Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

פיתוח מודל כבד אתנול-induced fibrotic דג הזברה ללמוד ובתאים בתיווך תא התחדשות Hepatocyte

Published: May 13, 2016 doi: 10.3791/54002
Automatic Translation
1, 1, 1
1School of Biology, Parker H. Petit Institute for Bioengineering and Bioscience, Georgia Institute of Technology

Introduction

למרות יכולת ההתחדשות המרשימה של hepatocytes 1, שהם סוג תא parenchymal העיקרי של הכבד, אי ספיקת כבד כרונית פוגעת ביכולת הזאת, מה שמובילה תאים ובתאים בכבדים (HPC) התחדשות תלויה 2.

נזק כבד כרונית נגזרת בעיקר שימוש לרעה באלכוהול, וירוס הפטיטיס C כרונית (HCV) 3 ו מחלת כבד שומני לא אלכוהולי (NAFLD) 4. זה מוביל פיברוזיס כבד מתמשך, אשר מזוהה עם ההצטברות של תאי מטריקס חלבונים (ECM). מתמיד הצטברות ECM מעווה אדריכלות כבדה ללא פגעה על ידי יצירת רקמת צלקתית סיבית 5, לאחר מכן וכתוצאה מכך שחם עם תחלואה ותמותה גבוהות. ניסיונות רבים נעשו כדי למתן את התגובה fibrotic בעיקר על ידי התמקדות מעכב ציטוקינים profibrogenic והופעל myofibroblasts 6. האחרון נגזר בעיקר מתאי stellate כבדים (Hגיל), התאים הלא parenchymal הכבד עקרון אחראי צלקת בכבד היווצרות 4. אף על פי כן, טיפולי משובי מעודדי מקורות הסלולר אנדוגני כולל HPCs להתחדש hepatocytes בנוכחות עלבונות fibrogenic מתמשכים מחכים לחקירה נוספת.

דגמים ניסיוניים רבים סיסטיק הכבד תוארו ביונקים. הזרקה חוזרת ונשנית של פחמן טטרא (CCL 4) כבר בשימוש נרחב כדי לגרום פיברוזיס כבד מודלים בעכברים וחולדה 7. בשילוב עם תזונה עתירת שומן (HF), אלכוהול הובילה upregulation משמעותית של ביטוי גנים profibrogenic ואת הכבד סיסטיק 8. בעוד steatosis (הצטברות שומנים בדם) הנובעת מחשיפת אלכוהול חריפה, זה הופך את הכבד רגיש פציעה בכבד חמורה יותר 9.

דג הזברה, Danio rerio, התפתחה כמערכת מודל חוליות יסולא בפז ללימוד התחדשות. למרותחוליות אחרות תחתונות כגון סלמנדרות ויש axolotls יכולת מרשימה לרגנרציה הדג הזברה יש יתרונות על פני מערכות מודל אחרות לגבי אסטרטגיות מניפולציה וויזואליזציה גנים הדרושים לביצוע מניפולצית משובי פוטנציאל גורמי 10. דג הזברה גם מייצג מודל חוליות אטרקטיבי ללימוד מחלת כבד אלכוהולית (ALD) פשוט על ידי הוספת אתנול (EtOH) למים שלהם. חשיפה אקוטית EtOH כדי דג הזברה הזחל והבוגר שנגרם steatosis בכבד 11-13. כאשר דג זברה מבוגר זכתה לחשיפת EtOH מורחבת, בתצהיר קולגן נצפה עם גברת ביטוי של גנים הקשורים סיסטיק 14. עם זאת, קיים צורך בפיתוח מודלים ללמוד התחדשות כבדה בתגובת EtOH כגירוי fibrogenic.

לאחרונה, פיתחנו מודל הכבד fibrotic הנגרמת EtOH דג הזברה 15. שילבנו מערכת אבלציה הגנטי הספציפי hepatocyte עם טיפול EtOH ב הזחל adulדג הזברה t. יצרנו שני קווים מהונדסים, Tg (fabp10a: CFP-NTR) Gt1 ו Tg (fabp10a: mCherry-NTR) GT2, שבו nitroreductase E.coli (NTR) הם התמזגו ציאן חלבון פלואורסצנטי mCherry, בהתאמה, בשליטה של חומצת השומן ספציפי hepatocyte מחייבת 10a חלבון, אמרגן בסיסי כבד (fabp10a). במערכת זו, NTR ממירה metronidazole prodrug רעילה (MTZ) לתוך סוכן ה- DNA בין-גדיל מקשרים צולב 16, גרימת מוות מפורש של hepatocytes. באמצעות מודל זה, הראינו כי אוכלוסייה של תאים כבדים, אשר מגיבים Notch signaling, מומר hepatocytes בהעדר ליד של hepatocytes וב העודף ECM. אנחנו המיועד תאים אלה HPCs. יתר על כן, באמצעות מסכים כימיים, זיהינו activators מולקולה הקטן של איתות Wnt ומעכבים של איתות Notch שמרחיב התחדשות hepatocyte בכבד fibrotic. Therefoמחדש, המודל הכבד fibrotic שלנו דג הזברה מייצג מערכת סינון הכימי מעולה בהשוואה לתא ביותר בתרבות או מערכת סינון מבוסס יונקים. זוהי מערכה in vivo עם עלות משמעותית והטבות לחיסכון בזמן. כאן אנו מתארים את ההליכים המפורטים להקמת מודל כבד fibrotic נגרם EtOH ועל ביצוע מסכים כימיים באמצעות מודל זה דג זברה. יתר על כן, ניתוחי מנות הזמן בוצעו כדי לחקור כיצד hepatocyte התחדשות מתרחש בכבד fibrotic. פרוטוקול זה יספק כלי רב ערך כדי לחקור את המנגנונים ואסטרטגיות של שיפור התחדשות hepatocyte בכבד fibrotic.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

דג הזברה הועלו וגדל באמצעות פרוטוקול סטנדרטי אשר עונה על הקריטריונים של המכונים הלאומיים לבריאות ואושר על ידי המכון הטכנולוגי של ג'ורג'יה מוסדיים טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש.

1. הכנת פתרונות

  1. הכן מים ביצה 20 L (לסירוגין בשימוש עם "בינוני העובר ') כדי לשמור על דג הזברה הזחל / עובריים. ממיסים 1.5 גרם קאסו 4 ו -6 גרם מלח ים האוקיינוס ​​מיידית ב -250 מ"ל מים מזוקקים. יוצק לתוך קרונית מלאה 20 מי L מזוקק להתסיס.
  2. כן 1 L 1-פניל-2-thiourea (PTU) פתרון מניות (20x). ממיסים אבקת PTU 0.6 גרם ב 1 מים מזוקקים L. הוסף 1 מ"ל של פתרון המניות לכל בינוני 20 מ"ל העובר לריכוז סופי של 0.003% כפתרון העבודה.
    זהירות: PTU עלול לגרום לרעילות מערכתית הבאים משאיפת או חשיפה עורי. להכין ולהשתמש בהתאם להנחיות טיפול מתאימות.
  3. כן 1 L אתיל 3-aminobemethanesulfonate nzoate (Tricaine) פתרון המניות (20x). ממיסים אבקת 4 גרם Tricaine במים מזוקקים. התאם ל- pH 7 על ידי הוספת 1 M טריס חיץ (pH 9), ולהביא את נפח הסופי עד 1 ליטר עם מים מזוקקים. Aliquot לתוך 50 מ"ל ולאחסן ב -20 ° C. להפשיר לפני השימוש.
    זהירות: Tricaine יכול לגרום לאובדן תחושה. להכין ולהשתמש בהתאם להנחיות טיפול מתאימות.
  4. כן 100 metronidazole זחל מיליליטר (MTZ) פתרון עובד. הפוך 15 טרי פתרון מ"מ MTZ ידי המסת אבקת 0.25 גרם MTZ ב sulfoxide 0.1% דימתיל (DMSO) ב 100 מ"ל בינוני העובר. ממיסים אבקת MTZ לחלוטין על ידי טלטול נמרץ. בצע פתרון MTZ טרי ולהשתמש בנייר אלומיניום, כדי למנוע השפלה photocatalytic של MTZ.
    זהירות: MTZ עלול לגרום לגירוי. להכין ולהשתמש בהתאם להנחיות טיפול מתאימות.
  5. כן 100 / metronidazole אתנול זחל מיליליטר (EtOH / MTZ) פתרון עובד. בצע פתרון MTZ טרי ולהשתמש בנייר אלומיניום כדי למנוע דה photocatalyticהדרגתיות של MTZ. הוסף 1.5 מ"ל 100% אתנול לתוך 100 מ"ל פתרון MTZ לריכוז סופי של 1.5% רק לפני השימוש.
  6. כן 500 מיליליטר פתרון המבוגר MTZ עובד. הפוך 10 טרי פתרון מ"מ MTZ ידי המסת אבקת 0.83 גרם MTZ ב DMSO 0.1% ב 500 מ"ל מים המערכת. ממיסים אבקת MTZ לחלוטין על ידי טלטול נמרץ. בצע פתרון MTZ טרי ולהשתמש בנייר אלומיניום, כדי למנוע השפלה photocatalytic של MTZ.
  7. הכן חיץ 1 L PEM. ממיסים 30.2 צינורות גרם, 0.74 גרם EGTA, ו 0.12 גרם MgSO 4 במים מזוקקים. התאם ל- pH 7 עם NaOH. תביא נפח סופי עד 1 ליטר עם מים מזוקקים.

2. הכנת זחל דג הזברה

  1. הגדרת ההזדווגות של [Tg (fabp10a: CFP-NTR) Gt1; Tg (TP1: mCherry) jh11] 15,17 דג הזברה מבוגר עם Tg (hand2: EGFP) pd24 13 דג הזברה מבוגר במיכלים ההזדווגות. השתמש חוצץ לנהל הזדווגות מתוזמן.
  2. הסר את divider למחרת בבוקר ולאפשר דגים להזדווג ללא הפרעה. עובר קציר 2 hr מאוחר יותר על ידי מאמץ מי מערכת ההעברה העוברים לתוך 100 מ"מ צלחות פטרי עם מדיום עובר.
  3. לשמור על לא יותר מ -100 עוברים לכל צלחת פטרי. תחת סטראו, להסיר את הביצים מופרות באמצעות פיפטה מזכוכית. לגדול עוברים על 28 מעלות צלזיוס ומוסיפים phenylthiourea (PTU) לריכוז סופי של 0.003% לאחר 10 שעות שלאחר ההפריה (hpf) לעכב התפתחות פיגמנט.

3. אתנול, טיפול Metronidazole וכבד התחדשות ב זחל דג זברה

  1. כן פתרון EtOH טרי ידי הוספת אתנול לתוך מדיום העובר לריכוז סופי של 1.5%. אל תוסיף PTU.
  2. פנקו את העוברים עם פתרון אתנול 20 מ"ל לכל צלחת פטרי 56-80 hpf. מכסי צלחות פטרי בניילון נצמד כדי למנוע אידוי אתנול.
  3. מיין החוצה [Tg (fabp10a: CFP-NTR) Gt1; Tg (TP1: mCherry) jh11 sup>; Tg (hand2: EGFP) pd24] הזחלים עם גודל הכבד דומה, כפי שנקבע על ידי ביטוי CFP, ב 80 hpf. אין להשתמש Tricaine בעת מיון הזחלים EtOH שטופלו כי זה יגרום לשיעור תמותה גבוה עם טיפול עוקב EtOH / MTZ. שמור זחלי מיון בצפיפות של 30 עובר לכל צלחת פטרי.
  4. הכן טרי 15 מ"מ MTZ במדיום העובר ב 0.1% DMSO. להוסיף כמות נאותה של EtOH לתוך פתרון MTZ לעשות לריכוז סופי של 1.5%. דגירת זחלים ב 20 מיליליטר פתרון EtOH / MTZ לכל צלחת פטרי במשך 24 שעות ב 28 מעלות צלזיוס. מכסים צלחות פטרי בניילון נצמד לשמור על ריכוז EtOH ועם בנייר אלומיניום כדי להגן מפני אור.
  5. בסוף הטיפול, להסיר פתרון EtOH / MTZ ידי העברת זחלי מנות חדשות פטרי עם מדיום העובר טרי. לשטוף הזחלים 3 פעמים עם המדיום העובר ולשמור אותם ב 20 מ"ל בינוני העובר ללא PTU.
  6. כדי למיין את הזחלים עם אבלציה כמעט מוחלטת של hepatocytes, להתבונן קרינהתחת מיקרוסקופ epifluorescence עם מסנן CFP בהגדלה של 80x. תוצאות אבלציה מוצלחות קרינת CFP מינימאלית בכבד נפח כבד מופחת באופן משמעותי.
  7. כדי למנוע מוות של הזחלים EtOH / MTZ שטופלו, אין להשתמש Tricaine למיון. תקן את הזחלים עבור immunostaining (ראה סעיף 5) או לשמור זחלי מיון בצלחות פטרי על 28 מעלות צלזיוס למשך ניתוחים נוספים.

4. מסכים כימיים EtOH / MTZ שטופל זחל דג זברה

  1. תביאו את הצלחות 96-היטב המכיל 10 מ"מ מניות כימי DMSO (עיין רשימת חומרים לפרטים בדבר ספריות כימיים מסחריים) מן מקפיא -80 מעלות צלזיוס. מכסים ברדיד אלומיניום כדי למנוע השפלה photocatalytic של כימיקלים. להפשיר את פתרונות המניות ב RT עם נדנדה עדינה.
  2. הכן פתרונות כימיים על ידי דילול 10 פתרונות מ"מ מניות עם מדיום העובר לריכוז סופי של 50 מיקרומטר (ב 96 צלחות גם: שניות ראשוניותקרין; ב 1.5 מ"ל צינורות: retesting). זחלים שליטים טופלו ריכוזים שווים של DMSO במדיום עובר.
  3. הזחלים העברה עם אבלציה hepatocyte כמעט מלא, אשר טופלו 1.5% EtOH / 15 מ"מ MTZ וממוינת כאמור, על כל אחת 96-היטב (מסך הראשונית) או 24 גם (retesting) צלחות prefilled עם המדיום העובר בצפיפות של 5 זחלים לכל טוב. להשתמש בבארות כפולות לכל כימיקל.
  4. הסר בינוני העובר ולהוסיף או 250 μl (96-גם הצלחות) או 500 μl (24 גם צלחות) תמיסות כימיות היטב כל אחד. אטמים ברדיד אלומיניום ולטפל זחלים במשך 50 שעות ב 28 מעלות צלזיוס. בדוק זחלים השריית-כימיים יומי וסר זחלים מתים מבארות פרט.
  5. בסוף הטיפול הכימי, להתבונן במספר ו / או עוצמת CFP להביע hepatocytes תחת מיקרוסקופ epifluorescence עם מסנן CFP בהגדלה של 80x. תמונה בה נראה זחלי חיים משופרים או להפחיתד מספר ו / או עוצמת hepatocytes להביע CFP עם מצלמה דיגיטלית רשומות.
  6. שמור על הזחלים ידי קיבוע פורמלדהיד הדמיה confocal כמתואר בסעיף 5.
  7. כדי לבדוק שוב את הכימיקלים המאפשרים התחדשות hepatocyte במסך הראשוני, לבחון את כוחם בריכוזים גבוהים או נמוכים יותר כדי למצוא את הריכוז היעיל ביותר עם ההליכים המתוארים 4.1-4.5 ( 'retesting').

5. קיבוע דג הזברה הזחל, Immunostaining, והדמיה Confocal

  1. להרדים זחלים ידי הוספת Tricaine לריכוז סופי של 0.02%. העבר 10-15 זחלים אל צינור 1.5 מ"ל ולשטוף פעם עם פוספט שנאגר מלוח (PBS). הסר PBS ולהוסיף 1 מ"ל של פורמלדהיד מוכן טרי 2% במאגר PEM לתקן O / N ב 4 ° C.
    זהירות: פורמלדהיד גורמת לגירוי ידוע כמסרטן אנושי. טפל במנדף כימי.
  2. בטל תיקון פתרון כראוי ואז ווהsh 3 פעמים עם PBS ב RT. זחלים קבועים יכולים להישמר PBS ב 4 ° C עד כמה ימים. שאמשיך לשלב הבא מייד נותן תוצאות immunostaining טובות יותר.
  3. מוציא בזהירות חלמון עור המכסה את האזור הכבד באמצעות מלקחיים 55 # תחת סטראו.
  4. Permeabilize וזחלים לחסום חיץ בלוק (אלבומין בסרום שור 4% ו -0.3% Triton X-100 ב PBS) O / N ב 4 ° C.
  5. דגירה עם נוגדן אנטי קולגן אני ארנב בדילול של 1: 100 ב O חיץ בלוק / N ב 4 ° C.. לשטוף 5 פעמים במשך 15 דקות כל אחד עם חיץ לשטוף (0.3% Triton X-100 ב PBS).
  6. דגירה עם AlexaFluor 647 נוגדן נגד ארנב החמור מצומדות בדילול של 1: 200 ב O חיץ בלוק / N ב 4 ° C.. לשטוף 5 פעמים במשך 15 דקות כל אחד עם חיץ לשטוף. לאחר מכן לשטוף פעם אחת עם PBS.
  7. בעדינות להעביר זחלי שקופיות זכוכית באמצעות פיפטה מזכוכית, וזחלים קבועים אוריינט עם הצד לרוחב השמאל פונה כלפי מעלה. הסרת עודפי Kimwipes באמצעות PBS. הוסף ירידה של תקשורת הרכבה, וזכוכית כיסוי חותמת עם לק. הדמית confocal ניצוח מייד מומלצת מאוד.
  8. השתמש במערכת confocal מצוידת בעדשת שמן 40X / 1.3 ללכוד תמונות. השתמש כוח לייזר 20-50%. צלמו תמונות מחסנית Z ב 1 מיקרומטר במרווחים.

6. הכנת דג זברה למבוגרת

  1. הגדרת ההזדווגות של [Tg (fabp10a: CFP-NTR) Gt1; Tg (TP1: mCherry) jh11] 15,17 דג הזברה מבוגר במיכלים ההזדווגות. הקציר עובר למחרת בבוקר על ידי מאמץ מי מערכת ההעברה העוברים לתוך 100 מ"מ צלחות פטרי עם מדיום עובר.
  2. לשמור על לא יותר מ -100 עוברים לכל צלחת פטרי. תחת סטראו, להסיר את הביצים מופרות באמצעות פיפטה מזכוכית. לגדול עוברים על 28 מעלות צלזיוס ומוסיפים PTU לריכוז סופי של 0.003% לאחר 10 hpf לעכב התפתחות פיגמנט.
  3. בשעה 4 DPF, השתמש Tricaine להרדים הזחלים ולמיין [Tg (fabp10a: CFP-NTR)Gt1; Tg (TP1: mCherry) jh11] הזחלים. יש לשטוף היטב את Tricaine על ידי שינוי מספר פעמים בינוני עובר טריים. אפשר זחלים להתאושש על 28 מעלות צלזיוס עד שהם להשיג קצב לב רגיל של 120-180 פעימות לדקה 18.
  4. תרי זחלי מיון כדי 6-12 חודשים מבוססים על ההליך הרגיל 19.

אתנול 7., Metronidazole טיפול ושיקום הכבד למבוגרים דג הזברה

  1. העבר הישן 6-12 חודשים [Tg (fabp10a: CFP-NTR) Gt1; Tg (TP1: mCherry) jh11] דג הזברה מבוגר כדי טנקים ההזדווגות באמצעות נטו. יש לשמור את הדגים בצפיפות של לא יותר מ -10 דגים לכל טנק.
  2. כן פתרון EtOH טרי ידי הוספת EtOH במי מערכת לריכוז סופי של 1%. פנקו את הדגים הבוגרים עם 500 מ"ל פתרון EtOH בכל טנק ולשמור אותם בתוך חממה C 28 °.
  3. העברת דגים בוגרים כדי פתרון EtOH טרי מדי יום, לבטל אבזר דג מתכיאות כמו Biohazard. ברציפות לטפל בבעלי חיים במשך 72 שעות לפני הטיפול MTZ.
  4. כן 10 טרי פתרון המ"מ MTZ במי מערכת של 0.1% DMSO. טרום לחמם את הפתרון MTZ C חממה 28 °. פנקו את הדג עם 500 מ"ל פתרון MTZ במיכל מעבר 1 L עבור 8 שעות ב 28 ° C, להגן מפני האור באמצעות רדיד אלומיניום.
  5. שימו לב לשעה במהלך הטיפול ולהסיר דג מת מיד. בטל דגים מתים כראוי כתוצאה Biohazard. בסוף טיפול MTZ, לשטוף את MTZ ידי העברת חיות למי מערכת טרי פעמים.
  6. אפשר חי להתאושש ולשמור אותם באינקובטור ב 28 מעלות צלזיוס. Feed ולהעביר דג למי מערכת טריים מדי יום עד לנקודת זמן מסוים עבור ניתוחים.

8. דג הזברה למבוגרים כבד קיבוע, Immunostaining, והדמיה Confocal

  1. להרדים דגים בוגרים עם 0.02% Tricaine ו להרדים במי קרח למשך 15 דקות. פאט יבש דגים על מגבת נייר ומניחים אותו על מחצלת לנתח.
  2. לחשוף איברים במערכת העיכול על ידי הסרת העור והשרירים כפי שתואר לעיל 20. השתמש במספריים לחתוך את העור ושרירים בסיסיים לאורך הבטן מן הסנפיר האנאלי אל operculum, ולאחר מכן בדיעבד לאורך הצד של הדג אל הסנפיר השת.
  3. מכניסים את הדגים בתוך שפופרת חרוטי 15 מ"ל ולשטוף פעם עם PBS. הסר PBS ולהוסיף 4 מ"ל של פורמלדהיד מוכן טרי 2% במאגר PEM לתקן O / N ב 4 ° C.
  4. בטל תיקון פתרון כראוי, לשטוף 3 פעמים עם PBS ב RT. אפשר לשמור דגימות קבועות PBS ב 4 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים. שאמשיך לשלב הבא מייד נותן תוצאות immunostaining טובות יותר.
  5. לנתח את הבטן כולה עם כבד מחלל הגוף של הדג על ידי חיתוך הוושט. שבץ איברים במערכת העיכול עם 4% נמוך ההיתוך agarose בתוך תבנית חתך.
  6. השתמש vibratome לחתוך דגימות למקטעים רוחבי ב 50 מיקרומטר במרווחים ב PBS קר כקרח, החל מסוף הקדמי. עבר שניותמשא לצלחת 6-היטב עם PBS באמצעות מברשת צבע # 1.
  7. Permeabilize וחתכים בלוק O חיץ בלוק / N ב 4 ° C.
  8. דגירה עם נוגדן אנטי קולגן אני ארנב בדילול של 1: 100 ב O חיץ בלוק / N ב 4 ° C.. לשטוף 5 פעמים, 15 דקות כל אחד עם חיץ לשטוף.
  9. דגירה עם AlexaFluor 647 נוגדן נגד ארנב החמור מצומדות בדילול של 1: 200 ב O חיץ בלוק / N ב 4 ° C.. לשטוף 5 פעמים, 15 דקות כל אחד עם חיץ לשטוף ופעם עם PBS.
  10. בעדינות להעביר חלקי שקופיות זכוכית באמצעות מברשת צבע # 1. הסר PBS העודף באמצעות Kimwipes, להוסיף טיפה של תקשורת הרכבה, ואת מכסה זכוכית חותם עם לק. הדמית confocal ניצוח מייד מומלצת מאוד.
  11. השתמש במערכת confocal מצוידת בעדשת שמן 40X / 1.3 ללכוד תמונות. השתמש כוח לייזר 20-50%. צלמו תמונות מחסנית Z ב 1 מיקרומטר במרווחים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1 מציג את התפתחות מודל הכבד fibrotic הנגרמת EtOH דג הזברה הזחל. כדי לייעל את פרוטוקול על חשיפת זחלי דג זברת EtOH, אנו מעריכים הראשון רעיל EtOH. 2.5 ימים שלאחר ההפריה (DPF) הזחלים נחשפו ריכוז 1% EtOH, 1.5%, או 2% למשך 24 שעות ואחריו טיפול EtOH במקביל 24 שעות / MTZ. חשיפת 2% EtOH נגרמת תמותה גבוהה, בעוד שכמעט כל זחלים חשופים 1% EtOH או פחות הראו שינויי fibrogenic מינימאליים עם בתצהיר נדיר של חלבונים תאים מטריקס כמו קולגן. בהתבסס על תוצאות אלו, הזחלים טופלו קודם 1.5% EtOH למשך 24 שעות (2.5-3.5 DPF) ומאז הם ראו בו זמנית עם MTZ למשך 24 שעות (3.5-4.5 DPF) (איור 1 א). EtOH / MTZ שטופלו הזחלים הראה ליקויים מורפולוגיים כולל עקמומיות כלפי מעלה של המטען והזנב, בצקת קרום הלב, ואי לנפח בשלפוחית ​​השחייה. (איור 1 ב). אָנוּהשתמש בשלושה קווים מהונדסים כדי לנתח שינויי fibrogenic ב כבד הזחל שטופל MTZ EtOH /: 1) Tg (fabp10a: CFP-NTR) קו Gt1 מבטא את גן NTR התמזג עם חלבון פלואורסצנטי ציאן תחת אמרגן fabp10a ספציפי hepatocyte 15; 2) Tg (TP1: mCherry) קו jh11 סימני תאים עם איתות Notch פעיל (תאים Notch-תגובה, NRCS) או לתאי האפיתל המרה (BECs) עם mCherry גרעיני 17, אשר הביטוי הוא בשליטת מודול TP1 המכיל RBP- מרובים JK-אתרי קישור; ו -3) Tg (hand2: EGFP) קו pd24, אשר תוויות בתאי stellate הכבד (HSCs) 13. DMSO שטופלו מלאה [Tg (fabp10a: CFP-NTR) Gt1; Tg (TP1: mCherry) jh11; Tg (hand2: EGFP) pd24 כבד] לא הראה סוג סיבי קולגן שאני בתצהיר 4,6,9 (איור 1 ג, ג '), ואילו EtOH / MTכבדים שטופל Z מוצגים סוג גבוה ואני קולגן הצטברות של 25 ו -50 שעות שלאחר-אבלציה (hPa) (האיור 1D, ד ', ה', ה '). בנוסף, לעומת כבדים מלאים שטופל DMSO (איור 1 ג ''), HSCs גדל מספר עם המורפולוגיה השונה מתצורת כוכב דמוי לצורת myofibroblast הדמוי עם תהליכי cytoplasmic לאיבוד כבד EtOH / MTZ שטופל ההתחדשות ( 1D איור '', אי ''). צפינו שתי אוכלוסיות נפרדות של mCherry לבטא NRCS ב 25 hPa ב כבדי התחדשות שטופלו MTZ EtOH /: עמום NRCS אדום (איור 1D '' ', הבלעה, חצים לבנים) ו NRCS אדום בוהק (איור 1D' '', הבלעה , ראשי חץ צהוב). בגיל 50 hPa, hepatocyte ספציפי CFP החלו לשתף מפורשת NRCS עם ביטוי mCherry עמום ברחבי כבדי התחדשות (איור 1E '' ', הבלעה, חצים לבנים). CFP אלה mCherry-coexpre עמוםNRCS ssing הם כנראה להבחין בין NRCS אדום בוהק כי הם שליליים עבור CFP (איור 1E '' ', הבלעה, ראשי חץ צהוב). מחקרים קודמים הראו כי כאשר התפשטות hepatocyte דוכאה לאחר כריתה חלקית (PHX), HPCs מורחבת עם התפשטות קשורה של HSCs 21. בנוסף, HPCs ואת BECs משותף סמנים histochemical 22. לפיכך, התוצאות שלנו מצביעות על כך NRCS להביע שיתוף mCherry CFP ואפלולי מתארים עמיתו-דג הזברה של HPCs כי להתמיין hepatocytes ידי נתקלים downregulation Notch. NRCS שמירה על רמות גבוהות יותר של איתות Notch עשוי להישאר cholangiocytes, שכבר מוינו BECs 23.

איור 2 מציג את התפתחות המודל כבד fibrotic נגרם EtOH ב דג זברה מבוגרת. ראשית, חשפנו דג הזברה מבוגר ל -1%, 1.5%, או 2% EtOH להעריך כדאיות. רוב דג הזברה המבוגרת עשתה not לשרוד יותר מ -72 שעות של חשיפה לריכוזים EtOH גדול מ -1% (נתונים שלא פורסמו). לכן, עבור דג הזברה מבוגר, אנו pretreated הדג עם 1% EtOH במשך 72 שעות ו אחריו עם טיפול MTZ (איור 2 א). על ידי ביצוע זמן כמובן מנתח, הראינו סוג גבוה משמעותי ואני קולגן בתצהיר של כבדי התחדשות EtOH / MTZ שטופל ב 2, 3, ו -4 ימים-שלאחר אבלציה (DPA) (איור 2 ג ', ד', ה ') לעומת כבדי שטופלו DMSO (תרשים 2B '). דומה לזה שנצפה הזחלים, את CFP ואפלולי mCherry לבטא שיתוף תאים אותרו כבדי EtOH / MTZ שטופלו התחדשות של 12 חודשים הישן [Tg (fabp10a: CFP-NTR) Gt1; Tg (TP1: mCherry) jh11] דגים בוגרים ב DPA 3 ו -4 (איור 2, E, שיבוצים, חצים לבנים). נתונים אלו מעידים כי HPCs, מגיב Notch signaling, לשימור היכולת שלהם להתחדש כמו hepatocytes בבנוכחות עלבון fibrogenic ב דג הזברה מבוגר.

איור 3 מציג את תוצאות ההקרנה כימיים נציג באמצעות מודל הכבד fibrotic אתנול-induced שלנו דג הזברה הזחל. כדי לאתר תרכובות ביו המסייעים בהאצת התחדשות hepatocyte בכבד fibrotic, ביצענו מסכי גנטי כימיים. אנו הוקרננו ספרייה של 75 מולקולות קטנות עם פעילויות ביולוגיות ותרופות היטב מאופיינות (לתאי גזע איתות הספרייה מורכבת, Selleckchem) וספרייה של 1,000 מולקולות קטנות פחות מאופיין (ActiProbe-1K ספרייה, TimTec) באמצעות [Tg (fabp10a: CFP -NTR) Gt1; Tg (TP1: mCherry) jh11] הזחלים. אנחנו ablated את hepatocytes בנוכחות 1.5% EtOH / 15 מ"מ MTZ ולאחר מכן נחשף הזחלים 50 מיקרומטר של תרכובות עבור 50 שעות (איור 3 א). מספר אגוניסטים Wnt כגון SB 415,286 ו CHIR-99021, מעכבי קינאז-3 synthase גליקוגן, התחדשות hepatocyte קידם (איור 3 ג, ד) לעומת DMSO (איור 3 ב). יתר על כן, [4- (1H-1,2,3,4-tetraazol-5-י.ל.) -1,2,5-oxadiazole-3-ylamine], ובקיצור HTOA, היא מפעילה מסלול הרומן Wnt, משופרת התחדשות hepatocyte ב הכבד fibrotic כפי שצוין על ידי הכבד מחדש גדול (איור 3E). נתונים אלה מראים כי מודל fibrotic המתמשך שלנו מספק כלי רב ערך כדי לגלות מולקולות קטנות המשפרות התחדשות hepatocyte.

איור 1
איור 1. פיתוח מודל כבד fibrotic הנגרמת אתנול דג זברת זחל. (א) תכנית הממחישה את התקופות של EtOH ו EtOH / MTZ טיפול ע"מ להקים מודל כבד fibrotic זחלים. (ב) בשעה 50 שעות-פוסט-אבלציה (hPa), EtOH / MTZ שטופלו lדג הזברה Arval פיתחו הפרעות מורפולוגיים כולל עקמומיות כלפי מעלה של המטען והזנב, בצקת קרום הלב, ואי לנפח בשלפוחית ​​השחייה. (CC '' ') ב כבד [Tg (fabp10a: CFP-NTR) Gt1; Tg (TP1: mCherry) jh11; Tg (hand2: EGFP) pd24] הזחלים שטופלו DMSO, 1a קולגן חלבון ECM היה כמעט בלתי ניתן לגילוי (C, C ') ו HSCs שקט הראו בתצורת כוכב דמוי (ג' '), ואילו NRCS מופץ בקרב hepatocytes (C, C '' ', הבלעה). (DE '' ') ב כבדי זחלי EtOH / MTZ שטופל, בתצהיר 1a קולגן גבוה נצפה (ד, ד', ה ', ה'). HSCs גדל מספר ואיבד תהליכים cytoplasmic מורכבים (ד '', ה ''). בגיל 25 hPa, mCherry לבטא NRCS מורכב משתי אוכלוסיות נפרדות . ראשי חץ צהוב עולה NRCS אדום בוהק (ד '' ', הבלעה), ואילו חצים לבנים מצביעים NRCS אדום עמום (ד' '', הבלעה). בגיל 50 hPa, Tg (fabp10a: CFP-NTR) ו Tg (TP1: mCherry) תאים להביע שיתוף נכתבו המתעוררים ברחבי כבדי התחדשות (E '' ', הבלעה, חצים לבנים), בעוד NRCS אדום בוהק לא היה ביטוי CFP (E '' ', הבלעה, ראשי חץ צהוב). כל תמונות confocal הן תמונות מטוס בודדות למעט C '', ד '', ה '', שהן תמונות הקרנה. ברי סולם: B, 100 מיקרומטר; CE '' ', 20 מיקרומטר. EtOH, אתנול; MTZ, metronidazole; hPa, שעות-פוסט-אבלציה; DPF, ימים-לאחר הפריה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

her.within-page = "1"> איור 2
איור 2. פיתוח מודל כבד fibrotic הנגרמת אתנול דג זברה מבוגרת. (א) תכנית הממחישה את התקופות של טיפול EtOH ו MTZ ע"מ להקים מודל כבד fibrotic למבוגרים. (BE ') Tg (fabp10a: CFP-NTR), Tg (TP1: mCherry), והביטוי 1a הקולגן vibratome קטעי DMSO- (B ו- B') ו EtOH / MTZ שטופלו (CE ') מבוגר כבדי דג הזברה. (BB ') ב הבקרות שטופלו DMSO, 1a קולגן היה כמעט בלתי ניתן לגילוי (ב') ללא Tg (fabp10a: CFP-NTR) ו Tg (TP1: mCherry) התאים המבטאים-שיתוף (B). (CE ') ב כבדי התחדשות שטופלו MTZ EtOH /, בתצהיר 1a קולגן היה גבוה במידה ניכרת ב 2, 3, ו -4 DPA (ג', ד ', ה') עםאוכלוסיית Tg (fabp10a: CFP-NTR) ו Tg (TP1: mCherry) התאים המבטאים-שיתוף ב DPA 3 ו -4 (D, E, שיבוצים, חצים לבנים). NRCS האדום הבוהק לא היה ביטוי CFP (D, E, שיבוצים, ראשי חץ צהובים). BE, תמונות מטוס בודדות confocal. B'-E ', תמונות הקרנת confocal. סרגל קנה מידה, 20 מיקרומטר. EtOH, אתנול; MTZ, metronidazole; DPA, ימים-שלאחר אבלציה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. תוצאות נציג ההקרנה כימי תוך שימוש במודל הכבד fibrotic הנגרמת אתנול דג הזברה הזחל. (א) תוכנית עבור המסך התחדשות hepatocyte בכבד fibrotic. (BE) ידוע Wnt רומןactivators להגדיל התחדשות hepatocyte בכבד fibrotic. תחזיות Confocal של כבדי שטופלו MTZ EtOH / ב [Tg (fabp10a: CFP-NTR) Gt1; Tg (TP1: mCherry) jh11] הזחלים כי נוהלו עם DMSO (B), SB415286 (C), CHIR-99,021 ( D), או מפעיל Wnt רומן [4- (1H-1,2,3,4-tetraazol-5-י.ל.) -1,2,5-oxadiazole-3-ylamine] (מקוצר כמו HTOA) (E). SB415286 ו CHIR-99,021 הם הגליקוגן מעכבי קינאז-3 synthase. כל התמונות הן תמונות הקרנת confocal. סרגל קנה מידה, 20 מיקרומטר. EtOH, אתנול; MTZ, metronidazole; hPa, שעות-פוסט-אבלציה; DPF, ימים-לאחר הפריה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

צפינו התחדשות hepatocyte בתיווך HPC ב EtOH / MTZ שטופלו כבדי מחלים, דבר המצביע על כך אפילו בנוכחות של כמות משמעותית של חלבונים ECM כולל סוג סיבי לי קולגן, HPCs לשמור וכשירותו להתחדש כמו hepatocytes. הטיפול בלבד MTZ לא להגדיל בתצהיר של חלבוני ECM משמעותי, ואילו הטיפול רק EtOH לא לגרום HPC הפעלת 15. על ידי ניצול של טיפול EtOH / MTZ בשילוב, הצלחנו לחקור התחדשות HPC מונחה בכבד fibrotic. כמו חיסול כמעט מוחלט של hepatocyte מעורר התחדשות hepatocyte מונחה HPC, חשוב לברר זחלי MTZ שטופל על פי הקריטריונים של היעדרות של קרינה ספציפי hepatocyte ונפח כבד קטינה באופן משמעותי על ידי NRCS אשכולות. בדגים, כלי הדם של הזימים העור לספוג את האלכוהול 24, כך שאין צורך לאפשר חיות לשתות כרצונך או לדרוש intragaעירוי stric כמו במודלים יונקים. אנחנו שוכנו EtOH- ו MTZ שטופלו מבוגר דגים שלאחר מכן במיכלים נפרדים ללא במחזור המים. זה חיוני כדי להעביר דגי פתרון EtOH טרי מדי יום ולשמור את המכסה על מנת למזער את ההתאדות של EtOH. למרות 48-72 שעות EtOH / MTZ טיפול יעיל גורם סינתזת החלבון ECM בפרוטוקולים שלנו, לא סיסטיק ולא שחמת מתקדמת פותחה בדגים אלה. לכן, השילוב של MTZ עם חשיפה ממושכת של אתנול כגון 12 שבועות טיפול 14, במיוחד דגים בוגרים, עלול לגרום נזק כבד חמורה יותר כדי לדמות כראוי ולחקור התחדשות HPC מונחה בכישלון כבד כרונית.

דג זברה משמשת במודל חיה יוצא דופן עבור in vivo בדיקות מתחם בשל גודלו הקטן, צאצאים גדולים, שקיפות, וחדירות למולקולות קטנות 25. שימוש במודל הכבד fibrotic דג זברה, זיהינו מספר acti Wnt הידוע רומןvators ומעכבי Notch שהאיצו התחדשות hepatocyte 15. פרוטוקול הסינון כימי הקרינה המבוססת הנוכחי שלנו מורכב מכמה שלבים המבוצעים באופן ידני כולל הכנה של חומרים כימיים, העברת זחלי EtOH שטופל / ablated-hepatocyte כדי 24 גם צלחות, בטיפול כימיקלים, וניתוח ההשפעות של כימיקלים על התחדשות hepatocyte. זה דווקא מעסיק epifluorescence ו / או מיקרוסקופ confocal ללכוד תמונות עבור בעלי חי פרט, שהוא מייגע זמן רב. פלטפורמות תפוקה גבוהה באופן אוטומטי להתמודד ולרכוש הדמיה הסלולר ברזולוציה של דג זברה בשילוב עם איסוף נתונים כמותיים יקל תתחזקנה הקרנה בקנה מידה גדולה 26,27 תכונות אלה תלמדנה אם בשילוב עם מערכת מינון תרופה אוטומטית שמקובעת את טווח ריכוזים כימיים 28, אשר יכול לתת רעילות מינימלית עם יעילות מקסימלית עבור שיפור התחדשות hepatocyte. למרות אלה limitaמשא, כמו הרבה שחקנים קריטיים סוגי התא עיקריים של הכבד שמורה בין דג הזברה ויונק 29, העסקת in vivo מבוסס מולקולה קטנה הקרנה באמצעות המודל הכבד fibrotic דג הזברה יהיה לזרז גילוי תקף של אסטרטגיות טיפוליות חדשניות למחלות כבדות כרוניות.

שתי קבוצות נוספות באופן עצמאי הוכיחו כי לאחר אובדן כמעט מוחלט של hepatocytes בלי עלבונות fibrogenic, BECs transdifferentiated לתוך hepatocyte באמצעות צעד של dedifferentiation 30,31 עם ההנחה כי cholangiocytes, BECs הבדיל באופן מלא, בעיקר מהווים NRCS / BECs דג הזברה. למרות transdifferentiation יכול להיות אחד המנגנונים של נהיגה התחדשות hepatocyte, התוצאות שלנו מצביעות על כך HPCs, אשר ידועים מהווים את הרוב של BECs בכבד דג הזברה 32, downregulate פעילות Notch להתמיין hepatocytes. בינתיים, סביר לשער כי הדואר מלא BECs הבדיל, cholangiocytes, לשמור על רמות גבוהות יותר של פעילות Notch ללא המרה hepatocytes במהלך רגנרציה. מעניין לציין, שיש בנוכחות EtOH, כפי שדווח בעבר 13, מצאנו כי HSCs גדל מספר עם מורפולוגיה שונה מתצורת כוכב דמוי לצורה myofibroblast דמוי עם תהליכים cytoplasmic לאיבוד. HSCs מופעל מאופיין סינתזה של חלבוני ECM הם הגורם העיקרון אחראי ריפוי פצע נורמלי בתהליך המשולב של כבד תיקון 4. למרות פציעה כרונית לעתים קרובות עוקפת את יכולת מרשימה של הכבד לרגנרציה המושתלים HPCs בהצלחה אוכלס מחדש בכבד חולדה fibrotic / שחמת 33. לפיכך, המודל הכבד fibrotic דג הזברה שלנו יהיה כלי חיוני עבור הבהרת המנגנונים המולקולריים ו הסלולר אשר מתווכים את ההשפעות של סיסטיק מתמשכת על התחדשות hepatocyte בתיווך HPC. יתר על כן, הגדרת ג רב התאיrosstalk שמאזנת התחדשות סיסטיק על ידי ניצול המודל הכבד fibrotic דג הזברה שלנו תקל עוד יותר לעצב אסטרטגיות טיפוליות מעשיות עבור אי ספיקת כבד כרונית in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי תרומות של GTEC (2731336 ו 1411318), ה- NIH (K01DK081351), ואת NSF (1,354,837) כדי CHS אנו מודים Alem גיורגיס לקריאה ביקורתית של כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Calcium sulfate hemihydrate (CaSO4) Acros AC385355000
Magnesium sulfate (MgSO4) EMD MX0075
1,4-Piperazinediethanesulfonic acid (PIPES) Sigma-Aldrich P6757
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-
N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)		 Sigma-Aldrich E3889
Ethanol Sigma-Aldrich E7023 200 proof
Formaldehyde Fisher Scientific F79-500
Metronidazole (MTZ) Sigma-Aldrich M3761
1-phenyl-2-thiourea (PTU) Sigma-Aldrich P7629
3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040
Phosphate-buffered saline (PBS) tablet Amresco E404 Dissolve one tablet with 100 ml distilled water
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2438
Bovine serum albumin Fisher Scientific BP1600
Triton X-100 Fisher Scientific BP151
Low-melting agarose  Amresco BP165
Stem Cell Signaling Compound Library Selleck Chemicals L2100 10 mM stock in DMSO
ActiProbe-1K Library Timtec ActiProbe-1K 10 mM stock in DMSO
SB 415286 Selleck Chemicals S2729 Dissolve with DMSO to 10 mM
CHIR-99021 Selleck Chemicals S2924 Dissolve with DMSO to 10 mM
Anti-Collagen I antibody Abcam ab23730 Use at 1:100 for immunostaining, reacts with fish
AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Molecular Probes A31573 Use at 1:200 for immunostaining
Mounting media (Vectorshield) Vector Laboratories H-1400
100 mm Petri dish VWR 25384-088
24-well plate VWR 10062-896
Forceps Fine Science Tools 11255-20 Dumont #55
Glass slide VWR 48312-003 75x25 mm
Cover glass VWR 48366-045 18 mm
Plastic wrap Fisher Scientific 22305654
Aluminum foil Fisher Scientific 1213100
Kimwipes Kimberly-Clark 34155
Vibrotome Leica VT1000 S
Stereo microscope Leica M80
Epifluoresence microscope Leica M205 FA
Confocol microscope Zeiss LSM700

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Michalopoulos, G. K. Liver regeneration. J Cell Physiol. 213 (2), 286-300 (2007).
  2. Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. Stem cells and liver regeneration. Gastroenterology. 137 (2), 466-481 (2009).
  3. Shepard, C. W., Finelli, L., Alter, M. J. Global epidemiology of hepatitis C virus infection. Lancet Infect Dis. 5 (9), 558-567 (2005).
  4. Hernandez-Gea, V., Friedman, S. L. Pathogenesis of liver fibrosis. Annu Rev Pathol. 6, 425-456 (2011).
  5. Bataller, R., Brenner, D. A. Liver fibrosis. J Clin Invest. 115 (2), 209-218 (2005).
  6. Kisseleva, T., Brenner, D. A. Anti-fibrogenic strategies and the regression of fibrosis. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 25 (2), 305-317 (2011).
  7. Constandinou, C., Henderson, N., Iredale, J. P. Modeling liver fibrosis in rodents. Methods Mol Med. 117, 237-250 (2005).
  8. Gabele, E., et al. A new model of interactive effects of alcohol and high-fat diet on hepatic fibrosis. Alcohol Clin Exp Res. 35 (7), 1361-1367 (2011).
  9. Lieber, C. S. Alcoholic fatty liver: its pathogenesis and mechanism of progression to inflammation and fibrosis. Alcohol. 34 (1), 9-19 (2004).
  10. Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nat Rev Genet. 11 (10), 710-722 (2010).
  11. Jang, Z. H., et al. Metabolic profiling of an alcoholic fatty liver in zebrafish (Danio rerio). Mol Biosyst. 8 (7), 2001-2009 (2012).
  12. Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).
  13. Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. 56 (5), 1958-1970 (2012).
  14. Lin, J. N., et al. Development of an animal model for alcoholic liver disease in zebrafish. Zebrafish. 12 (4), 271-280 (2015).
  15. Huang, M., et al. Antagonistic interaction between Wnt and Notch activity modulates the regenerative capacity of a zebrafish fibrotic liver model. Hepatology. 60 (5), 1753-1766 (2014).
  16. Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3 (6), 948-954 (2008).
  17. Parsons, M. J., et al. Notch-responsive cells initiate the secondary transition in larval zebrafish pancreas. Mech Dev. 126 (10), 898-912 (2009).
  18. Baker, K., Warren, K. S., Yellen, G., Fishman, M. C. Defective 'pacemaker' current (Ih) in a zebrafish mutant with a slow heart rate. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (9), 4554-4559 (1997).
  19. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196 (2012).
  20. Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp. (37), (2010).
  21. Paku, S., Schnur, J., Nagy, P., Thorgeirsson, S. S. Origin and structural evolution of the early proliferating oval cells in rat liver. Am J Pathol. 158 (4), 1313-1323 (2001).
  22. Turner, R., et al. Human hepatic stem cell and maturational liver lineage biology. Hepatology. 53 (3), 1035-1045 (2011).
  23. Kodama, Y., Hijikata, M., Kageyama, R., Shimotohno, K., Chiba, T. The role of notch signaling in the development of intrahepatic bile ducts. Gastroenterology. 127 (6), 1775-1786 (2004).
  24. Ryback, R., Percarpio, B., Vitale, J. Equilibration and metabolism of ethanol in the goldfish. Nature. 222 (5198), 1068-1070 (1969).
  25. Mathias, J. R., Saxena, M. T., Mumm, J. S. Advances in zebrafish chemical screening technologies. Future Med Chem. 4 (14), 1811-1822 (2012).
  26. Chen, C. H., Durand, E., Wang, J., Zon, L. I., Poss, K. D. zebraflash transgenic lines for in vivo bioluminescence imaging of stem cells and regeneration in adult zebrafish. Development. 140 (24), 4988-4997 (2013).
  27. Westhoff, J. H., et al. Development of an automated imaging pipeline for the analysis of the zebrafish larval kidney. PLoS One. 8 (12), e82137 (2013).
  28. Perlman, Z. E., et al. Multidimensional drug profiling by automated microscopy. Science. 306 (5699), 1194-1198 (2004).
  29. Chu, J., Sadler, K. C. New school in liver development: lessons from zebrafish. Hepatology. 50 (5), 1656-1663 (2009).
  30. Choi, T. Y., Ninov, N., Stainier, D. Y., Shin, D. Extensive conversion of hepatic biliary epithelial cells to hepatocytes after near total loss of hepatocytes in zebrafish. Gastroenterology. 146 (3), 776-788 (2014).
  31. He, J., Lu, H., Zou, Q., Luo, L. Regeneration of liver after extreme hepatocyte loss occurs mainly via biliary transdifferentiation in zebrafish. Gastroenterology. 146 (3), 789-800 (2014).
  32. Yao, Y., et al. Fine structure, enzyme histochemistry, and immunohistochemistry of liver in zebrafish. Anat Rec (Hoboken). 295 (4), 567-576 (2012).
  33. Yovchev, M. I., Xue, Y., Shafritz, D. A., Locker, J., Oertel, M. Repopulation of the fibrotic/cirrhotic rat liver by transplanted hepatic stem/progenitor cells and mature hepatocytes. Hepatology. 59 (1), 284-295 (2014).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 111 פיברוזיס בכבד דג זברה התחדשות כבדה תאים ובתאים בכבדים nitroreductase metronidazole תא stellate כבד הקרנה כימית
פיתוח מודל כבד אתנול-induced fibrotic דג הזברה ללמוד ובתאים בתיווך תא התחדשות Hepatocyte
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huang, M., Xu, J., Shin, C. H.… More

Huang, M., Xu, J., Shin, C. H. Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration. J. Vis. Exp. (111), e54002, doi:10.3791/54002 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter