZ 처리 1.5 % EtOH로 전처리 하였다. 의 EtOH / MTZ 처리 된 유충은 트렁크와 꼬리의 위쪽 곡률, 심낭 부종 및 수영 방광을 팽창 실패를 포함하여 형태 학적 이상 소견을 보였다. (그림 1B). 우리1)의 Tg (fabp10a : 다음의 EtOH / MTZ 처리 애벌레 간에서 폐의 섬유 성 변화 분석하는 세 개의 유전자 변형 라인을 사용 CFP-NTR) GT1 라인이 간세포 특이 fabp10a 프로모터 (15)에서 시안 형광 단백질과 융합 NTR 유전자를 표현하는 단계; 2)의 Tg (TP1 : mCherry) jh11 라인은 여러 RBP- 함유 TP1 모듈의 제어하에 발현 핵 mCherry (17)와 활성 노치 신호 (노치 응답 세포 NRCS)이나 담관 상피 세포 (BECS)와 셀 마크 사이트 JK는 결합; 3)의 Tg (hand2 : 간 성상 세포 (조혈 모세포) (13) 레이블 EGFP) PD24 라인. DMSO 처리 제어 [Tg는 (fabp10a : CFP-NTR) GT1; TG (TP1 : mCherry) jh11, TG (hand2 : EGFP)은 PD24] 간 내가, 증착 4,6,9 (그림 1C, C ')를 콜라겐에는 섬유의 유형을 보여주지의 EtOH / MT 반면,Z-처리 간 내가 25 및 50 시간-후 절제 (고전력 증폭기) (그림 1D, D ', E, E')에 축적 콜라겐 높은 유형을 표시. 또한, DMSO 처리 제어 간 (그림 1C '')에 비해, 조혈 모세포는 EtOH로 / MTZ 처리 된 재생 간에서 손실 세포질 프로세스 (와 근섬유 형상에 별 모양 구성에서 변형 된 형태로 수 증가 그림 1D ', E' '). 우리는 EtOH로 / MTZ 처리 된 재생 간 25 고전력 증폭기에 mCherry 발현 NRCS의 두 개의 분리 된 인구를 관찰 : 빨간색 NRCS (그림 1D '' ', 삽입, 흰색 화살표)과 밝은 빨간색 NRCS (그림 1D'를 '희미한, 삽입 노란색 화살촉). 50 고전력 증폭기에서, 간세포 특정 CFP는 재생 간 (그림 1E '' ', 삽입, 흰색 화살표)에 걸쳐 어두운 mCherry 식 NRCS에서-명시 협력하기 시작했다. 이 CFP와 어두운 mCherry-coexpressing NRCS는 CFP (그림 1E '' ', 삽입, 노란색 화살촉)에 대한 부정적인 밝은 빨간색 NRCS에서 분명하게 구별 할 수 있습니다. 이전 연구는 간세포 증식이 부분 절제술 (PHX) 후 억제되었을 때의 HPC는 조혈 모세포 (21)의 병용 증식로 확장 것으로 나타났다. 또한,의 HPC 및 BECS는 조직 화학적 마커 (22)을 공유했습니다. 따라서, 우리의 결과는 CFP와 희미한 mCherry 공동 발현 NRCS는 노치 하향 조절을 발생하여 간세포로 분화의 HPC의 제브라 피쉬 - 상대를 묘사 나타냅니다. 노치 신호 전달의 높은 수준을 유지 NRCS는 BECS 23 차별화되어 담관으로 남아있다.
도 2는 성인 지브라 피쉬의 EtOH로 인한 간 섬유화 모델의 개발을 도시한다. 먼저, 생존력을 평가 EtOH 중 1 %, 1.5 %, 2 %로 성인 제브라 노출. 대부분의 성인 제브라 피쉬는 N 않았다오티는 EtOH로 농도에 노출보다 1 % (게시되지 않은 데이터) 이상의 72 시간을 생존. 따라서, 성인 제브라 피쉬, 우리는 72 시간 동안 1 % EtOH로 물고기를 예비 처리 및 MTZ 치료 (그림 2A)로 하였다. 시간 코스 분석을 수행함으로써, 우리는 내가 2, 3에서의 EtOH / MTZ 처리 된 재생 간에서 증착 콜라겐, 상당히 높은 유형을 보여 사일 포스트 - 절제 (DPA) (그림 2C ', D', E ') DMSO 처리 간 (도 2B ')으로 비교 하였다. 애벌레에서 관찰 된 것과 유사하게, CFP 및 어두운 mCherry 공동 발현하는 세포는 12 개월 된 [Tg는 (fabp10a : CFP-NTR)의 EtOH로 / MTZ 처리 된 재생 간에서 검출되었다 GT1; TG (TP1 : mCherry) 3, 4 DPA (그림 2D, E, 세트, 흰색 화살표)에서 jh11] 성인 물고기. 이러한 데이터는 응답하여 HPC의가, 신호를 노치에서 간세포로 재생하는 능력을 유지하는 것을 나타냅니다성인 제브라 피쉬에서 폐의 섬유 성 모욕의 존재.
도 3은 유충 제브라 우리 에탄올 - 유도 간 섬유증 모델을 사용하여 상기 대표 화학적 스크리닝 결과를 나타낸다. 섬유화 간에서 간세포의 재생을 촉진 생리 활성 화합물을 파악하기 위해, 우리는 화학 유전자 화면을 수행. 우리는 잘 특성화 생물 및 제약 활동 (화합물 라이브러리를 시그널링 Selleckchem를 줄기 세포) 및 [Tg는 (fabp10a를 사용하여 1,000 덜 특징으로 작은 분자 (ActiProbe-1K 도서관, TimTec)의 라이브러리 (75) 작은 분자의 라이브러리를 상영 : CFP -NTR) GT1; TG (TP1 : mCherry) jh11] 애벌레. 우리는 1.5 %의 EtOH / 15 mM의 MTZ의 존재 간세포를 절제 한 후 50 시간 (도 3A)에 대한 화합물의 50 μM의 유충을 노출시켰다. 이러한 SB 415286 및 CHIR-990 등의 Wnt 작용제의 수(21) 글리코겐 신타 제 키나제 -3 촉진 간세포 재생 DMSO (도 3B)에 비해 (도 3c, D)의 억제제. 또한, [4- (1H-1,2,3,4- 테트라 졸 -5- 일) -1,2,5 옥사 디아 졸 -3- 일 아민] HTOA, 신규의 Wnt 경로의 활성화로 약칭, 향상된 간세포의 재생 더 재생성 간 (도 3E)에 의해 나타낸 바와 같이, 간 섬유화. 이러한 데이터는 우리의 지속적인 섬유 성 모델은 간세포의 재생을 향상 작은 분자를 발견하는 귀중한 도구를 제공하는 것이 좋습니다.
유생 지브라 피쉬의 에탄올 - 유도 간 섬유증 모델도 1은 단지. (A) 방식의 유충의 간 섬유증 모델을 확립을 EtOH와의 EtOH / MTZ 치료 기간을 도시. 50시간-후 절제 (고전력 증폭기)에서 (B)의 EtOH / MTZ 처리 리터arval 제브라 피쉬는 몸통과 꼬리의 위쪽 곡률, 심낭 부종 및 수영 방광을 팽창 실패를 포함하여 형태 학적 이상을 개발했다. [Tg가의 간에서 (CC '' ') (fabp10a : CFP-NTR) GT1; TG (TP1 : mCherry) jh11, TG (hand2 : EGFP) DMSO 처리 PD24] 유충, ECM 단백질 콜라겐 (1A)는 (C, C ') 거의 검출되지이고 대기 조혈 모세포는 (C를 스타와 같은 구성을 보여'반면 ') 간세포 (C, C '' ', 삽입)에 분산 NRCS. (DE '' ') (E, E'를 EtOH로 / MTZ 처리 유충의 간에서 높은 콜라겐 (1A) 증착 D, D)이 관찰되었다 '. 조혈 모세포는 수의 증가와 복잡한 세포질 프로세스 (D ', E'를 ') 잃었다. 25 고전력 증폭기에서, mCherry 발현 NRCS는 두 가지 집단으로 구성되어. '(' ', 삽입, 흰색 화살표 희미한 붉은 NRCS D)을 나타내는 반면, (삽입 노란 화살촉 밝은 빨간색 NRCS D'를 ')'을 나타냅니다. 50 고전력 증폭기에서의 Tg (fabp10a : CFP-NTR)과의 Tg (TP1 : mCherry) 밝은 빨간색 NRCS가 더 CFP 표현이 없었다 동안 공동 발현하는 세포는 재생 간 (E '' ', 삽입, 흰색 화살표)를 통해 새로운 시작 (E '' ', 삽입, 노란색 화살촉). 모든 공 초점 이미지가 투사 이미지입니다 C ', D', E ''를 제외하고 단일 평면 이미지입니다. 스케일 바 : B, 100 μm의, CE '' ', 20 μm의. EtOH로, 에탄올; MTZ, 메트로니다졸; 고전력 증폭기, 시간 - 후 절제; DPF, 일 - 후 수정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
성인 지브라 피쉬의 에탄올 - 유도 간 섬유증 모델도 2 개발. (A) 방식은 성인의 간 섬유증 모델을 확립을 EtOH 및 MTZ 치료 기간을 도시. (BE '()과의 EtOH / :, Tg는 (TP1 mCherry)의 Tg (CFP-NTR fabp10a) DMSO-B 및 B)의 vibratome 섹션에서, 콜라겐 (1A) 식'(CE ') 성인 제브라 피쉬 간 MTZ 처리. 더 Tg가와 (BB ')을 DMSO 처리 컨트롤에서, 콜라겐 (1A)는 (B 거의 탐지했다') (fabp10a : CFP-NTR)과의 Tg (TP1 : mCherry)의 공동 발현 세포 (B). (CE ')가 함께 (D', E '는을 EtOH / MTZ 재생 처리가 간에서 콜라겐 1A 증착은 크게 2, 3, 4 DPA C)에서 승온'3, 4 DPA (D, E, 세트, 흰색 화살표)에서 공동 발현하는 세포 : 및 Tg는 (mCherry TP1)의 Tg (CFP-NTR fabp10a)의 인구. 밝은 빨간색 NRCS는 (D는 E가, 세트, 노란 화살촉이). BE, 공 초점 단일 평면 이미지. B'-E ', 공 초점 투사 이미지에는 CFP 표현이 없었다. 스케일 바, 20 μm의. EtOH로, 에탄올; MTZ, 메트로니다졸; DPA는 일-후 절제. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
간 섬유화의 간세포 재생 화면도 유생 지브라 피쉬의 에탄올 - 유도 간 섬유증 모델을 사용 3. 대표적인 화학적 스크리닝 결과. (A) 방식. 알려진 및 소설의 Wnt (BE)활성제는 섬유 성 간에서 간세포의 재생을 증가. DMSO (B), SB415286 (C), CHIR-99021 (투여 된 유충 :;면 : [jh11의 Tg (mCherry TP1) GT1의 Tg (CFP-NTR fabp10a)]에서의 EtOH / MTZ 처리 간의 공 촛점 전망 D) 또는 HTOA 약칭 신규의 Wnt 활성제 [4- (1H-1,2,3,4- 테트라 졸 -5- 일) -1,2,5 옥사 디아 졸 -3- 일 아민 () (E). SB415286 및 CHIR-99021은 합성 효소 키나아제-3 억제제 글리코겐 있습니다. 모든 이미지는 공 초점 투사 이미지입니다. 스케일 바, 20 μm의. EtOH로, 에탄올; MTZ, 메트로니다졸; 고전력 증폭기, 시간 - 후 절제; DPF, 일 - 후 수정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리는 심지어 내가 콜라겐 섬유의 유형을 포함하여 ECM 단백질의 상당한 양의 존재의의 HPC가 간세포로 재생하기 위해 자신의 역량을 유지하는 것이 시사의 EtOH / MTZ 처리 복구 간에서 HPC 매개 간세포의 재생을 관찰했다. 의 EtOH 만 처리는 HPC 활성화 (15)를 유도하지 않은 반면, MTZ 전용 치료는 크게 ECM 단백질의 침착을 증가하지 않았다. 조합의 EtOH / MTZ 처리를 이용하여, 우리는 섬유 성 간에서 HPC 기반의 재생을 조사 할 수 있었다. 간세포의 거의 완전한 제거는 HPC 중심의 간세포 재생을 이끌어, 클러스터 NRCS에 의해 간세포 특이 형광의 유무의 기준에 따라 MTZ 처리 유충과 크게 감소 간 볼륨을 정리하는 것이 중요합니다. 동물 수의 음료 또는 intraga을 요구하는 것을 허용 할 필요가 없기 때문에 물고기에서, 길 및 피부의 혈관, 알콜 (24)을 흡수포유 동물 모델에서와 같이 STRIC 주입. 우리는 물을 순환하지 않고 EtOH- 별도의 탱크에 후속 MTZ 처리 성인 물고기를 보관. 매일 신선한의 EtOH 용액에 물고기를 전송하고 EtOH로의 증발을 최소화하기에 뚜껑을 유지하는 것이 필수적입니다. 48 ~ 72 시간의 EtOH로 / MTZ 처리를 효율적으로 우리의 프로토콜에 ECM 단백질 합성을 유도하지만, 고급 섬유증이나 간경변 어느 쪽이 물고기에 개발되었다. 따라서, 에탄올의 장기간 노출 등 12주 처리 (14)와 MTZ의 조합은, 특히 성인 물고기에, 제대로 시뮬레이션 및 만성 간 장애에 HPC 기반의 재생을 심문하기 위해 더 심각한 간 손상을 야기 할 수 있음.
제브라 인해 작은 분자 (25)의 작은 크기, 큰 자손, 투명성 및 투과도 생체 화합물 시험에 우수한 동물 모델로서 기능한다. 제브라 피쉬의 간 섬유증 모델을 사용하여, 우리는 공지 및 신규의 Wnt ACTI들을 식별vators 및 간세포 재생 (15) 가속 노치 억제제. 우리의 현재 형광 기반 화학 심사 프로토콜은 여러 단계로 구성됩니다 모두 수동으로 간세포 재생에 대한 화학 물질의 효과를 24 웰 플레이트에 EtOH로 처리 / 간세포-절제 애벌레를 전송하는 화학 물질의 제조, 화학 물질 처리 및 분석을 포함하여 수행 하였다. 그것은 특별히 힘든 시간이 소요됩니다 개별 동물에 대한 이미지를 캡처하는 표면 형광 및 / 또는 공 초점 현미경을 사용합니다. 화학 물질의 농도의 범위를 결정하는 자동화 된 약제 투여 방식과 결합 된 경우에 자동적으로 처리하고 대규모 스크리닝 26,27 .These 기능을 용이하게 정량적 데이터 수집과 조합하여 제브라 피쉬 세포 - 해상도 이미지를 획득 높은 처리량 플랫폼 강화 될 28, 간세포의 재생을 향상시키기위한 최대의 효과와 최소의 독성을 줄 수있다. 이 limita에도 불구하고간 등이있을 경우, 많은 중요한 플레이어 주요 세포 유형은 생체 만성 간 질환에 대한 새로운 치료 전략에 유효 발견을 촉진 할 제브라 섬유증, 간 모델을 이용하여 스크리닝 소분자 기반 채용 제브라 포유류 (29) 사이에 보존된다.
두 개의 추가 그룹은 독립적으로 담관, 완전히 차별화 된 BECS는 주로 제브라 피쉬에서 NRCS / BECS을 포함하는 것을 폐의 섬유 모욕없이 간세포의 근처 총 손실 후, BECS는 가정에 탈분화 (30, 31)의 단계를 간세포로 transdifferentiated 것을 증명하고있다. 분화는 간세포의 재생의 구동 메커니즘의 하나 일 수 있으나, 우리의 결과는 공지 된 HPC의은, 제브라 피쉬 간 32 BECS의 대부분을 구성하는 간세포로 분화하도록 노치 활성을 하향 조절하는 것을 나타낸다. 한편,는 번째 것을 추측 그럴듯즉 완전히 분화 BECS은 담관이 재생 중에 간세포로 변환하지 않고 노치 활성의보다 높은 수준을 유지한다. 이전 13보고 흥미롭게의 EtOH의 존재, 우리는 조혈 모세포가 손실 세포질 프로세스와 근섬유 형상에 별 모양 구성에서 변형 된 형태로 수 증가 것으로 나타났습니다. ECM 단백질 합성을 특징으로 활성화 된 간 성상 세포는 간 (4)의 수리 통합 과정 이상 상처 치유에 대한 책임 원리 원인이다. 만성 손상은 종종 재생을위한 간의 놀라운 능력을 무시하지만, 이식의 HPC 성공적으로 섬유 성 / 간경변 쥐의 간 (33)을 다시 채워. 따라서, 우리의 제브라 피쉬 섬유 성 간 모델은 HPC 매개 간세포 재생에 지속적인 섬유증의 효과를 매개하는 분자 및 세포 메커니즘을 해명하기위한 필수적인 도구가 될 것입니다. 또한, 멀티 셀 C를 규정우리의 제브라 피쉬의 섬유 성 간 모델을 이용하여 재생 및 섬유화의 균형을 rosstalk 추가 생체 내에서 만성 간 장애에 대한 가능한 치료 전략을 설계 촉진 할 것이다.
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Acknowledgments
이 작품은 우리는 원고의 중요한 읽기 알렘 Giorgis 감사 CHS에 GTEC (2731336 및 1411318)는 NIH (K01DK081351)와 NSF (1354837)에서 교부금에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium sulfate hemihydrate (CaSO4) | Acros | AC385355000 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | EMD | MX0075 | |
| 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid (PIPES) | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)- N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) |
Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-500 | |
| Metronidazole (MTZ) | Sigma-Aldrich | M3761 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) tablet | Amresco | E404 | Dissolve one tablet with 100 ml distilled water |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Low-melting agarose | Amresco | BP165 | |
| Stem Cell Signaling Compound Library | Selleck Chemicals | L2100 | 10 mM stock in DMSO |
| ActiProbe-1K Library | Timtec | ActiProbe-1K | 10 mM stock in DMSO |
| SB 415286 | Selleck Chemicals | S2729 | Dissolve with DMSO to 10 mM |
| CHIR-99021 | Selleck Chemicals | S2924 | Dissolve with DMSO to 10 mM |
| Anti-Collagen I antibody | Abcam | ab23730 | Use at 1:100 for immunostaining, reacts with fish |
| AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Molecular Probes | A31573 | Use at 1:200 for immunostaining |
| Mounting media (Vectorshield) | Vector Laboratories | H-1400 | |
| 100 mm Petri dish | VWR | 25384-088 | |
| 24-well plate | VWR | 10062-896 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | Dumont #55 |
| Glass slide | VWR | 48312-003 | 75x25 mm |
| Cover glass | VWR | 48366-045 | 18 mm |
| Plastic wrap | Fisher Scientific | 22305654 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 1213100 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Vibrotome | Leica | VT1000 S | |
| Stereo microscope | Leica | M80 | |
| Epifluoresence microscope | Leica | M205 FA | |
| Confocol microscope | Zeiss | LSM700 |
References
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