Introduction
Ondanks de opmerkelijke regeneratiecapaciteit van hepatocyten 1, waarin de belangrijkste parenchymale cel type de lever, chronisch leverfalen belemmert dit vermogen, wat leidt tot hepatische progenitor cellen (HPC) -afhankelijke regeneratie 2.
Chronische leverschade is voornamelijk afkomstig van alcoholmisbruik, chronische hepatitis C virus (HCV) 3 en niet-alcoholische fatty leverziekte (NAFLD) 4. Het leidt tot aanhoudende leverfibrose, die wordt geassocieerd met de accumulatie van extracellulaire matrix (ECM) proteïnen. Aanhoudende ECM accumulatie vervalsen intact hepatische architectuur door vorming van een fibreus littekenweefsel 5 vervolgens resulteert in cirrose met hoge morbiditeit en mortaliteit. Vele pogingen zijn gedaan om de fibrotische respons voornamelijk te beperken door te focussen op profibrogene cytokinen remmen en geactiveerde myofibroblasten 6. Dit laatste is voornamelijk afkomstig van leverstellaatcellen (HSC's), het beginsel lever non-parenchymale cellen die verantwoordelijk zijn voor littekenvorming lever 4. Niettemin regeneratieve therapieën die endogene cellulaire bronnen zoals HPC hepatocyten in aanwezigheid van aanhoudende fibrogenen beledigingen regenereren stimuleren wachten verder onderzoek.
Vele experimentele modellen van leverfibrose beschreven in zoogdieren. Herhaalde injectie van koolstoftetrachloride (CCl4) wordt veel gebruikt om leverfibrose induceren in muis en ratmodellen 7. In combinatie met een hoog vetgehalte (HF) dieet, alcohol leidde tot een aanzienlijke opwaartse regulatie van genexpressie en profibrogene leverfibrose 8. Terwijl steatose (lipide-accumulatie) het gevolg is van acute blootstelling aan alcohol, het maakt de lever gevoelig voor een ernstigere leveraandoening 9.
De zebravis, Danio rerio, heeft ontpopt als een waardevolle gewervelde modelsysteem voor het bestuderen van de regeneratie. hoewelandere lagere gewervelde dieren zoals watersalamanders en axolotls een opmerkelijk vermogen tot regeneratie, de zebravis biedt voordelen boven andere modelsystemen met betrekking tot de genetische manipulatie en visualisatie strategieën worden vastgesteld om potentiële regeneratieve manipuleren factoren 10. De zebravis vertegenwoordigt ook een aantrekkelijk gewervelde model voor het bestuderen van alcoholische leverziekte (ALD) door simpelweg het toevoegen van ethanol (EtOH) om hun water. Acute EtOH blootstelling aan larven en volwassen zebravis veroorzaakt leversteatose 11-13. Bij volwassen zebravissen ontvangen langdurige blootstelling EtOH, werd collageen afzetting waargenomen met opregulatie van fibrose-gerelateerde genen 14. Er bestaat echter behoefte aan het ontwikkelen van modellen leverregeneratie studeren in reactie op EtOH als fibrogenen stimulus.
Onlangs ontwikkelden we een-EtOH-geïnduceerde fibrotische lever model in de zebravis 15. We combineerden een hepatocyt-specifieke genetische ablatie systeem EtOH behandeling larvale en adult zebravis. Genereerden we twee transgene lijnen, Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1 en Tg (fabp10a: mCherry-NTR) GT2, waarbij E. coli nitroreductase (NTR) respectievelijk gefuseerd aan de cyaan en mCherry fluorescerend eiwit, onder toezicht van de hepatocyt-specifieke vetzuurbindend eiwit 10a, lever basis (fabp10a) promoter. In dit systeem zet NTR een toxisch progeneesmiddel metronidazol (MTZ) in een DNA-streng inter-verknopingsmiddel 16 induceren expliciete dood van hepatocyten. Met dit model hebben we aangetoond dat een populatie van levercellen, die reageren op Notch signalering, omgezet in hepatocyten in de bijna afwezigheid van hepatocyten en de overmaat ECM. We wijzen deze cellen als HPCs. Bovendien, door middel van chemische schermen, identificeerden we kleine molecule activatoren van Wnt-signalering en remmers van Notch signalering die levercel regeneratie in de fibrotische lever te vergroten. Therefoopnieuw, onze fibrotische lever model in de zebravis staat voor een uitstekende chemische screening systeem in vergelijking tot cel cultuur- of zoogdieren based screening systeem. Het is een in vivo systeem met aanzienlijke kosten- en tijdbesparende voordelen. Hier beschrijven we de gedetailleerde procedures voor de oprichting van een-EtOH-geïnduceerde fibrotische lever model en voor het uitvoeren van chemische schermen gebruik van dit model in de zebravis. Verder werden tijdsverloop analyses uitgevoerd om te onderzoeken hoe levercel regeneratie plaatsvindt in de fibrotische lever. Dit protocol zal een waardevol instrument om de mechanismen en strategieën van het verbeteren van levercel regeneratie in de fibrotische lever te bestuderen bieden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Zebravis zijn gerezen en getogen behulp van een standaard protocol dat voldoet aan de criteria van de National Institutes of Health en door het Georgia Institute of Technology Institutional Animal Care en gebruik Comite goedgekeurd.
1. Voorbereiding van de Solutions
- Bereid 20 L ei water (door elkaar gebruikt met een 'embryo medium') naar embryonale / larvale zebravis te handhaven. Los op 1,5 g CaSO 4 en 6 g direct oceaan zeezout in 250 ml gedestilleerd water. Giet in een mandfles gevuld met 20 liter gedestilleerd water en schud.
- Bereid 1 L 1-fenyl-2-thioureum (PTU) voorraadoplossing (20x). Los op 0,6 g PTU poeder in 1 liter gedestilleerd water. Voeg 1 ml van de oplossing per 20 ml embryo medium tot een eindconcentratie van 0,003% is als werkoplossing.
LET OP: PTU kan systemische toxiciteit na inhalatie of blootstelling van de huid veroorzaken. Voor te bereiden en te gebruiken in overeenstemming met de juiste richtlijnen hanteren. - Bereid 1 liter ethyl-3-aminobenzoate methaansulfonaat (tricaïne) stock-oplossing (20x). Ontbinden 4 g tricaïne poeder in gedestilleerd water. Breng de pH op 7 door toevoeging van 1 M Tris buffer (pH 9) en breng het uiteindelijke volume op 1 liter met gedestilleerd water. Aliquot in 50 ml en bewaar bij -20 ° C. Ontdooien voor gebruik.
LET OP: tricaïne kan een verlies van gevoel veroorzaken. Voor te bereiden en te gebruiken in overeenstemming met de juiste richtlijnen hanteren. - Bereid 100 ml larvale metronidazol (MTZ) werkende oplossing. Voeg vers 15 mM MTZ oplossing door het oplossen van 0,25 g MTZ poeder in 0,1% dimethylsulfoxide (DMSO) in 100 ml embryo medium. Ontbinden MTZ poeder volledig door krachtig schudden. Maak verse MTZ-oplossing en gebruiken aluminiumfolie om fotokatalytische afbraak van MTZ voorkomen.
LET OP: MTZ kan irritatie veroorzaken. Voor te bereiden en te gebruiken in overeenstemming met de juiste richtlijnen hanteren. - Bereid 100 ml larvale ethanol / metronidazol (EtOH / MTZ) werkende oplossing. Maak verse MTZ-oplossing en gebruiken aluminiumfolie om fotokatalytische de voorkominggradatie van MTZ. Voeg 1,5 ml 100% ethanol in 100 ml MTZ oplossing tot een eindconcentratie van 1,5% juist voor gebruik.
- Bereid 500 ml volwassen MTZ werkende oplossing. Maak verse 10 mM MTZ-oplossing door het oplossen van 0,83 g MTZ poeder in 0,1% DMSO in 500 ml water systeem. Ontbinden MTZ poeder volledig door krachtig schudden. Maak verse MTZ-oplossing en gebruiken aluminiumfolie om fotokatalytische afbraak van MTZ voorkomen.
- Bereid 1 L PEM buffer. Los op 30,2 g PIPES, 0,74 g EGTA en 0,12 g MgSO4 in gedestilleerd water. Stel de pH tot 7 met NaOH. Breng uiteindelijke volume tot 1 L met gedestilleerd water.
2. Voorbereiding van de larvale zebravis
- Opzetten paring van [Tg (fabp10a: GVB-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) JH11] 15,17 volwassen zebravissen met Tg (hand2: EGFP) PD24 13 volwassen zebravissen in paring tanks. Gebruik verdelers om getimede paring te voeren.
- Verwijder de divider de volgende ochtend en laat de vis om te paren zonder onderbreking. Harvest embryo 2 uur later gevolgd door het uitpersen van het systeem water en het overdragen van de embryo's in 100 mm Petri gerechten met embryo medium.
- Houd niet meer dan 100 embryo's per petrischaal. Onder een stereomicroscoop, verwijder onbevruchte eieren met een glazen pipet. Embryo groeien bij 28 ° C en voeg fenylthioureum (PTU) tot een eindconcentratie van 0,003% na 10 uur post-bevruchting (HPF) pigment ontwikkeling remmen.
3. Ethanol, Metronidazole Behandeling en leverregeneratie in larvale zebravis
- Bereid deze EtOH door toevoeging van ethanol in embryo medium tot een eindconcentratie van 1,5%. Do PTU niet toe te voegen.
- Behandel embryo's met 20 ml ethanol-oplossing per petrischaal 56-80 HPF. Bedek Petri gerechten met plastic folie om ethanol verdamping te voorkomen.
- Uitzoeken [Tg (fabp10a: GVB-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) JH11 sup>; Tg (hand2: EGFP) PD24] larven met gelijke afmetingen lever, zoals bepaald door CFP expressie bij 80 HPF. Do tricaïne niet gebruiken bij het sorteren van de-EtOH behandelde larven omdat deze hoog sterftecijfer met daaropvolgende behandeling EtOH / MTZ zal veroorzaken. Houd gesorteerde larven bij een dichtheid van 30 embryo's per petrischaal.
- Bereid verse 15 mM MTZ in embryo medium in 0,1% DMSO. Voeg juiste hoeveelheid EtOH in MTZ oplossing tot een eindconcentratie van 1,5% te maken. Incubeer larven in 20 ml EtOH / MTZ oplossing per petrischaal gedurende 24 uur bij 28 ° C. Bedek Petri gerechten met plastic folie om EtOH concentratie en met aluminium folie ter bescherming tegen het licht te houden.
- Na afloop van de behandeling, verwijder EtOH / MTZ oplossing overdracht larven nieuwe Petrischalen met verse embryo medium. Was larven 3 maal met embryo medium en bewaar ze in 20 ml embryo medium zonder PTU.
- Te sorteren op de larven met een bijna volledige ablatie van levercellen, observeren fluorescentieonder een epifluorescentiemicroscoop van de GVB-filter bij een vergroting van 80x. Succesvolle ablatie resultaten in minimaal GVB fluorescentie in de lever en significant verminderd volume lever.
- Tot de dood van de EtOH / MTZ-behandelde larven te voorkomen, geen gebruik maken van tricaïne voor het sorteren. Bevestig de larven voor immunokleuring (zie paragraaf 5) of houdt gesorteerde larven in petrischaaltjes bij 28 ° C voor verdere analyse.
4. Chemische schermen in EtOH / MTZ-behandelde Larvale zebravis
- Breng de 96-well platen met 10 mM voorraden in DMSO chemische (zie Materialen List voor details over de commerciële chemische bibliotheken) van de -80 ° C vriezer. Dek af met aluminiumfolie om fotokatalytische afbraak van chemicaliën te voorkomen. Ontdooi de voorraad oplossingen bij RT met zachte wiegen.
- Bereid chemische oplossingen door verdunning van 10 mM voorraadoplossingen met embryo medium tot een eindconcentratie van 50 uM (in 96 putjesplaten: aanvankelijk screen; in 1,5 ml buizen: herkeuring). Controle larven werden behandeld met gelijke concentraties van DMSO in embryo medium.
- Transfer larven vrijwel volledige hepatocyte ablatie, die werden behandeld met 1,5% EtOH / 15 mM MTZ en gesorteerd zoals voornoemd, ofwel 96 putjes (beginscherm) of 24 putjes (nacontrole) platen voorgevuld met embryo medium bij een dichtheid van 5 larven per putje. Gebruik duplo voor elke chemische stof.
- Verwijderen embryo medium en voeg ofwel 250 ul (96 putjes) of 500 pl (24 putjes) chemische oplossingen voor elk putje. Afdekplaten met aluminiumfolie en behandelen larven gedurende 50 uur bij 28 ° C. Inspecteer-chemische weken larven dagelijks en verwijder alle dode larven van afzonderlijke putjes.
- Aan het einde van de chemische behandeling, acht het aantal en / of de intensiteit van GFP-expressie hepatocyten onder een epifluorescentiemicroscoop de GVB filter bij een vergroting van 80X. Foto van levende larven tonen versterkt of te verminderend nummer en / of de intensiteit van CFP-expressie hepatocyten met een digitale camera voor records.
- Preserve larven door formaldehyde fixatie voor confocale beeldvorming zoals beschreven in hoofdstuk 5.
- Om de chemische stoffen die levercel regeneratie in het beginscherm te vergemakkelijken opnieuw te testen, onderzoeken hun potentie bij hogere en lagere concentraties van de meest doeltreffende concentratie met de in 4,1-4,5 ( 'herkeuring') beschreven procedures te vinden.
5. larvale zebravis Fixation, Immunokleuring en Confocale Imaging
- Verdoven larven door toevoeging tricaïne een eindconcentratie van 0,02%. Transfer 10-15 larven naar een 1,5 ml buis en eenmaal wassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Verwijder PBS en voeg 1 ml vers bereide 2% formaldehyde in PEM buffer O / N vast te stellen op 4 ° C.
LET OP: Formaldehyde veroorzaakt irritatie en staat bekend als een menselijk carcinogeen zijn. Hanteer in een zuurkast. - Gooi de vaststelling oplossing naar behoren en vervolgens wash 3 maal met PBS bij kamertemperatuur. Vaste larven in PBS bewaard bij 4 ° C tot enkele dagen. Overgegaan tot de volgende stap geeft onmiddellijk betere immunokleuring resultaten.
- verwijderen dooier en huid die de lever gebied met behulp van een # 55 pincet onder een stereomicroscoop zorgvuldig.
- Doorlaatbaar en blok larven Block buffer (4% runderserumalbumine en 0,3% Triton X-100 in PBS) O / N bij 4 ° C.
- Incubeer met konijn anti-collageen I antilichaam bij een verdunning van 1: 100 in blok buffer O / N bij 4 ° C. 5 keer wassen gedurende 15 min elk met wasbuffer (0,3% Triton X-100 in PBS).
- Incubate met AlexaFluor 647 geconjugeerd ezel anti-konijn antilichaam bij een verdunning van 1: 200 in Block buffer O / N bij 4 ° C. 5 keer wassen gedurende 15 min elk met wasbuffer. Was daarna eenmaal met PBS.
- Voorzichtig overdracht larven glasplaatjes met behulp van een glazen pipet, en oriënteren vaste larven met de linker zijkant naar boven. Verwijder overtollige PBS met behulp van Kimwipes. Voeg een druppel van de montage mediaEn seal deksel glas met nagellak. Het uitvoeren van confocale imaging onmiddellijk wordt sterk aanbevolen.
- Gebruik een confocale systeem uitgerust met een 40x / 1,3 olie lens om beelden vast te leggen. Met laser sterkte bij 20-50%. Leg Z stapel afbeeldingen 1 um intervallen.
6. Voorbereiding van de Adult zebravis
- Opzetten paring van [Tg (fabp10a: GVB-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) JH11] 15,17 volwassen zebravissen in paring tanks. Harvest embryo's de volgende ochtend door overbelasting systeem water en het overdragen van de embryo's in 100 mm Petri gerechten met embryo medium.
- Houd niet meer dan 100 embryo's per petrischaal. Onder een stereomicroscoop, verwijder onbevruchte eieren met een glazen pipet. Embryo groeien bij 28 ° C en een uiteindelijke concentratie van 0,003% PTU voeg na 10 HPF pigment ontwikkeling remmen.
- Op 4 DPF, gebruiken tricaïne om larven verdoven en uitzoeken [Tg (fabp10a: GVB-NTR)GT1; Tg (Tp1: mCherry) JH11] larven. Spoel tricaïne door het veranderen van de frisse meerdere malen embryo medium. Laat larven te herstellen bij 28 ° C tot ze bereiken normale hartslag van 120-180 slagen per minuut 18.
- Verhogen gesorteerde larven 6-12 maanden oud op basis van de standaardprocedure 19.
7. Ethanol, Metronidazole Behandeling en leverregeneratie in Adult zebravis
- Transfer 6-12 maanden oud [Tg (fabp10a: GVB-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) JH11] volwassen zebravissen paring tanks met behulp van een net. Houd vis bij een dichtheid van niet meer dan 10 vissen per tank.
- Bereid deze EtOH door toevoeging van EtOH in systeemwater tot een eindconcentratie van 1%. Behandel volwassen vissen met 500 ml EtOH oplossing in elke tank en te onderhouden in een 28 ° C incubator.
- Transfer volwassen vissen in de frisse EtOH oplossing dagelijks, verwerp dode vissen propErly als biologisch. Continu behandelen dieren voor 72 uur voor MTZ behandeling.
- Bereid verse 10 mM MTZ-oplossing in het systeem water in 0,1% DMSO. Pre-warm de MTZ oplossing in een 28 ° C incubator. Behandel vissen met 500 ml MTZ oplossing 1 L kruising tank voor 8 uur bij 28 ° C, beschermd tegen licht gebruik aluminiumfolie.
- Let op elk uur tijdens de behandeling en onmiddellijk te verwijderen dode vissen. Gooi dode vissen behoren als een biologisch gevaarlijk. Aan het eind van de behandeling MTZ, wassen MTZ door de overdracht van de dieren in de frisse systeem water tweemaal.
- Laat de dieren om te herstellen en te onderhouden in een incubator bij 28 ° C. Voeden en over te dragen vis vers systeem water dagelijks tot het tijdstip voor de analyses.
8. Adult zebravis lever Fixation, Immunokleuring en Confocale Imaging
- Verdoven volwassen vissen met 0,02% tricaïne en euthanaseren in ijs water gedurende 15 min. Dep de vis droog op een papieren handdoek en leg het op een dissectie mat.
- Expose gastro-intestinale organen door het verwijderen van de huid en spieren zoals eerder beschreven 20. Knip met een schaar de huid en de onderliggende spier vanaf de buik gesneden uit de anale vin de operculum, en posterieur langs de kant van de vis naar de anaalvin.
- Leg de vis in een 15 ml conische buis en eenmaal wassen met PBS. Verwijderen PBS en voeg 4 ml vers bereide 2% formaldehyde in PEM buffer O / N lossen bij 4 ° C.
- Gooi fixeeroplossing gewoon, en was 3 maal met PBS bij kamertemperatuur. Vaste monsters in PBS gedurende meerdere dagen worden bewaard bij 4 ° C. Overgegaan tot de volgende stap geeft onmiddellijk betere immunokleuring resultaten.
- Ontleden de gehele darm met lever van de lichaamsholte van de vis door het snijden van de slokdarm. Integreer de gastro-intestinale organen met 4% laagsmeltende agarose in een mal snijden.
- Gebruik een vibratome monsters gesneden dwarsprofielen op 50 um intervallen in ijskoud PBS, uitgaande van het voorste uiteinde. Transfer secgen tot 6-well plaat met PBS met behulp van een # 1 kwast.
- Doorlaatbaar en blokdelen in Block buffer O / N bij 4 ° C.
- Incubeer met konijn anti-collageen I antilichaam bij een verdunning van 1: 100 in blok buffer O / N bij 4 ° C. Was 5 keer, 15 minuten elk met wasbuffer.
- Incubate met AlexaFluor 647 geconjugeerd ezel anti-konijn antilichaam bij een verdunning van 1: 200 in Block buffer O / N bij 4 ° C. Was 5 keer, 15 minuten elk met wasbuffer en eenmaal met PBS.
- Voorzichtig dragen secties om glasplaatjes met behulp van een # 1 kwast. Verwijder overtollige PBS met behulp van Kimwipes, voeg een druppel van de montage media en seal deksel glas met nagellak. Het uitvoeren van confocale imaging onmiddellijk wordt sterk aanbevolen.
- Gebruik een confocale systeem uitgerust met een 40x / 1,3 olie lens om beelden vast te leggen. Met laser sterkte bij 20-50%. Leg Z stapel afbeeldingen 1 um intervallen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont de ontwikkeling van een EtOH-geïnduceerde fibrotische lever model in larvale zebravis. Om een protocol voor het blootstellen van de zebravis larven EtOH optimaliseren we eerst beoordeeld EtOH toxiciteit. 2,5 dagen post-bevruchting (DPF) larven werden blootgesteld aan EtOH concentratie 1%, 1,5% of 2% gedurende 24 uur, gevolgd door een gelijktijdige 24 uur EtOH / MTZ behandeling. Blootstelling aan 2% EtOH veroorzaakt hoge sterfte, terwijl bijna alle larven blootgesteld aan 1% EtOH of minder vertoonden minimale fibrogenen verandering zeldzame afzetting van extracellulaire matrix eiwitten zoals collageen. Op basis van deze resultaten werden de larven voorbehandeld met 1,5% EtOH gedurende 24 uur (2,5-3,5 dpf) en gelijktijdig behandeld met MTZ gedurende 24 uur (3,5-4,5 dpf) (Figuur 1A). De EtOH / MTZ-behandelde larven toonde morfologische afwijkingen waaronder opwaartse kromming van de romp en staart, pericardiale oedeem, en het niet zwemblaas te blazen. (Figuur 1B). Wijgebruikte drie transgene lijnen te fibrogenen veranderingen in de EtOH / MTZ-behandelde larvale levers te analyseren: 1) Tg (fabp10a: GVB-NTR) GT1 lijn geeft het NTR-gen gefuseerd met cyaan fluorescentie-eiwit onder de hepatocyt-specifieke fabp10a promotor 15; 2) Tg (Tp1: mCherry) JH11 markeert cellen met actieve Notch (Notch-reactieve cellen, NRC) of biliaire epitheelcellen (BEC) nucleaire mCherry 17, die expressie onder de controle van de TP1 module met meerdere RBP- jk-bindende plaatsen; en 3) Tg (hand2: EGFP) PD24 lijn, die leverstellaatcellen (HSC) 13 etiketten. -DMSO behandelde controle [Tg (fabp10a: GVB-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) JH11; tg (hand2: EGFP) PD24] levers toonden geen fibrillaire type I collageen afzetting 4,6,9 (figuur 1C, C '), terwijl EtOH / MT-Z behandelde levers weergegeven verhoogde type I collageen accumulatie bij 25 en 50 uur post-ablatie (HPA) (figuur 1D, D, E, E '). Bovendien, in vergelijking met DMSO behandelde controle levers (figuur 1C ''), HSCs in getal met de veranderde morfologie van een stervormige configuratie een myofibroblast-achtige vorm met verloren cytoplasmatische processen in EtOH / MTZ behandelde regenererende levers ( figuur 1D '', E ''). We zagen twee discrete populaties van mCherry expressie NRC op 25 HPA in de EtOH / MTZ-behandelde regenererende levers: dim rode NRC's (figuur 1D '' ', bijvoegsel, witte pijlen) en felrode NRC (figuur 1D' '', bijvoegsel , geel pijlpunten). Op 50 hPa, hepatocyt-specifieke GVB begon om samen te express in NRC met dim mCherry expressie gedurende de regenererende levers (figuur 1E '' ', bijvoegsel, witte pijlen). Deze GVB en dim mCherry-coexpressing NRC's zijn duidelijk te onderscheiden van helder rood NRC's die negatief zijn voor het GVB (figuur 1E '' ', bijvoegsel, geel pijlpunten) zijn. Eerdere studies toonden aan dat wanneer de proliferatie van levercellen werd onderdrukt na gedeeltelijke hepatectomie (PHx), HPC's uitgebreid met bijkomende proliferatie van HSC 21. Bovendien, de HPC's en BEC gedeelde histochemische markers 22. Vandaar dat onze resultaten geven aan dat het GVB en dim mCherry co-uiting van NRC's portretteren een zebravis-tegenhanger van HPC's die differentiëren in hepatocyten door tegenkomen Notch downregulatie. De NRC handhaven van hogere niveaus van Notch signalering kan als cholangiocyten, die gedifferentieerd zijn BEC 23 blijven.
Figuur 2 toont de ontwikkeling van een EtOH-geïnduceerde fibrotische lever model in volwassen zebravissen. Eerst blootgestelde we volwassen zebravissen tot 1%, 1,5% of 2% EtOH levensvatbaar zal zijn. De meeste volwassen zebravissen deed not overleven meer dan 72 uur blootstelling aan EtOH concentraties hoger dan 1% (ongepubliceerde gegevens). Daarom is voor volwassen zebravissen, we voorbehandeld de vis met 1% EtOH gedurende 72 uur en gevolgd MTZ behandeling (Figuur 2A). Door het uitvoeren tijdsverloop analyses toonden we significant verhoogd Type I collageen afzetting in EtOH / MTZ behandelde regenererende levers 2, 3, en 4 dagen post-ablatie (dpa) (figuur 2C ', D', E ') vergeleken met DMSO behandelde levers (figuur 2B). Vergelijkbaar met die in de larven, werd het GVB en dim mCherry co-expressie brengende cellen gedetecteerd in de EtOH / MTZ-behandelde regenererende levers van 12 maanden oude [Tg (fabp10a: GVB-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) JH11] volwassen vis op 3 en 4 dpa (figuur 2D, E, bijvoegsels, witte pijlen). Deze gegevens geven aan dat de HPC in reactie op signalering Notch, hun vermogen om te regenereren als hepatocyten handhavende aanwezigheid van fibrogenen belediging in volwassen zebravissen.
Figuur 3 toont de representatieve chemische screeningresultaten in onze ethanol geïnduceerde fibrotische lever model in larvale zebravis. Om bioactieve stoffen die levercel regeneratie versnellen in de fibrotische lever lokaliseren, voerden we chemische genetische screens. We gescreend een bibliotheek van 75 kleine moleculen met een goed gekarakteriseerd biologische en farmaceutische activiteiten (Stem Cell Signalering Compound Library, Selleckchem) en een bibliotheek van 1000 minder gekarakteriseerde kleine moleculen (ActiProbe-1K Library, TimTec) met behulp van [Tg (fabp10a: GVB -NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) JH11] larven. We geablateerd de hepatocyten in de aanwezigheid van 1,5% EtOH / 15 mM MTZ en vervolgens blootgesteld aan de larven 50 uM van de verbindingen voor 50 uur (Figuur 3A). Een aantal van de Wnt-agonisten, zoals SB 415286 en CHIR-99021, remmers van glycogeen synthase kinase-3, bevorderde regeneratie van hepatocyten (Figuur 3C, D) vergeleken met DMSO (Figuur 3B). Voorts [4- (1H-1,2,3,4-tetrazol-5-yl) -1,2,5-oxadiazool-3-ylamine], afgekort als HTOA, een nieuwe Wnt route activator, hepatocyte verbeterde regeneratie de fibrotische lever, zoals aangegeven door grotere geregenereerde lever (figuur 3E). Deze gegevens suggereren dat onze aanhoudende fibrotische model biedt een waardevol hulpmiddel om kleine moleculen die levercel regeneratie te verbeteren ontdekken.
Figuur 1. Ontwikkeling van een ethanol-geïnduceerde fibrotische lever model in larvale zebravis. (A) Regeling ter illustratie van de periodes van EtOH en EtOH / MTZ behandeling voor de oprichting van een fibrotische lever model in larven. (B) Op 50 uur post-ablatie (HPA), EtOH / MTZ-behandelde lArval zebravis ontwikkeld morfologische afwijkingen waaronder opwaartse kromming van de romp en staart, pericardiale oedeem, en het niet de zwemblaas te blazen. (CC '' ') In de levers van [Tg (fabp10a: GVB-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) JH11, tg (hand2: EGFP) PD24] larven behandeld met DMSO, ECM eiwitcollageen 1a bijna ondetecteerbaar (C, C ') en rustig HSCs toonde een stervormige configuratie (C'), terwijl NRC verdeeld hepatocyten (C, C '' ', bijvoegsel). (DE '' ') in de levers van EtOH / MTZ behandelde larven, werd verhoogd collageen 1a afzetting waargenomen (D, D', E, E '). HSCs in aantal toegenomen en verloren complexe cytoplasmatische processen (D ', E' '). Bij 25 hpa wordt mCherry expressie NRC uit twee verschillende populaties. Geel pijlpunten geven felrode NRC's (D '' ', inzet), terwijl witte pijlen geven dim rode NRC's (D' '', inzet). Op 50 hPa, Tg (fabp10a: GVB-NTR) en Tg (Tp1: mCherry) co-expressie brengen begonnen opkomende de hele regenererende levers (E '' ', bijvoegsel, witte pijlen), terwijl de heldere rode NRC had geen GVB uitdrukking (E '' ', bijvoegsel, geel pijlpunten). Alle confocale beelden zijn enkel vlak beelden behalve C '', D '', E '', die projectie beelden zijn. Schaal bars: B, 100 micrometer; CE '' ', 20 urn. EtOH, ethanol; MTZ, metronidazol; hPa, uren-post-ablatie; DPF, dag-na de bevruchting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Ontwikkeling van een ethanol-geïnduceerde fibrotische lever model bij volwassen zebravissen. (A) Regeling ter illustratie van de periodes van EtOH en MTZ behandeling voor de oprichting van een fibrotische lever model bij volwassen. (BE) Tg (fabp10a: GVB-NTR), Tg (Tp1: mCherry), en collageen 1a expressie in vibratome secties van DMSO (B en B ') en EtOH / MTZ-behandelde (CE) volwassen zebravissen levers. (BB ') In de DMSO-behandelde controles, collageen 1a bijna ondetecteerbaar (B') zonder Tg (fabp10a: CFP-NTR) en Tg (Tp1: mCherry) co-expressie brengende cellen (B). (CE) In de EtOH / MTZ behandelde regenererende levers werd 1a collageen afzetting aanzienlijk verhoogd bij 2, 3 en 4 DPA (C ', D', E ') met eenbevolking van Tg (fabp10a: GVB-NTR) en Tg (Tp1: mCherry) co-expressie brengen op 3 en 4 dpa (D, E, bijvoegsels, witte pijlen). De heldere rode NRC had geen GVB uitdrukking (D, E, bijvoegsels, geel pijlpunten). BE, confocale enkel vlak beelden. B'-E ', confocale projectie beelden. Schaal bar, 20 urn. EtOH, ethanol; MTZ, metronidazol; dpa, dag-na-ablatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Representatieve chemische screening resultaten met behulp van de ethanol-geïnduceerde fibrotische lever model in larvale zebravis. (A) Regeling voor de levercel regeneratie scherm in de fibrotische lever. (BE) Bekende en nieuwe Wntactivatoren vergroten levercel regeneratie in de fibrotische lever. Confocale projecties van de EtOH / MTZ behandelde levers in de [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1, Tg (Tp1: mCherry) JH11] larven die werden toegediend met DMSO (B), SB415286 (C), CHIR-99.021 ( D), of een nieuwe Wnt activator [4- (1H-1,2,3,4-tetrazol-5-yl) -1,2,5-oxadiazool-3-ylamine] (afgekort als HTOA) (E). SB415286 en CHIR-99021 zijn glycogeen synthase kinase-3-remmers. Alle afbeeldingen zijn confocale projectie beelden. Schaal bar, 20 urn. EtOH, ethanol; MTZ, metronidazol; hPa, uren-post-ablatie; DPF, dag-na de bevruchting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We observed HPC gemedieerde hepatocyte regeneratie in EtOH / MTZ behandelde levers herstellen, wat suggereert dat zelfs in aanwezigheid van aanzienlijke hoeveelheid ECM eiwitten waaronder fibrillair type I collageen, het HPC's behouden hun vermogen tot regenereren zoals hepatocyten. Het enige MTZ-behandeling niet significant toenemen afzetting van ECM eiwitten, terwijl de EtOH enige behandeling niet HPC activering 15 hoefden te induceren. Door toepassing van de gecombineerde behandeling EtOH / MTZ, konden we HPC-driven regeneratie onderzoeken de fibrotische lever. Zoals bijna volledige eliminatie van hepatocyt lokt-HPC gedreven levercel regeneratie, is het essentieel om uit te zoeken MTZ-behandelde larven op basis van de criteria van de afwezigheid van hepatocyt-specifieke fluorescentie en een aanzienlijk verlaagde volume lever door geclusterde NRC. In vis, de bloedvaten van de kieuwen en de huid absorberen de alcohol 24, zodat er geen noodzaak om dieren ad libitum drinken of eisen intragastric infusie zoals in modellen van zoogdieren. We gehuisvest EtOH- en de daaropvolgende MTZ-behandelde volwassen vis in aparte tanks zonder circuleren van het water. Het is essentieel om vis dagelijks dragen aan vers EtOH oplossing en houdt de deksel op de verdamping van EtOH minimaliseren. Hoewel 48-72 uur EtOH / MTZ behandeling efficiënt induceert ECM eiwitsynthese in onze protocollen is noch geavanceerde fibrose of cirrose ontwikkeld deze vissen. Daarom combinatie van MTZ met langdurige blootstelling ethanol zoals 12 weken behandeling 14, met name in volwassen vissen, kan meer ernstige leverschade om goed te simuleren en te ondervragen-HPC gedreven regeneratie bij chronisch leverfalen veroorzaken.
Zebravis dient als een uitstekend diermodel voor in vivo samengestelde testen vanwege zijn kleine formaat, groot nageslacht, transparantie en permeabiliteit voor kleine moleculen 25. Met behulp van de fibrotische lever model in de zebravis, identificeerden we een aantal bekende en nieuwe Wnt activators en Notch-remmers die levercel regeneratie 15 versneld. Onze huidige fluorescentie gebaseerde chemische screening protocol bestaat uit verschillende stappen allemaal uitgevoerd handmatig inbegrip bereiding van chemicaliën, overdracht EtOH behandelde / hepatocyt-geablateerd larven 24-well platen, behandelen chemicaliën en beoordeling van de effecten van chemische stoffen op hepatocyten regenereren. Er werken specifiek epifluorescentie en / of confocale microscoop om afbeeldingen voor individuele dier, welke is arbeidsintensief en tijdrovend vangen. High-throughput platforms die automatisch verwerken en het verwerven van cellulaire-resolutie beeldvorming van de zebravis in combinatie met kwantitatieve dataverzameling zal grootschalige screening 26,27 .Deze functies te vergemakkelijken zal worden versterkt indien gecombineerd met geautomatiseerde drug doseersysteem dat het bereik van chemische concentraties bepaalt 28, die minimale toxiciteit kan geven met een maximale doeltreffendheid voor het verbeteren van hepatocyte regeneratie. Ondanks deze beperties, zoals veel kritieke actoren en de belangrijkste soorten cellen van de lever worden geconserveerd tussen zebravis en zoogdieren 29, in dienst van de in vivo gebaseerde kleine moleculen screenen met behulp van de zebravis fibrotische lever model geldig ontdekking van nieuwe therapeutische strategieën voor chronische leverziekte katalyseren.
Twee aanvullende groepen onafhankelijk hebben aangetoond dat na bijna volledige verlies van hepatocyten zonder fibrogenen beledigingen, BEC transdifferentiated in hepatocyten door een stap van dedifferentiatie 30,31 met de veronderstelling dat cholangiocyten, volledig gedifferentieerde BEC, bevatten vooral NRC / BEC bij zebravis. Hoewel transdifferentiatie een van de mechanismen van het rijden hepatocyt regeneratie kan zijn, onze resultaten tonen aan dat de HPC's, waarvan bekend is dat de meeste BEC vormen in de zebravis lever 32, neerwaarts reguleren Notch activiteit differentiëren in hepatocyten. Ondertussen is het aannemelijk om te speculeren dat ee volledig gedifferentieerde BEC, cholangiocyten handhaven hogere niveaus van Notch activiteit zonder conversie naar levercellen tijdens de regeneratie. Intrigerend, in aanwezigheid van EtOH, zoals eerder gemeld 13, vonden we dat HSCs in aantal toegenomen met de veranderde morfologie van een stervormige configuratie een myofibroblast-achtige vorm met verloren cytoplasmatische processen. De geactiveerde HSC gekenmerkt door synthese van ECM eiwitten de dader beginsel belast abnormale wondgenezing bij de geïntegreerde werkwijze van lever reparatie 4. Hoewel chronische blessure overschrijft vaak opmerkelijke capaciteit van de lever voor de regeneratie, getransplanteerd HPC's succes herbevolkt de fibrotische / cirrotische rattenlever 33. Daarom zal onze zebravis fibrotische lever model een essentieel instrument voor het ophelderen van de moleculaire en cellulaire mechanismen die de gevolgen van de aanhoudende fibrose on-HPC-gemedieerde levercel regeneratie bemiddelen zijn. Bovendien definiëren de meercellige crosstalk dat regeneratie en fibrose in evenwicht door gebruik te maken van onze zebravis fibrotische lever model zal verder te vergemakkelijken om levensvatbare therapeutische strategieën te ontwikkelen voor chronische leverfalen in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd mede ondersteund door subsidies van de GTEC (2731336 en 1411318), de NIH (K01DK081351), en de NSF (1.354.837) naar CHS Wij danken Alem Giorgis voor kritische lezing van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium sulfate hemihydrate (CaSO4) | Acros | AC385355000 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | EMD | MX0075 | |
| 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid (PIPES) | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)- N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) |
Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-500 | |
| Metronidazole (MTZ) | Sigma-Aldrich | M3761 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) tablet | Amresco | E404 | Dissolve one tablet with 100 ml distilled water |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Low-melting agarose | Amresco | BP165 | |
| Stem Cell Signaling Compound Library | Selleck Chemicals | L2100 | 10 mM stock in DMSO |
| ActiProbe-1K Library | Timtec | ActiProbe-1K | 10 mM stock in DMSO |
| SB 415286 | Selleck Chemicals | S2729 | Dissolve with DMSO to 10 mM |
| CHIR-99021 | Selleck Chemicals | S2924 | Dissolve with DMSO to 10 mM |
| Anti-Collagen I antibody | Abcam | ab23730 | Use at 1:100 for immunostaining, reacts with fish |
| AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Molecular Probes | A31573 | Use at 1:200 for immunostaining |
| Mounting media (Vectorshield) | Vector Laboratories | H-1400 | |
| 100 mm Petri dish | VWR | 25384-088 | |
| 24-well plate | VWR | 10062-896 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | Dumont #55 |
| Glass slide | VWR | 48312-003 | 75x25 mm |
| Cover glass | VWR | 48366-045 | 18 mm |
| Plastic wrap | Fisher Scientific | 22305654 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 1213100 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Vibrotome | Leica | VT1000 S | |
| Stereo microscope | Leica | M80 | |
| Epifluoresence microscope | Leica | M205 FA | |
| Confocol microscope | Zeiss | LSM700 |
References
- Michalopoulos, G. K.
- Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. Stem cells and liver regeneration. Gastroenterology. 137 (2), 466-481 (2009).
- Shepard, C. W., Finelli, L., Alter, M. J. Global epidemiology of hepatitis C virus infection. Lancet Infect Dis. 5 (9), 558-567 (2005).
- Hernandez-Gea, V., Friedman, S. L.
- Bataller, R., Brenner, D. A.
- Kisseleva, T., Brenner, D. A. Anti-fibrogenic strategies and the regression of fibrosis. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 25 (2), 305-317 (2011).
- Constandinou, C., Henderson, N., Iredale, J. P.
- Gabele, E., et al. A new model of interactive effects of alcohol and high-fat diet on hepatic fibrosis. Alcohol Clin Exp Res. 35 (7), 1361-1367 (2011).
- Lieber, C. S. Alcoholic fatty liver: its pathogenesis and mechanism of progression to inflammation and fibrosis. Alcohol. 34 (1), 9-19 (2004).
- Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nat Rev Genet. 11 (10), 710-722 (2010).
- Jang, Z. H., et al. Metabolic profiling of an alcoholic fatty liver in zebrafish (Danio rerio). Mol Biosyst. 8 (7), 2001-2009 (2012).
- Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).
- Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. 56 (5), 1958-1970 (2012).
- Lin, J. N., et al. Development of an animal model for alcoholic liver disease in zebrafish. Zebrafish. 12 (4), 271-280 (2015).
- Huang, M., et al. Antagonistic interaction between Wnt and Notch activity modulates the regenerative capacity of a zebrafish fibrotic liver model. Hepatology. 60 (5), 1753-1766 (2014).
- Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3 (6), 948-954 (2008).
- Parsons, M. J., et al. Notch-responsive cells initiate the secondary transition in larval zebrafish pancreas. Mech Dev. 126 (10), 898-912 (2009).
- Baker, K., Warren, K. S., Yellen, G., Fishman, M. C. Defective 'pacemaker' current (Ih) in a zebrafish mutant with a slow heart rate. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (9), 4554-4559 (1997).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196 (2012).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp. (37), (2010).
- Paku, S., Schnur, J., Nagy, P., Thorgeirsson, S. S. Origin and structural evolution of the early proliferating oval cells in rat liver. Am J Pathol. 158 (4), 1313-1323 (2001).
- Turner, R., et al. Human hepatic stem cell and maturational liver lineage biology. Hepatology. 53 (3), 1035-1045 (2011).
- Kodama, Y., Hijikata, M., Kageyama, R., Shimotohno, K., Chiba, T. The role of notch signaling in the development of intrahepatic bile ducts. Gastroenterology. 127 (6), 1775-1786 (2004).
- Ryback, R., Percarpio, B., Vitale, J. Equilibration and metabolism of ethanol in the goldfish. Nature. 222 (5198), 1068-1070 (1969).
- Mathias, J. R., Saxena, M. T., Mumm, J. S. Advances in zebrafish chemical screening technologies. Future Med Chem. 4 (14), 1811-1822 (2012).
- Chen, C. H., Durand, E., Wang, J., Zon, L. I., Poss, K. D. zebraflash transgenic lines for in vivo bioluminescence imaging of stem cells and regeneration in adult zebrafish. Development. 140 (24), 4988-4997 (2013).
- Westhoff, J. H., et al. Development of an automated imaging pipeline for the analysis of the zebrafish larval kidney. PLoS One. 8 (12), e82137 (2013).
- Perlman, Z. E., et al. Multidimensional drug profiling by automated microscopy. Science. 306 (5699), 1194-1198 (2004).
- Chu, J., Sadler, K. C. New school in liver development: lessons from zebrafish. Hepatology. 50 (5), 1656-1663 (2009).
- Choi, T. Y., Ninov, N., Stainier, D. Y., Shin, D. Extensive conversion of hepatic biliary epithelial cells to hepatocytes after near total loss of hepatocytes in zebrafish. Gastroenterology. 146 (3), 776-788 (2014).
- He, J., Lu, H., Zou, Q., Luo, L. Regeneration of liver after extreme hepatocyte loss occurs mainly via biliary transdifferentiation in zebrafish. Gastroenterology. 146 (3), 789-800 (2014).
- Yao, Y., et al. Fine structure, enzyme histochemistry, and immunohistochemistry of liver in zebrafish. Anat Rec (Hoboken). 295 (4), 567-576 (2012).
- Yovchev, M. I., Xue, Y., Shafritz, D. A., Locker, J., Oertel, M. Repopulation of the fibrotic/cirrhotic rat liver by transplanted hepatic stem/progenitor cells and mature hepatocytes. Hepatology. 59 (1), 284-295 (2014).
