Name: Anwendung von mehrfarbigen FlpOut Technik, hochauflösende Einzelzelle Morphologien und Zell-Interaktionen der Glia in Drosophila studieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Lernen Sie die MCFO-Technik zur Visualisierung von Einzelzellmorphologien und Zell-Interaktionen in Drosophila. Diese Methode nutzt das Gal4/UAS-System und ermöglicht Studien in verschiedenen Geweben.

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Die Autoren danken Arnim Jenett, Aljoscha Nern und anderen Mitgliedern des Rubin-Labors für Beratung und Austausch von unveröffentlichten Reagenzien und Janelia fliegen Licht Projektteam für konfokale Bilder zu erzeugen. Die Autoren danken auch die Mitglieder von Gallien Labor für Kommentare auf das Manuskript.

1. Vorbereitung fliegen für mehrfarbige FlpOut (MCFO) Experimente Hinweis: die MCFO Technik bezieht sich auf eine modifizierte Version der so genannten Flp-vermittelten Stop Kassette Exzision (FlpOut). Transgene MCFO fliegen tragen einen Hitze-Schock-Promotor (Hsp)-Flp Rekombinase und andere Reporter unter UAS zu kontrollieren. Jeder Reporter besteht aus einer gemeinsamen Rückgrat einer Myristoylated (Myr) super Ordner grün fluoreszierenden Proteins (SfGFP), in welcher 10 Exemplare eines Epitops Tags (zB., HA, Flagge oder V5) eingelegt. Die daraus resultierende nicht fluoreszierenden Proteine benannt &#34; Spaghettimonster GFPs &#34; (SmGFPs) 14 und detektiert werden mit spezifischen Antikörpern gegen die verschiedenen Epitop Tags.
<ol><li>Fliegt Kreuz mit der MCFO Kassette und die Hsp-Flp (Hsp-Flp, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) zu den entsprechenden glialen GAL4 Fahrer Linien (siehe Tabelle der Materialien) .
	<ol><li>Eingerichtet wie der Hsp bereits aktiv bei 25 ° C ist und einige Zellen können Rekombination führt zu einer unspezifischen Kennzeichnung durchlaufen Kreuze bei 18 ° C um Undichtigkeit des Systems zu vermeiden. Warten Sie ca. 20 Tage bei 18 ° C, die F1-Generation zu erhalten. Nach der Hitze Schock (siehe Schritt 2), halten fliegen bei 25 ° C ( Abbildung 3).</li>
	</ol></li></ol> 2. Heat Shock Hinweis: abhängig von der Einstichstelle kann die Effizienz der Hsp-Flp abweichen; daher die optimale Hitze Schock Zeit muss optimiert werden. Für dieses Protokoll ein MCFO fliegen bestand in der Hsp-Flp, auf dem x-Chromosom eingefügt wurde verwendet wurde (siehe Tabelle der Werkstoffe).
<ol><li>Übertragung der Nachkommenschaft des Kreuzes im Schritt 1.1 (F1-Generation fliegt, 3-4 Tage alt) in neue Ampullen mit Nahrung und Wärme schockieren sie bei 37 ° C in einem Wasserbad. 
	Hinweis: Junge fliegen (1-2 Tage alt) sind sehr empfindlich gegenüber Hitzeschock. Warten Sie 1 oder 2 Tage vor der Durchführung der Hitzeschock um die Sterblichkeit infolge der Behandlung zu verringern. Verwenden einige der F1-Generation fliegt als ein Steuerelement ohne Hitzeschock.</li>
	<li>Während der Hitzeschock fliegen in normalen Fläschchen mit Lebensmitteln aufrechtzuerhalten, um die Rate der Stress-induzierte Sterblichkeit zu verringern. Weibchen und Männchen in separaten Fläschchen setzen.</li>
	<li>Achten Sie darauf, das gesamte Fläschchen in das Wasser zu einer homogenen Hitzeschock gewährleisten eintauchen. Verwenden Sie einen 5-8 min Schock als ein geeigneter Ausgangspunkt für spärlich Kennzeichnung von Glia-Zellen mit vielen GAL4 Fahrer Linien; die Schock-Dauer muss für jeden Fahrer und Experiment (kürzere oder längere Hitze Schock mal möglicherweise erforderlich) optimiert werden.</li>
	<li>Nach der Hitzeschock lag die Flaschen horizontal auf der Bank für ein paar Minuten damit die fliegen von der Hitzeschock erholen können. 
	Hinweis: Es ist nicht notwendig, die Fläschchen ändern.</li>
	<li>Pflegen die fliegen bei 25 ° C und sezieren (siehe Schritt 3 und 4) sie mindestens 2 Tage nach dem Hitzeschock für optimale Reporter Ausdruck.</li>
</ol> 3. Dissektion Vorbereitung und Lösungen <ol><li>Tag der Dissektion, bereiten frische Fixativ Lösung in 200 µL PCR Schläuche durch das Mischen von 180 µL S2 Zellkulturmedium mit 20 µL 20 % Paraformaldehyd (PFA), eine 2 % PFA-Lösung zu erhalten. Wartung der Fixativ Lösung auf dem Eis vor und während der Dissektion. 
	Achtung: PFA ist giftig und muss mit Vorsicht behandelt werden. 
	Hinweis: 160 µL S2 Zellkulturmedium mit 40 µL 20 % Paraformaldehyd (PFA) in einem 200 µL PCR-Röhrchen, bereiten Sie eine 4 % PFA Lösung anstelle einer 2 % igen Lösung mischen.</li>
	<li>Verwenden eine PCR-Röhrchen pro Genotyp mit maximal 8-10 Köpfe pro Röhre für optimale Färbung Ergebnisse.</li>
	<li>Bereiten die Erwachsene Gehirn Waschlösung: 0,5 % Rinderserumalbumin, 0,5 % Triton x-100 in PBS. 
	Hinweis: Je nach der Färbung, einer Lösung mit 1 % sein Triton x-100 erforderlich. Eine höhere Konzentration von Triton x-100 erhöht die Penetration des Antikörpers ins Gewebe und es ist notwendig, Fleck-Regionen, die tief in das Gewebe (z. B. synaptischen Regionen im erwachsenen Gehirn Drosophila) liegen.</li>
	<li>Bereiten Sie die blockierende Lösung: 3 % normalem Ziegenserum, 3 % normale Esel Serum und 0,5 % Triton x-100 in PBS.</li>
	<li>Erwachsene Gehirn waschen und die blockierende Lösung ein paar Wochen bei 4 ° C gelagert werden.</li>
	<li>Tiefe Depression Brunnen Glasplatte auf Eis gelegt und füllen jeweils auch mit den folgenden Lösungen: mit 70 % Ethanol, mit PBS und mit S2 Zellkulturmedium.</li>
</ol> 4. Erwachsenen Gehirn Dissektion <ol><li>3 cm Teller auf der Bühne eines Stereomikroskops sezieren zu positionieren und füllen Sie ihn mit kaltem S2 Zellkulturmedium. Führen Sie alle Sektionen in diesem Medium um sicherzustellen, dass das Gewebe während des Verfahrens der Dissektion gesund bleibt. 
	Hinweis: Verwenden Sie einen sezierenden Teller, gesäumt von mehreren Millimetern von schwarzem Silikon sorgt für einen guten Hintergrundkontrast (in den Bildern) und bewahren die Zange während der Dissektion.</li>
	<li>Betäuben die fliegen von der gewünschten Genotyp mit CO 2.</li>
	<li>Mit der Pinzette, greifen die Fly-by-Flügel und waschen Sie ihn in kaltem 70 % igem Ethanol für 30 s, dann mit kaltem PBS für zusätzliche 30 s.</li>
	<li>Übertragen die Fliege in die Tiefe Depression gut, die gefüllt ist mit S2 Zellkulturmedium.</li>
	<li>Wiederholen Sie den Vorgang für alle fliegen des gleichen Genotyps und pflegen sie in kalten S2 Zellkulturmedium bis Dissektion, die das Gewebe erhalten. 
	Hinweis: Zu betäuben, nur die Anzahl der fliegen, die in einem Zeitraum von ca. 30 min. langen Inkubationszeiten in S2 Zellkulturmedium seziert werden kann das Gewebe schädigen kann.</li>
	<li>Im laufenden Betrieb mit Zange greifen und unter einem Stereomikroskop tauchen die Fliege in S2 Zellkulturmedium.</li>
	<li>Trennen den Kopf vom Rest des Körpers. Verwerfen Sie den Körper und halten Sie den Kopf in S2 Zellkulturmedium getaucht. Es ist äußerst wichtig, den Kopf mit der Pinzette für die gesamte Dauer der Dissektion zu halten. Wenn der Kopf beginnt zu schweben, es wird schwierig sein, es abzurufen, ohne das Gewebe zu schädigen.</li>
	<li>Beginnen die Zerlegung durch Herausziehen eines Auges, während Sie den Kopf mit mindestens eine Zange zu allen Zeiten halten. Stellen Sie sicher, dass die Spitze der Zange direkt unterhalb der Netzhaut zu vermeiden das Gewebe unterhalb schadet. Ziehen Sie das andere Auge und beginnen, entfernen der Nagelhaut, bis das Gehirn erscheint.</li>
	<li>Entfernen Sie alle trachealen Gewebe und Nagelhaut um das Gehirn herum, bis das Gewebe sauber erscheint. Achten Sie darauf, alle trachealen Gewebe um das Gehirn für optimale Färbung Ergebnisse zu entfernen; die Gewebe sind jetzt bereit, fixiert und gefärbt werden.</li>
	<li>Pflegen die seziert Köpfe in kalten S2 Zelle Kulturmedium vor der Übertragung in die PFA-Lösung um die Fixierung Schritt Zeit.</li>
</ol> 5. Erwachsenen Gehirn Färbung < Ol> <li>Übertragen die isolierte Gehirn mit einer P10-Pipette in die PFA-Lösung bei Raumtemperatur (RT). Um Gewebeschäden zu vermeiden, verwenden Sie niemals Pinzetten für die Übertragung von den Gehirnen nach der Präparation. Führen Sie alle Schritte in 200 µL PCR Röhren auf ein Nutator.</li>
	<li>Für alle Schritte, bevor verwerfen die alte Lösung mit einer Pipette P200 lassen Sie die Köpfe auf den Boden des Röhrchens zu Regeln. Versuchen Sie, den Überstand zu entfernen, ohne das Gewebe absaugen. Das Gewebe vor Lichteinwirkung schützen.</li>
	<li>Fixieren die Köpfe in 200 µL 2 % PFA in S2 Zellkulturmedium für 1 h oder 4 % PFA für 30 Minuten. Halten die Fixierung Mal identisch zwischen Proben um die Reproduzierbarkeit zu erhöhen.</li>
	<li>Nach 3 (oder mehr) von jeweils 15 Minuten in 200 µL des erwachsenen Gehirns Waschlösung, wäscht blockieren die Gewebe mit 200 µL Lösung für 30 Minuten zu blockieren. Längere Inkubationszeiten bei der Blockierung Lösung sind möglich.</li>
	<li>Inkubieren die Gehirn über Nacht bei 4 ° C mit verdünnt im erwachsenen Gehirn Waschlösung in einem Gesamtvolumen von 200 µL Primärantikörper. 
	Hinweis: Die Inkubationszeiten variieren je nach Art der Antikörper verwendet. Längere Inkubationen können erforderlich sein.
	<ol><li>Für die Bezeichnung der drei MCFO Marker, brüten die Gehirne mit anti-HA (1: 500), Anti-FLAG (DYKDDDDK Epitop) (1: 100), und Anti-V5 Primärantikörper.</li>
		<li>Primäre direkt konjugierten Antikörpern könnte statt der normalen primären + sekundäre Kombination verwendet werden (zB., Anti-V5:DyLight 549 (1: 200)). In diesem Fall behandeln die direkt konjugierten Antikörper als Sekundärantikörper. 
		Hinweis: Für jeden Genotyp halten Sie einige Gehirne als Steuerelemente, die Spezifität der Färbung zu überprüfen. Die Primärantikörper Inkubation zu überspringen und direkt zum nächsten Schritt gehen.</li>
	</ol></li> <li>Waschen Gewebe 3 Mal für 1 h in 200 µL des erwachsenen Gehirns Waschlösung (Schritt 3.3) und inkubieren sie mit Fluorophor-Konjugate/primär direkt konjugierten Sekundärantikörper verdünnt im erwachsenen Gehirn Waschlösung über Nacht bei 4 ° C oder 4 h bei RT, in einem Gesamtvolumen von 200 µL Hinweis: Beispiele für entsprechende Antikörper: AlexaFluor 488 (1: 250), Anti-V5:DyLight 549 (1: 200) und DyLight 647 (1: 100)-konjugierten Antikörpern.</li>
	<li>Waschen die Köpfe 3 Mal für 1 h in 200 µL des erwachsenen Gehirns Waschlösung, gefolgt von einer endgültigen waschen in 200 µL PBS über Nacht bei 4 ° C oder 1-2 h bei RT; die letzten Waschschritt mit PBS-Puffer entfernt alle Spuren von Triton x-100 und ist notwendig für optimale Färbung Ergebnisse. Montieren Sie die Köpfe in Eindeckmittel mit einem Anti-Fade-Agenten auf Glasdeckgläser.</li>
</ol> 6. Für die Bildgebung des Gehirns Montage <ol><li>Trim eine Bildgebung Abstandhalter auf die entsprechende Größe mit einer Schere. Für hochauflösende Mikroskopie, sandwich-Probe und Bildgebung Abstandhalter zwischen zwei Glasdeckgläser. 
	Hinweis: Imaging Distanzscheiben sind dünne (0,12 mm dick) selbstklebende Abstandshalter, die Schale und halten Sie sich an Deckgläsern oder Mikroskop Objektträger, ermöglicht die Montage von Proben ohne Komprimierung.</li>
	<li>Mit Zange, entfernen Sie die selbstklebende Folie von einer Oberfläche und Spacer, klebende Seite nach unten, auf der Oberfläche von einem Glas Deckgläschen (22 x 60 mm). Ein neues Glas Deckglas 10 µL Eindeckmedium zuweisen.</li>
	<li>Mit ein P10 Pipette, übertragen die Gehirne aus 200 µL Tube, Deckglas, neben den Tropfen Eindeckmittel. Zusammen mit den Geweben, einige PBS zu übertragen, um die Köpfe in Lösung halten.</li>
	<li>Mit ein P10 Pipette, bewegen die Gehirne von PBS bis zum Tropfen Eindeckmittel versuchen, die Menge der PBS zu begrenzen. Übertragen Sie die Exemplare in Eindeckmittel auf das Deckglas mit bildgebenden Abstandhalter. Genügend Montage Medien nutzen, um die Probe zu decken.</li>
	<li>Die selbstklebende Folie von der Oberseite der Abstandhalter entfernen und hinzufügen ein Glas Deckglas auf die Proben. Wenden Sie mit einer Pinzette einen sanften Druck über die Klebefläche zu versiegeln. Bild der montierten Gewebe sofort oder lagern Sie die Folien bei-20 ° C für eine spätere Analyse.</li>
</ol> 7. Bild Erwerb <ol><li>Acquire Stapel konfokale Fluoreszenz-Bilder mit einem confocal Mikroskop mit einem 40 X (NA = 1.2, Eintauchen in Wasser) Ziel oder 63 X (NA = 1.4, Ölimmersion) Ziel (Pixelgrößen = 1.024 x 1.024 in der Xy-Ebene; Abstand zwischen zwei konfokalen Abschnitte = 0,5 µm). Stellen Sie Detektor Gain und Offset in jedem Kanal in einer Weise, dass keine gesättigten Pixel und Null Pixelwerte in den Bildern vorhanden sind; Dies vermeidet Informationsverluste und sorgt für den vollen Dynamikumfang des Detektors. 
	Hinweis: Da 3D-Bildgebung zeitaufwändig ist, können durch das Scannen mehrerer Proben parallel an verschiedenen Orten die Messungen automatisiert werden. Verwenden Sie zur Vermeidung von Verdampfung mit dem Ziel, Wasser eintauchen Spezialöl eintauchen Medium mit Brechungsindex n = 1,33.</li>
	<li>Verarbeiten die konfokale Stacks für maximale Dichte Projektionen, Änderungen im Kanal Farbton und Anpassung von Helligkeit und Kontrast mit jedem standard-Image-Analyse-Software (siehe Tabelle der Werkstoffe).</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren keine konkurrierende oder widersprüchliche Interessen.

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und effiziente Methode, um die Morphologie der verschiedenen Zelltypen innerhalb eines Gewebes von Interesse in hoher Auflösung zu studieren. Mit der MCFO Technik mehrere Reporter mit verschiedenen Epitop-Tags in Kombination multicolor stochastische Kennzeichnung (Abbildung 2) dienen. Ähnlich wie bei anderen Methoden wie Brainbow/Flybow15,16,17, MCFO erhöht ...

Glia, der nicht-neuronale Zellpopulation des Nervensystems (NS), waren lange geglaubt, um einen statischen Rahmen für Neuronen und wurden daher nicht im Detail untersucht. Jedoch beim Menschen, Glia bilden die überwiegende Mehrheit der Zellen in der NS (~ 90 %) und fallen in verschiedene Kategorien, darunter Astrozyten, Oligodendrozyten, Mikroglia und Schwann-Zellen. In DrosophilaGlia sind etwa 10 % der Zellen in der NS. Faszinierenderweise sind ihren Morphologien und Funktionen bemerkenswert ähnlich denen in Wirbeltieren1,2. Ihre Morphologien gehören Blut - Hirn-Schranke (BBB) Epithelien, Ensheathing und Astrozyten-wie Zellen bilden.
Die Drosophila Zentralnervensystem (ZNS) besteht aus folgenden Grundstrukturen: Cortex-Regionen, die enthalten die neuronalen Zellkörpern; Neuropils, die synaptische Verbindungen zu beherbergen; kleine und große Axon Traktate, die die verschiedenen Neuropiles zu verbinden; periphere Nerven, die Sinnesorgane und Muskeln mit CNS (Abbildung 1) zu verbinden. Glia sind assoziiert mit diesen anatomischen Strukturen gefunden: Cortex Glia (CG) in den kortikalen Regionen, Astrozyten-ähnliche Glia (ALG) und Ensheathing Glia (EG) in den Neuropile Regionen, Ensheathing Glia sind auch zentrale Axon Traktate und peripheren zugeordnet Nerven (EGN), und schließlich zwei folienartigen Glia, perineurial Glia (PG) und subperineurial (SPG), die zusammen bilden eine zusammenhängenden Schicht, die die gesamte NS (Abbildung 2) abdeckt.
Frühere Studien haben gezeigt, dass Gliazellen spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung der NS; Sie überwachen neuronale Zelle Zahlen durch Reaktion auf systemisch zirkulierende Insulin-Like-Peptide, Neuronen, wie z. B. die Astrozyten-Neuron-Laktat-Shuttle, trophische unterstützen und beseitigen sterbende Neuronen durch Phagozytose3,4 , 5 , 6. in die Reife NS Glia pflegen die BBB Neurotransmitter nehmen Ionischen Homöostase aufrechtzuerhalten, und fungieren als wichtigeren Immunzellen in der NS, da Makrophagen nicht die BBB verletzen und synaptische Aktivität sowie das Verhalten der Tiere6 moduliert , 7 , 8 , 9 , 10 , 11.
Ob der glialen Subtypen spezialisierte Funktionen ausführen, bleibt eine wichtige offene Frage. Jedoch wurde eine systematische genomweite Analyse der Glia, vor allem bei den Erwachsenen, durch einen Mangel an geeigneten genetischen Tools für ihre Handhabung behindert. Hier ist eine Methode, die ermöglicht die effiziente und einfache Charakterisierung der Zellformen zu komplexen Zellezelle Interaktionen zu untersuchen präsentiert. Diese Technik wurde zur Charakterisierung der Morphologie der glialen Subtypen im erwachsenen Gehirn Drosophila angewandt, aber abhängig von den jeweiligen GAL4-Treiber verwendet, es kann angepasst werden, um Neuronen12,13 studieren , jede Art von Vermischung Zellen und im Prinzip jedes Gewebe in alle Entwicklungsstadien.

<table><tbody><tr><td>Wasserbad</td><td>Grant</td><td>GD100</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Röhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>72.737.002</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Dumont</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Präparierschale 30 mm x 12 mmm</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>70543-30</td><td>Präparierschale aus Glas</td></tr><tr><td>Pyrex 3 Depression Glass Spot Plate</td><td>Corning</td><td>7223-34</td><td>Dissektionsplatten aus Glas</td></tr><tr><td>Sylgard Black</td><td>SYLGARD, Sigma-Aldrich</td><td>805998</td><td>hausgemacht mit Holzkohle</td></tr><tr><td>ExpressFive S2 Zellkulturmedium</td><td>Invitrogen</td><td>10486-025</td><td></td></tr><tr><td>20% PFA</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>15713</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Roth</td><td>3051.3</td><td></td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td>Jackson Laboratories</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Normal Eselserum</td><td>Jackson Laboratories</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen HA-Tag</td><td>Zellsignalisierung</td><td>C29F4</td><td>Primärer Antikörper, Verdünnung 1:500</td></tr><tr><td>Ratte FLAG-tag</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-06712</td><td>Primärer Antikörper, Verdünnung 1:100</td></tr><tr><td>Maus V5-Tag: DyLight 549</td><td>AdSerotec</td><td>0411</td><td>Konjugiert Antikörper, Verdünnung 1:200</td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen AlexaFluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td>Sekundärer Antikörper, Verdünnung 1:250</td></tr><tr><td>Anti-Ratte DyLight 647</td><td>Jackson Laboratories</td><td>712-605-153</td><td>Sekundärer Antikörper, Verdünnung 1:100</td></tr><tr><td>Vecta Shield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>SlowFate Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S36937</td><td></td></tr><tr><td>Secure Seal Spacer</td><td>Grace Biolabs</td><td></td><td>Kontaktieren Sie die Firma für die Bestellung</td></tr><tr><td>Mikroskop-Deckglas 22 X 60 mm</td><td>Marienfeld</td><td>101152</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop-Deckglas 22 x 22 mm</td><td>Roth</td><td>H874</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop, Leica MZ6</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop LSM710</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersol</td><td>Zeiss</td><td>518 F</td><td>Immersionsöl für die Fluoreszenzmikroskopie, halogenfrei</td></tr><tr><td>Immersol</td><td>Zeiss</td><td>W 2010</td><td>Immersionsflüssigkeit für Wasser-Immersionsobjektive, halogenfrei</td></tr><tr><td>R56F03-GAL4 (EG)</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>39157</td><td>GAL4 Treiber</td></tr><tr><td>R86E01-GAL4 (ALG)</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>45914</td><td>GAL4 Treiber</td></tr><tr><td>hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>64085</td><td>UAS Reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php)</td></tr><tr><td>Fidschi (Image J)</td><td></td><td></td><td>Bildanalysesoftware</td></tr><tr><td>Multi Time Macro</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Software für automatisiertes Scannen</td></tr></tbody></table>

anwendung von mehrfarbigen flpout technik, hochauflösende einzelzelle morphologien und zell-interaktionen der glia in drosophila studieren

Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila

Zellen zeigen unterschiedliche Morphologien und komplexen anatomischen Verhältnisse. Wie interagieren die Zellen mit ihren Nachbarn? Unterscheiden sich die Wechselwirkungen zwischen Zelltypen oder sogar innerhalb eines bestimmten Typs? Welche Arten von räumlichen Regeln folgen sie? Die Antworten auf solche grundlegenden Fragen in Vivo haben bisher durch einen Mangel an Tools für hochauflösende Einzelzelle Kennzeichnung behindert worden. Hier steht ein detailliertes Protokoll auf einzelne Zellen mit einer mehrfarbigen FlpOut (MCFO) Technik zur Verfügung. Diese Methode beruht auf drei unterschiedlich tagged Reporter (HA, Flagge und V5) unter FH-Kontrolle, die durch einen transkriptionelle Terminator, flankiert von zwei FRT Standorte (FRT-Stop-FRT) still gehalten werden. Ein Hitze-Schock-Puls induziert die Expression von einer Hitze Schock-induzierte Flp Rekombinase, die nach dem Zufallsprinzip die FRT-Stop-FRT-Kassetten in einzelnen Zellen entfernt: Ausdruck tritt nur in Zellen, die auch einen GAL4-Fahrer zum Ausdruck bringen. Dies führt zu einer Reihe von unterschiedlich gefärbten Zellen von einem bestimmten Zelltyp, der die Visualisierung der einzelnen Zelle Morphologien in hoher Auflösung ermöglicht. Als Beispiel kann die MCFO Technik mit spezifischen Glia GAL4-Treibern, die Morphologien der glialen Subtypen im erwachsenen Gehirn Drosophila zu visualisieren kombiniert werden.

Dieser Abschnitt zeigt Beispiele für Ergebnisse, die mithilfe der MCFO-Technik im erwachsenen Gehirn Drosophila abgerufen werden können. Abbildung 3 zeigt eine schematische Darstellung der Methode. Drei unterschiedlich Membran-Tags Reporter (Myr-SmGFP-HA, Myr-SmGFP-FLAG und Myr-SmGFP-V5) unter Kontrolle der FH sind durch einen transkriptionelle Terminator, flankiert von zwei FRT Standorte (FRT-Stop-FRT) geschwiegen. Ein Hitze-Schoc...

Zellen zeigen unterschiedliche Morphologien und eine Vielzahl von Interaktionen mit ihren Nachbarn zu etablieren. Dieses Protokoll beschreibt, die Morphologie der Einzelzellen zu offenbaren und Zell-Zell-Interaktion mithilfe der etablierten Gal4/UAS-Expressionssystem zu untersuchen.

Anwendung von mehrfarbigen FlpOut Technik, hochauflösende Einzelzelle Morphologien und Zell-Interaktionen der Glia in Drosophila studieren

Cells display different morphologies and complex anatomical relationships. How do cells interact with their neighbors? Do the interactions differ between ...

Das übergeordnete Ziel dieser Technik besteht darin, Einzelzell-Morphologien in komplexen anatomischen Geweben sichtbar zu machen, wodurch die Untersuchung von Zell-Zell-Interaktionen in Drosophila vereinfacht wird. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen zu komplexen Morphologien und Zell-Zell-Interaktionen mithilfe der Fruchtfliege zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie zur Untersuchung von Einzelzell-Morphologien in jedem Gewebe und zu jedem Entwicklungsstadium angepasst werden kann.Die Durchführung des Verfahrens übernimmt Anja Kieser, eine Technikerin in unserem Labor. Die MCFO-Technik modifiziert die Standard-FlpOut-Technik wie folgt: Eine Heat-shock-induzierbare FLP-Rekombinase und verschiedene Reporter stehen weiterhin unter UAS-Kontrolle; jeder Reporter besitzt jedoch ein gemeinsames Grundgerüst aus einem myristoylierten superfolder GFP, in das Kopien eines Epitop-Tags eingefügt wurden.Die resultierenden nicht-fluoreszierenden Proteine werden Spaghetti-Monster-GFPs genannt und mit Antikörpern nachgewiesen. Je nach Anzahl der Ausschnitte wird eine andere Kombination von Epitopen exprimiert. Da der HSP-Promotor bei 25 Grad Celsius leicht aktiv ist, sollten die Kreuzungen bei 18 Grad Celsius angesetzt werden, wo er tatsächlich inaktiv ist.Warten Sie anschließend etwa 20 Tage, um die F1-Generation zu erhalten. Sortieren Sie die F1-Weibchen und -Männchen in getrennte Gefäße. Um sie einer Hitzeschockbehandlung zu unterziehen, überführen Sie sie zunächst im Alter von drei bis vier Tagen in frische Nährbodenfläschchen.Jüngere Fliegen können zu empfindlich für eine Hitzeschockbehandlung sein. Überführen Sie die Röhrchen danach in ein Wasserbad mit 37 Grad Celsius. Tauchen Sie sie tief ein, um einen homogenen Hitzeschock zu gewährleisten.Für eine spärliche Markierung von Gliazellen beginnen Sie mit einer Hitzeschockdauer von fünf bis acht Minuten und optimieren anschließend. Die optimale Hitzeschockzeit führt zu einer spärlichen Markierung der Zielzellen, wobei die Beziehung von dem verwendeten spezifischen GAL4-Treiber abhängt. Legen Sie die Gefäße nach dem Hitzeschock einige Minuten lang horizontal auf den Laborplatz, um sie abkühlen zu lassen.Bringen Sie die Fliegen nun in denselben Vials bei 25 Grad Celsius in Kultivierung. Nach zwei Tagen ist die Reporterexpression optimal, und die Fliegen können disseziert werden. Bereiten Sie dies vor, indem Sie drei Tiefmuldenplatten auf Eis legen.Füllen Sie eine Vertiefung mit 70 %igem Ethanol, eine mit PBS und eine mit S2-Zellkulturmedium. Danach füllen Sie eine drei Zentimeter durchmessende Petrischale, die mit schwarzer Silikonmasse ausgekleidet ist, mit kaltem S2. Führen Sie die gesamte Dissektion in S2 durch, um die Gewebe gesund zu halten. Betäuben Sie nun die Fliegen mit Kohlendioxid.Dann die Fliegen mit einer Pinzette oder einer Feder etwa 30 Sekunden lang in kaltes 70 % Ethanol geben, gefolgt von etwa 30 Sekunden in kaltem PBS, und anschließend in kaltes S2 überführen. Auf diese Weise alle Fliegen, die sezieren werden sollen, waschen. Gewöhnlich sind bis zu 10 Fliegen eines Genotyps ausreichend. Innerhalb der nächsten 30 Minuten alle Gehirne dissezieren.Zunächst trennen Sie den Kopf vom übrigen Körper ab und entsorgen Sie den Körper. Halten Sie den Kopf während der gesamten Dissektion mit der nicht schneidenden Hand fest, da es andernfalls sehr schwierig sein wird, den Halt wiederzugewinnen. Ziehen Sie anschließend ein Auge heraus, indem Sie das Gewebe direkt unterhalb der Netzhaut ergreifen.Danach das andere Auge entfernen, um das Gehirn und das umgebende Gewebe freizulegen. Anschließend das gesamte Tracheengewebe und die verbleibende Cuticula um das Gehirn herum entfernen, bis das Gehirngewebe sauber erscheint. Für optimale Färbungsergebnisse muss das gesamte Tracheengewebe entfernt werden.Dies ist alles, was zur Vorbereitung des Gehirns für die Fixierung erforderlich ist. Fahren Sie fort, indem Sie alle Gehirne dissezieren, wobei die präparierten Gehirne in kaltem S2 gehalten werden. Versuchen Sie, pro Mikrozentrifugenröhrchen bis zu 10 Gehirne für eine optimale Färbung vorzubereiten. Überführen Sie die isolierten Gehirne mithilfe einer P10-Pipettenspitze in ein 200-Mikroliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit Fixierungslösung.Die Gehirne niemals mit einer Pinzette anfassen. Die Gewebe lichtgeschützt inkubieren. Vermeiden Sie es, die Gehirne während der Lösungsübertragungen abzusaugen.Um das Fixiermittel zu entfernen, führen Sie drei oder mehr Waschungen mit Waschlösung über jeweils 15 Minuten durch. Anschließend blockieren Sie die Gewebe mit der Blockierungslösung für mindestens 30 Minuten. Danach ersetzen Sie die Blockierungslösung durch in Waschlösung verdünnte primäre Antikörper und inkubieren die Gehirne über Nacht bei vier Grad Celsius.Um die primären Antikörper zu entfernen, führen Sie drei einstündige Waschungen in Waschlösung durch. Anschließend geben Sie sekundäre mit Fluorophor konjugierte Antikörper in Waschlösung hinzu und inkubieren die Gehirne über Nacht bei vier Grad Celsius oder vier Stunden bei Raumtemperatur. Um nicht gebundene Antikörper vollständig zu entfernen, führen Sie drei einstündige Waschungen in Waschlösung durch, gefolgt von einer längeren Waschung mit PBS.Dann montieren Sie die Gehirne. Bereiten Sie zwei Deckgläser mit einem Abbildungsabstandshalter vor. Geben Sie in den Abstandshalter und auf das zusätzliche Deckglas jeweils 10 Mikroliter Einbettmedium mit einem Anti-Fade-Agens.Als Nächstes überführen Sie mit einer P10-Pipette die Gehirne auf die Deckglasunterlage, wobei Sie sie zusammen mit etwas PBS neben das Medium geben. Achten Sie darauf, dass das Gewebe nicht austrocknet. Bewegen Sie die Gehirne nun vorsichtig mit der Pipette in das Einbettmedium und bringen Sie sie schließlich in das Medium im Abstandshalter, wo Sie sie mit einer Pinzette positionieren.Entfernen Sie anschließend die Klebefolie von den Abstandshaltern und befestigen Sie eine Deckglas. Fixieren Sie das Deckglas vorsichtig mit etwas Druck mithilfe einer Pinzette und führen Sie umgehend die Bildgebung durch, oder lagern Sie die Objektträger bei minus 20 Grad Celsius für eine spätere Analyse. Mit den beschriebenen Methoden werden drei verschiedene membrangebundene Reportergene durch transkriptionelle Terminatoren, die von FRT-Sequenzen flankiert sind, stummgeschaltet.Wenn die Tiere einer Hitzeschockbehandlung unterzogen wurden, wurde die FLP-Rekombinase exprimiert und entfernte zufällig die Terminatoren, wodurch die Expression unterschiedlicher Kombinationen von Reportergenen ausgelöst wurde. Insgesamt ermöglichen die verschiedenen Kombinationen der Reportergene sieben verschiedene Farben, sodass mehrere einzelne Zellmorphologien separat visualisiert und untersucht werden können. Verschiedene Dauer der Hitzeschockbehandlung wurden mit EG-GAL4 und ALG-GAL4 getestet.Die Einzelzellmarkierung wurde im Bereich des antenalen Lappens des Gehirns analysiert. Der EG-GAL4-Treiber, der in umhüllenden Gliazellen exprimiert wird, umhüllte alle Zellen an der Oberfläche des antenalen Lappens. Im Vergleich dazu bedeckten die durch den ALG-GAL4 gezielten astrozytenähnlichen Gliazellen größtenteils nicht überlappende Bereiche des antenalen Lappens.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie einzelne Zellen in Lösung markiert werden können. Um ihre komplexen und anatomischen Beziehungen mithilfe von Drosophila und im Prinzip auch bei anderen Modellorganismen, bei denen das binäre System GAL4 UIS angewendet werden kann, zu untersuchen. Wenn Sie dieses Verfahren zum ersten Mal durchführen, ist es wichtig, zunächst die Dauer der Hitzeschockbehandlung zu optimieren und die einzelnen Schritte des Färbeprotokolls so genau wie möglich zu befolgen, um die besten Ergebnisse zu erzielen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Behavior

Verhalten

Wir beschriebenen strukturellen Merkmale der Glia-neuromuskuläre Synapsen in einem Roman Inside-out Gewebe Vorbereitung der Live-Larven unter Verwendung von fluoreszierenden Farbstoffen mit der konfokalen Mikroskopie. Wir gekennzeichnet leben Neuronenendigungen mit fluoreszierenden primären Antikörper gegen HRP und auch visualisiert die perisynaptic Raum mit fluoreszierenden Dextrane.

Visualisierung der Live- Drosophila Glial-neuromuskulären Synapse mit Fluoreszenzfarbstoffen

Hier beschreiben wir ein Protokoll, um die Migration von Gliazellen in den Entwicklungsländern Drosophila Auge mit Live-mikroskopische Analyse mit GFP markierten Gliazellen gepaart untersuchen.

Live-Imaging von Gliazellen Migration in der Drosophila Eye Imaginalscheibe

Drosophila Blutzellen über die Gesamtheit des sich entwickelnden Embryos zu zerstreuen. Dieses Protokoll zeigt, wie die Montage und Bild dieser Migrationen Verwendung von Embryonen mit fluoreszenzmarkierten Blutzellen.

Live-Bildgebung Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migrationen

Der limitierende Faktor in der Verwendung der...

Single Drosophila Ommatidium Dissection und Imaging

Dieses Video zeigt die Immunfluoreszenzfärbung eines transgenen Drosophila-Gehirns für die Einzelzellbildgebung von Gliazellen. Das Gehirn exprimiert membrangesteuerte Proteine, die mit verschiedenen Kombinationen von antigenen Epitopen unter der Kontrolle eines glialspezifischen Rekombinasesystems fusioniert sind. Die isolierten und fixierten Gehirne werden mit primären Antikörpern gefärbt, die spezifisch für die antigenen Epitope sind, gefolgt von Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörpern.

Immunfluoreszenzfärbung von Drosophila-Gehirnen für die Einzelzellbildgebung von Gliazellen

Wir stellen eine Technik zur Markierung von einzelnen Neuronen im Zentralnervensystem (ZNS)...

Beschriften einzelner Zellen im zentralen Nervensystem<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Dieses Protokoll Details eine optimierte Methode verwendet, um Live-Cell-Imaging im Rahmen eines intakten Larven Gehirn durchzuführen. Live-Cell-Imaging Ansätze sind von unschätzbarem Wert für die Erforschung der neuronalen Stamm asymmetrische Zellteilungen sowie andere neurogene und Entwicklungsprozesse konsequent aufzudecken Mechanismen, die bisher übersehen wurden.

Live-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven Neuroblasten

Dieses Protokoll beschreibt die Dissektion und Immunostaining von Erwachsenen Drosophila Melanogaster Gewebe des Gehirns. Insbesondere unterstreicht dieses Protokoll die Verwendung von Drosophila Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen als Beispiel neuronale Teilmengen, die genau verwendet werden, um die allgemeinen Grundsätze für viele Aspekte der neuronalen Entwicklung aufzudecken.

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Im frühen Drosophila-Embryo sind viele Organellen beweglich. Im Prinzip können sie über spezifische fluoreszierende Sonden lebend abgebildet werden, aber die Eierschale verhindert eine direkte Anwendung auf den Embryo. Dieses Protokoll beschreibt, wie solche Sonden durch Mikroinjektion eingeführt und dann die Bewegung der Massenorganelle über die Teilchenbild-Velocimetrie analysiert werden.

Visualisierung des zytoskelettabhängigen Handels von lipidhaltigen Organellen in Drosophila-Embryonen

Hier werden nicht-invasive Methoden zur Lokalisation von Photorezeptormembranproteinen und zur Beurteilung der Netzhautdegeneration im Drosophila-Facettenauge mittels eGFP-Fluoreszenz beschrieben.

Untersuchung des Membranproteintransports in Drosophila-Photorezeptorzellen unter Verwendung von eGFP-markierten Proteinen

Expansion-Assisted Itercence In Situ Hybridization (EASI-FISH) ist eine robuste Technik, die Expansionsmikroskopie mit Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) kombiniert, um die Expression mehrerer Gene in dickem Gewebe nachzuweisen. Dieses Protokoll beschreibt die jüngsten Fortschritte in der Methode und ihre Anpassung an die Markierung des intakten Drosophila-Zentralnervensystems.

Multiplex-Detektion der Genexpression im intakten Drosophila-Gehirn mittels expansionsunterstützter iterativer Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung

Lernen Sie die MCFO-Technik zur Visualisierung von Einzelzellmorphologien und Zell-Interaktionen in Drosophila. Diese Methode nutzt das Gal4/UAS-System und ermöglicht Studien in verschiedenen Geweben.

Anwendung von mehrfarbigen FlpOut Technik, hochauflösende Einzelzelle Morphologien und Zell-Interaktionen der Glia in Drosophila studieren (Video) | JoVE Journal

Anwendung von mehrfarbigen FlpOut Technik, hochauflösende Einzelzelle Morphologien und Zell-Interaktionen der Glia in Drosophila studieren

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