Anwendung von mehrfarbigen FlpOut Technik, hochauflösende Einzelzelle Morphologien und Zell-Interaktionen der Glia in Drosophila studieren

Das übergeordnete Ziel dieser Technik ist es, die Morphologie einzelner Zellen in komplexen anatomischen Geweben sichtbar zu machen und so die Untersuchung der Zellzellinteraktion in Drosophila zu vereinfachen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zu komplexen Morphologien und Zellzellinteraktionen anhand der Fruchtfliege zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie an die Untersuchung von Einzelzellmorphologien in jedem Gewebe und in jedem Entwicklungsstadium angepasst werden kann.

Verfahren wird von Anja Kieser, Technikerin in unserem Labor, vorgeführt. Die MCFO-Technik modifiziert die standardmäßige FlpOut-Technik wie folgt. Eine Hitzeschock-FLP-Rekombinase und verschiedene Reporter bleiben unter UAS-Kontrolle, jedoch hat jeder Reporter ein gemeinsames Rückgrat eines myristoylierten Superordners GFP, in den Kopien eines Epitop-Tags eingefügt wurden.

Die dabei entstehenden nicht-fluoreszierenden Proteine werden Spaghettimonster GFPs genannt und mit Antikörpern identifiziert. Abhängig von der Anzahl der Exzisionen wird eine andere Kombination von Epitopen exprimiert. Da der HSP-Promotor bei 25 Grad Celsius leicht aktiv ist, sollten Sie Kreuzungen bei 18 Grad Celsius einrichten, wo er wirklich inaktiv ist.

Warten Sie dann etwa 20 Tage, um die F1-Generation zu erhalten. Sortieren Sie die weiblichen und männlichen F1 in separate Fläschchen. Um sie einen Hitzeschock zu geben, füllen Sie sie zuerst in Fläschchen mit frischen Lebensmitteln um, wenn sie drei bis vier Tage alt sind.

Jüngere Fliegen können zu empfindlich sein, um einen Hitzeschock zu erleiden. Übertragen Sie dann die Fläschchen in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad. Tauchen Sie sie tief ein, um einen gleichmäßigen Hitzeschock zu gewährleisten.

Für eine spärliche Markierung von Gliazellen beginnen Sie mit einem Hitzeschock von fünf bis acht Minuten und optimieren Sie dann. Die optimale Hitzeschockzeit wird die Zielzellen nur spärlich markieren und ihre Beziehung hängt vom verwendeten GAL4-Treiber ab. Legen Sie die Fläschchen nach dem Hitzeschock einige Minuten lang waagerecht auf die Bank, um sie abzukühlen.

Beginnen Sie nun, die Fliegen in denselben Fläschchen bei 25 Grad Celsius zu halten. Nach zwei Tagen ist die Reporterexpression optimal und die Fliegen können präpariert werden. Zur Vorbereitung legst du drei tiefe Vertiefungen auf Eis.

Füllen Sie eine Vertiefung mit 70 % Ethanol, eine mit PBS und eine mit S2-Zellkulturmedium. Beladen Sie dann eine drei Zentimeter große Präparierschale, die mit schwarzem Silikon ausgekleidet ist, mit kaltem S2. Führen Sie die gesamten Dissektionen in S2 durch, um das Gewebe gesund zu halten. Betäuben Sie nun die Fliegen mit Kohlendioxid.

Legen Sie dann die Fliegen mit einer Pinzette oder einer Feder für etwa 30 Sekunden in kaltes 70%iges Ethanol, gefolgt von kaltem PBS für etwa 30 Sekunden und übertragen Sie sie dann in kaltes S2. Waschen Sie also alle Fliegen, die präpariert werden sollen. Bis zu 10 Fliegen eines Genotyps reichen in der Regel aus. Sezieren Sie nun innerhalb von 30 Minuten alle Gehirne.

Löse zuerst den Kopf vom Rest des Körpers und entsorge den Körper. Halten Sie den Kopf während der gesamten Dissektion mit der freien Hand fest, sonst wird es sehr schwierig, ihn wieder in den Griff zu bekommen. Ziehen Sie dann ein Auge heraus, indem Sie das Gewebe nur knapp unter der Netzhaut greifen.

Ziehen Sie dann das andere Auge ab und legen Sie so das Gehirn und das umliegende Gewebe frei. Entfernen Sie als Nächstes das gesamte Luftröhrengewebe und die verbleibende Nagelhaut um das Gehirn, bis das Hirngewebe sauber erscheint. Für ein optimales Färbeergebnis muss das gesamte Trachealgewebe entfernt werden.

Das ist alles, was nötig ist, um das Gehirn auf die Fixierung vorzubereiten. Fahren Sie mit dem Präparieren aller Gehirne fort, während Sie die präparierten Gehirne in kaltem S2 halten. Versuchen Sie, bis zu 10 Gehirne pro Mikrozentrifugenröhrchen für eine optimale Färbung vorzubereiten. Übertragen Sie die isolierten Gehirne mit einer P10-Pipettenspitze in ein 200-Mikroliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit Fixierlösung.

Fassen Sie das Gehirn niemals mit einer Pinzette an. Inkubieren Sie das Gewebe lichtgeschützt. Vermeiden Sie es, das Gehirn während des Lösungstransfers zu aspirieren.

Um das Fixiermittel zu entfernen, verwenden Sie drei oder mehr 15-minütige Wäschen mit Waschlösung. Blockieren Sie dann das Gewebe 30 Minuten oder länger mit Blockierungslösung. Ersetzen Sie anschließend die Blockierungslösung durch in Waschlösung verdünnte Primärantikörper und inkubieren Sie das Gehirn über Nacht bei vier Grad Celsius.

Um die primären Antikörper zu entfernen, verwenden Sie drei einstündige Wäschen in Waschlösung. Als nächstes fügen Sie sekundäre Fluorophor-konjugierte Antikörper in Waschlösung hinzu und inkubieren Sie das Gehirn über Nacht bei vier Grad Celsius oder vier Stunden lang bei Raumtemperatur. Um die ungebundenen Antikörper vollständig abzuwaschen, verwenden Sie drei einstündige Wäschen in Waschlösung, gefolgt von einer längeren Wäsche mit PBS.

Dann besteigen Sie die Gehirne. Bereiten Sie zwei Deckgläser mit einem imaginären Abstandshalter vor. In den Abstandshalter und auf den zusätzlichen Deckglas 10 Mikroliter Eindeckmedium mit einem Lichtschutzmittel auftragen.

Übertragen Sie dann mit einer P10-Pipette das Gehirn auf das Deckglas und legen Sie es zusammen mit etwas PBS neben das Medium. Lassen Sie das Taschentuch nicht austrocknen. Schieben Sie nun die Gehirne vorsichtig mit der Pipette in das Eindeckmedium und bewegen Sie sie schließlich auf das Medium im Abstandshalter und ordnen Sie sie mit einer Pinzette an.

Entfernen Sie dann die Klebefolie auf den Abstandshaltern und bringen Sie einen Deckslip an. Sichern Sie das Deckglas mit etwas Druck mit einer Pinzette und fahren Sie sofort mit der Bildgebung fort oder lagern Sie die Objektträger bei minus 20 Grad Celsius für die spätere Analyse. Mit den beschriebenen Methoden werden drei verschiedene membranmarkierte Reporter durch transkriptionelle Terminatoren, die von FRT-Stellen flankiert werden, stumm gehalten.

Wenn die Tiere einen Hitzeschock erhielten, wurde die FLP-Rekombinase exprimiert und die Terminatoren wurden nach dem Zufallsprinzip entfernt, was zur Expression verschiedener Kombinationen von Reportern führte. Insgesamt liefern die verschiedenen Reporterkombinationen sieben verschiedene Farben, so dass mehrere Einzelzellmorphologien sichtbar gemacht und einzeln untersucht werden können. Es wurden verschiedene Hitzeschockzeiten mit EG-GAL4 und ALG-GAL4 getestet.

Die Einzelzellmarkierung wurde in der Antennenlappenregion des Gehirns analysiert. Der EG-GAL4-Treiber exprimierte sich in der Umhüllung von Gliazellen, die alle auf der Oberfläche des Antennenlappens eingeschlossen waren. Im Vergleich dazu bedeckten astrozytenähnliche Gliazellen, auf die das ALG-GAL4 abzielte, größtenteils nicht überlappende Bereiche des Antennenlappens.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einzelne Zellen in Lösung markiert. Um ihre komplexen und anatomischen Zusammenhänge zu verstehen, verwenden wir Drosophila und prinzipiell und in Modellorganismen, in denen das binäre System GAL4 UIS angewendet werden kann. Wenn Sie dieses Verfahren zum ersten Mal versuchen, ist es wichtig, zuerst daran zu denken, die Hitzeschockzeit zu optimieren und so weit wie möglich die einzelnen Schritte des Färbeprotokolls zu befolgen, um die besten Ergebnisse zu erzielen.