Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Een In Vivo bloed - hersenbarrière permeabiliteit Assay in muizen met behulp van Fluorescently label Tracers

Published: February 26, 2018 doi: 10.3791/57038
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1Institute of Neurology (Edinger Institute), Goethe University Hospital, 2Pharmazentrum Frankfurt, Institute for General Pharmacology and Toxicology, Goethe University Hospital

Summary

Hier presenteren we een muis hersenen vasculaire permeabiliteit assay gebruik intraperitoneale injectie van fluorescerende traceurs gevolgd door perfusie die gelden voor dierlijke modellen van de bloed - hersenbarrière dysfunctie. Een hemi-hersenen wordt gebruikt voor het beoordelen van permeabiliteit kwantitatief en anderzijds voor tracer visualisatie/immunokleuring. De procedure duurt 5-6 h voor 10 muizen.

Abstract

Bloed - hersenbarrière (BBB) is een gespecialiseerde barrière die de hersenen communicatie beschermt tegen toxinen en ziekteverwekkers in het verkeer en onderhoudt de homeostase van de hersenen. De belangrijkste sites van de barrière zijn endotheliale cellen van de haarvaten van de hersenen waarvan barrièrefunctie het gevolg is van strakke intercellulaire kruispunten en efflux vervoerders uitgedrukt op het plasma-membraan. Deze functie wordt geregeld door de pericytes en de astrocyten die samen de neurovasculaire eenheid (NVU vormen). Verschillende neurologische aandoeningen zoals beroerte, de ziekte van Alzheimer (AD), hersentumoren worden geassocieerd met een verminderde functie van de BBB. Beoordeling van de BBB-permeabiliteit is daarom cruciaal bij de beoordeling van de ernst van de neurologische ziekte en het succes van de behandelingsstrategieën werkzaam.

Wij presenteren hier een eenvoudige, maar robuuste permeabiliteit assay die met succes zijn toegepast op verschillende muis zowel, genetische en experimentele modellen. De methode is zeer kwantitatieve en objectieve in vergelijking met de analyse van de fluorescentie tracer door microscopie dat algemeen wordt toegepast. Bij deze methode worden muizen intraperitoneally ingespoten met een mengeling van waterige inerte fluorescerende traceurs gevolgd door anesthetizing van de muizen. Cardiale perfusie van de dieren wordt uitgevoerd vóór de oogst van de hersenen, nieren of andere organen. Organen worden gehomogeniseerd en gecentrifugeerd gevolgd door fluorescentie-meting van de bovendrijvende substantie. Bloed getrokken uit de cardiale punctie net voordat perfusie voor normalisatie doel tot de vasculaire compartiment serveert. De fluorescentie van weefsel is genormaliseerd naar de natte gewicht en serum fluorescentie te verkrijgen een kwantitatieve tracer permeabiliteit index. Voor extra bevestiging, kan de contralaterale hemi-hersenen bewaard voor immunohistochemistry voor tracer fluorescentie visualisatie doeleinden worden gebruikt.

Introduction

De bloed - hersenbarrière (BBB) bestaat uit de microvasculaire endotheliale cellen (ECs) ondersteund door nauw pericytes (PCs), die ensheathed in de basale lamina, en astrocyten (ACs), die het membraan van de kelder met hun einde-voeten1 omhullen ,2. ECs interactie met verschillende celtypes die ondersteuning en regelen de barrièrefunctie, vooral ACs en PC's, en ook neuronen en microglia, die allemaal samen de neurovasculaire eenheid (NVU vormen). De NVU is van cruciaal belang voor het functioneren van de BBB, waardoor het vervoer van bloed van toxinen en ziekteverwekkers uit het invoeren van de hersenen wordt beperkt. Deze functie is een gevolg van strakke-junctie moleculen zoals claudin-5, occludin, zonula occludens-1, die aanwezig zijn tussen de ECs en ook als gevolg van het optreden van vervoerders zoals p-Glycoproteïne (P-gp) dat efflux moleculen die worden ingevoerd door het endotheel terug in het vaartuig lumen1,2,3. De BBB zorgt echter voor het vervoer van essentiële moleculen zoals voedingsstoffen (ijzer, glucose, aminozuren) door specifieke vervoerders uitgedrukt op de EG plasma membranen1,2,3. De EG-laag is zeer gepolariseerd met betrekking tot de verdeling van de verschillende vervoerders tussen de luminal (bloed-gerichte) en abluminal (hersenen gerichte membranen) te voorzien in de specifieke en vectoriële vervoer functie4,5 . Terwijl de BBB beschermend met betrekking tot strak regulering van de CNS-omgeving is, is het een grote uitdaging voor CNS drug levering in ziekten zoals Parkinson met een functionele BBB. Zelfs in neurologische ziekten met BBB dysfunctie, kan niet er worden aangenomen dat de hersenen drug levering wordt verhoogd naarmate de barrière disfunctie kan ook schade aan de doelen van de specifieke vervoerder bijvoorbeeld zoals de ziekte van Alzheimer (AD). In AD, verschillende bèta amyloid vervoerders zoals LRP1, woede, P-gp bekend is dat ze dysregulated en daarom richten deze vervoerders zou zinloos6,7,8. De BBB is geschaad in verschillende neurologische aandoeningen zoals beroerte, AD, meningitis, MS, en in de hersenen tumoren9,10,11. Herstel van de barrièrefunctie is een cruciaal onderdeel van de therapeutische strategie, en dus haar beoordeling is van cruciaal belang.

In dit werk, hebben wij beschreven een objectieve en kwantitatieve protocol voor permeabiliteit assay in knaagdieren dat we met succes op verschillende muis lijnen beide transgene en experimentele ziekte modellen10,12,13 toegepast ,14. De methode is gebaseerd op een eenvoudige intraperitoneale injectie van fluorescerende traceurs gevolgd door perfusie van de muizen te verwijderen van de traceurs van de vasculaire compartiment. Hersenen en andere organen zijn verzamelde post perfusie en permeabiliteit beoordeeld door een doelstelling en absolute permeabiliteit index op basis van metingen van de fluorescentie van weefsel homogenates in een afleesapparaat. Alle ruwe fluorescentie waarden worden gecorrigeerd voor de achtergrond met behulp van weefsel homogenates of serum van sham dieren die niet elke tracer ontvangt. Ruime belangrijk zijn opgenomen voor serum volume, serum fluorescentie, en het gewicht van de weefsels, dus opbrengst permeabiliteit-index die is absoluut en vergelijkbare tussen experimenten en weefseltypes (HLA). Voor het gemak van vergelijking tussen groepen, kunnen de absolute permeabiliteit indexwaarden worden gemakkelijk omgezet naar ratio's zoals we eerder12had uitgevoerd. Gelijktijdig, kunnen opgeslagen hemi-hersenen en nieren worden gebruikt voor tracer visualisatie door fluorescentie microscopie10. De klassieke fluorescentie microscopie heel waardevol in het verkrijgen van regionale verschil in permeabiliteit zij omslachtig als gevolg van subjectieve selectie van weefselsecties en afbeeldingen voor een semi-kwantitatieve analyse kan zijn. De gedetailleerde stappen worden gepresenteerd in het protocol en notities worden toegevoegd waar nodig. Dit biedt de nodige informatie voor het succesvol uitvoeren van de permeabiliteit in vivo bepaling in muizen die kunnen worden geschaald naar andere kleine dieren. De bepaling kan worden toegepast op vele soorten traceurs waardoor de lading en de grootte op basis van permeabiliteit beoordeling door een combinatie van verklikstoffen met verschillende fluorescentie spectra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dieren die werden behandeld met de grootste zorg minimaliseren van pijn of ongemak tijdens de procedure. Deze procedure volgt de dierenverzorgers richtsnoeren van onze instelling en is goedgekeurd door het plaatselijke comité (Regierungspraesidium Darmstadt, erkenningsnummer FK/1044).

Een schematische voorstelling van de werk-stappen voor in vivo permeabiliteit assay in muizen is afgebeeld in Figuur 1. De details voor elke stap worden hieronder beschreven.

1. dier behandeling

  1. Voorbereiding en het beheer van de traceurs en anesthetica
    1. Gelabelde buizen en mallen voorbereiden door weefsel insluiten ten minste een dag voor de bepaling van de waterdoorlatendheid. Handhaving van steriele omstandigheden in het gehele protocol door te werken onder schone zuurkast en hulpprogramma's gereinigd met 80% ethanol. Mannelijke of vrouwelijke wild-type (WT) of angiopoietin-2 (Ang-2) winst-van-functie (GOF) CD1 muizen in de volgroeide volwassen leeftijdsgroep van 3-6 maanden voor het huidige protocol gebruiken. Genotypering van de muizen zoals eerder beschreven 10uit te voeren.
      Opmerking: 80% alcohol zal niet resulteren in steriele instrumenten maar zal het minimaliseren van verontreiniging van de monsters bereid.
    2. Verdun alle de traceurs in steriele PBS in 2 mM voorraden en slaan de aliquots beschermd tegen licht bij-20 ° C.
    3. Kies traceurs zoals (Tetramethyl Rhodamine) TMR en (fluoresceïne isothiocyanaat) FITC met verschillende excitatie/emissie spectra en dat zijn lysine corrigeerbare wat resulteert in minimale interferentie tussen de kleurstoffen door fluorescentie microscopie (met behulp van de TMR of FITC filteren respectievelijk) en door fluorometry in een afleesapparaat voor de permeabiliteit assay.
      Opmerking: TMR dextran 3 kD FITC dextran 3 kD gebruikt in de studie zijn beide corrigeerbare lysine en vandaar kon ook worden gebruikt voor de immunohistochemische analyse na fixatie met aldehyden te onderzoeken van regionale verschillen.
    4. Met alle dieren omgaan met uiterste zorg samengesteld volgens de richtlijnen van de institutionele zorg. Injecteren intraperitoneally elke muis met 100 µL tracer oplossing die kan worden verhoogd tot 200 µL als een extra tracer wordt gecombineerd met behulp van 100 µL van elke tracer in een 1:1 mix10,13. Ten minste één dier injecteren met PBS alleen in plaats van de traceurs om te dienen als sham controle voor autofluorescence achtergrond aftrekken.
    5. 5 min na tracer injectie, anesthetize het dier met een i.p injectie van Ketamine en Xylazine (100 mg en 5-10 mg in 0.9% zout per kg lichaam gewicht respectievelijk 150 µL van de cocktail per 25 g muis).
      Opmerking: Dierenarts zalf was niet toegepast op de ogen tijdens de procedure als de periode tussen dierlijke anesthesie en perfusie/offer korte was (10 minuten) waar elke drogen van de ogen niet werd waargenomen.
  2. Collectie en cardiale bloedverspreiding
    1. De dieren voor te bereiden voor cardiale perfusie 10 min na toediening van de verdoving. Het uitblijven van paw kramp antwoord controleren om ervoor te zorgen dat het dier een chirurgische vliegtuig van de verdoving bereikt.
    2. Leg de dieren op hun rug en 80% ethanol toe te passen op de huid van de buikstreek. Met behulp van kleine schaar, openstellen van de buikwand met een kleine incisie (2 cm) net onder de ribbenkast. Lever scheiden van het middenrif en vervolgens langzaam doorsnijden van het middenrif bloot van de pleura holte 15.
    3. De ribbenkast bilateraal knippen en monteren van het gesneden borstbeen om bloot het linkerventrikel. Invoegen van een naald 21-gauge vlinder aangesloten op een systeem van de peristaltische perfusie in de posterior van de linkerventrikel.
    4. Punctie van de juiste atrium en snel (binnen 10 s) verzamelen 200-300 µL bloed vrijkomen in de borstholte met behulp van 1 mL pipet tips (met einde cut-off) in serum collectie buizen en op te slaan op het ijs.
      Opmerking: Deze procedure perfusie is niet-survival.
    5. Zodra het bloed is verzameld, zet het systeem van de perfusie (10-12 rpm, 5 mL/min) en perfuse van het dier gedurende 3 minuten met warm (RT) 1 x PBS (gratis voor Ca2 +/Mg2 + -ionen).
      Opmerking: PBS met Ca2 +/Mg2 + -ionen kunnen worden gebruikt voor betere hartactiviteit tijdens de perfusie. Het totale bedrag van PBS gebruikt voor perfusie is in de range van 15-20 mL.
    6. Perfusie kwaliteit beoordelen door op te merken van de kleur van lever, nieren, die wit/pale na perfusie verschijnen.
      Opmerking: Nier of lever perfusie doen niet te betekenen perfusie van de hersenen als de slagaders (halsslagader/Vertebrale) bereiken van de hersenen van de aorta kan krijgen gescheurd tijdens de voorbereiding in stap 3 met name tijdens de atriale punctie.

2. de weefsels Processing

  1. Orgel inzameling en opslag
    1. Bevestig aan het einde van de perfusie, dood van het dier door cervicale dislocatie en oogst hersenen en nieren. Controleer of hersenen perfusie door de kleur van de hersenen (geen zichtbaar bloed in de vaten van de hersenvliezen), zodat de dieren van permeabiliteit analyse uitsluiten wanneer perfusie kwaliteit niet goed is. Het scheiden van de hersenen in 2 hemibrains met behulp van een scalpel (Figuur 1).
    2. Ontleden met een scalpel een hemibrain vrij van bulbus lobben en cerebellum en de hemicerebrum overbrengen in een 2-mL-buis. Hemi-cerebellum in een extra buis opslaan als nodig zijn voor cerebellaire permeabiliteit evaluatie.
    3. Een één nier overbrengen in een andere 2 mL-buis. Bewaar de monsters onmiddellijk op droog ijs.
    4. Insluiten native het resterende nier en de hemi-hersenen (bestaande uit het cerebellum en de bulbus lobben) in weefsel-tek optimale scherpe temperatuur (O.C.T) samengestelde op droog ijs.
    5. Op het einde, centrifugeer de bloedmonsters opgeslagen op ijs in serum collectie buizen op 10, 000 g, 10 min bij 4 ° C. Serum supernatant overbrengen in 1,5 mL buizen en plaats hen in de container droogijs.
    6. Overdracht van alle monsters verzameld op droogijs naar-80 ° C vriezer totdat zij worden verwerkt.
      Opmerking: Het is belangrijk dat de monsters voordat u verdergaat met de stappen van homogenisering als verhogingen van de efficiëntie van de homogenisering na bevriezen, zoals het bevriezen, ontdooien.
  2. Homogenisering en centrifugeren
    1. De hemi-hersenen en nieren monsters van bevroren bij-80 ° C op ijs ontdooien en weegt de buizen met de organen. Aftrekken van deze gewichten, de gemiddelde waarde van verschillende lege buizen (ongeveer 20) om het weefsel gewicht. Voeg 300 µL en 200 µL van koude 1 X PBS de buizen met nier- en hemi-hersenen, respectievelijk.
      Opmerking: voor lagere hoeveelheden weefsel (zoals hemi-cerebellum, onder 100 mg) met een gewicht van de afzonderlijke buizen wordt aanbevolen.
    2. Elk monster in de oorspronkelijke eppendorf buis meng met een stamper van polytetrafluorethyleen (PTFE) gekoppeld aan een elektrische Bovenroerder (1, 000 rpm) door het uitvoeren van ongeveer 15 lijnen (1 lijn = 1 op en 1 neer). Spoel de stamper met PBS tussen monsters en veeg droog alvorens tot het volgende monster.
      Opmerking: Het gebruik van detergentia tijdens homogenisering werd vermeden vanwege mogelijke storing met fluorometry. Intracellulaire tracer wordt echter ook ontdekt in dit protocol, zoals het weefsel is grondig gehomogeniseerd, die efficiënter is na één ronde van bevriezen ontdooien.
    3. Bewaar de gehomogeniseerde monsters op ijs beschermd tegen licht en centrifuge allemaal samen in het einde op 15.000 g, 20 min, 4 ° C in een tafelblad centrifuge. Supernatant overbrengen in een nieuwe 1,5 mL-buizen op het ijs voor onmiddellijke fluorometry of bij-80 ° C tot naderhand worden geanalyseerd.
  3. Fluorescentie-meting en kwantificering
    1. Indien bevroren aan het einde van de vorige stap, ontdooien op ijs de weefsel supernatant en serum monsters opgeslagen bij-80 ˚C hen te beschermen tegen licht met de folie.
    2. Pipeteer 50 µL van verdund serum (30 µL 1 x PBS + 20 µL serum) of weefsel supernatant (zoals) in een 384-well zwarte plaat. Omvatten ten minste één monster van sham dier voor serum en weefsel supernatant om ervoor te zorgen de juiste achtergrond aftrekken, zoals dit weefsel homogenaat achtergrond meestal hoger dan die van PBS gebruikt als het oplosmiddel is.
      Opmerking: Een gemiddelde van 3 sham dieren kan worden gebruikt voor autofluorescence hoewel een weinig variabiliteit in sham autofluorescence waarden (gegevens niet worden weergegeven) werd waargenomen. De hoeveelheid serum gebruikt kan worden verminderd door het verdunnen met PBS, die ook de signaal / ruisverhouding voor monsters met lage fluorescentie zoals de hersenen monsters kan verhogen. T/m 10 µL serum werd getest verdunnen het met 40 µL PBS. Zorg ervoor dat geen luchtbellen aanwezig in de putjes zijn.
    3. De 384-well zwarte plaat in de afleesapparaat invoegen en open een nieuw script selecteren fluorescentie-meting.
    4. De winst ingesteld op optimale en excitatie / (nm) emissiewaarden voor 550/580 of 490/520 respectievelijk voor TMR of FITC dyee gebruiken en start de meting om te verkrijgen van de ruwe fluorescentie-eenheden (RFUs).
    5. De ruwe fluorescentie-eenheden (RFUs) van de afleesapparaat gebruiken om te berekenen de permeabiliteit index (PI) na het aftrekken van de waarden van de bijbehorende sham.
      1. * Permeabiliteit Index (mL/g) = (Weefsel RFUs/g weefsel gewicht) / (Serum RFUs/mL serum)
    6. Voorbeeld berekening voor hersenen permeabiliteit index (PI) van het dier GOF1 (tabel 1):
      1. GOF1 brain RFUs - SHAM hersenen RFUs = 154-22,5 = 131.5
      2. GOF1 serum RFUs - SHAM serum RFUs = 38305-27 = 38278
      3. Brain gewicht (g) = 0.195
      4. Serum volume (ml) = 0,02
      5. Brain permeabiliteit Index (10-3 mL/g) = (131.5/0.195)/(38278/0.02) = 0,352
        Opmerking: De berekeningen van de index permeabiliteit heeft waarden opgeleverd die absolute en vergelijkbare tussen experimenten en weefseltypes (HLA zijn). Deze kunnen echter worden gepresenteerd als ratio's voor het gemak van vergelijking tussen 2 groepen 12. Dit kan worden bereikt door het verdelen van de PI van elk dier in beide groepen met de gemiddelde PI van de controlegroep, rijden de controle groep gemiddelde via 1 nog houden van de inter dierlijke variatie in de controlegroep. Deze transformatie levert waarden voor experimentele groep (of groepen) ten opzichte van de controlegroep ingesteld op 1.
  4. Immunofluorescentie visualisatie van tracer
    1. Snijd de blokken van de nier/hemi-hersenen native ingebed in weefsel-tek compound (O.C.T) (stap 2.1) in 10 µm secties op een cryostaat ingesteld op-20 ° C en breng de secties naar dia's geplaatst bij kamertemperatuur. Zodra de secties zijn gedroogd (ongeveer 30 min), overbrengen in dia's-80 ° C, vriesvak tot gebruik.
    2. Op de dag van de kleuring, ontdooien van de dia's bij 37 ° C gedurende 10 minuten en vervolgens het herstellen van de secties met 4% paraformaladehyde (PFA) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur gevolgd door snelle wassen in PBS.
    3. De secties in permeabilization/blokkeren buffer gemaakt van steriel PBS, met 1% BSA en 0,5% Triton X-100 pH 7.5 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur incuberen.
    4. Incubeer de dia's gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur met CD31 primair antilichaam (0,5 mg/ml, kloon MEC 13,3), verdund in 1:100 in buffer met steriel PBS, 0,5% BSA, 0,25% Triton X-100 (pH 7,2) gevolgd door drie 5 min wast in PBS.
    5. Incubatie van secundair antilichaam in de bovenstaande buffer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met soortspecifieke uitvoeren, fluorescently label antilichamen verdunde 1:500 (2 mg/mL). Voor CD31, kan geit anti-rat Alexa 568 of Alexa 488 worden gebruikt bij een verdunning van 1:500. Omvatten van de DAPI (300 µM) in het secundair antilichaam (1:1, 000 verdunning uit de voorraad) te mengen om de vlek voor de kernen.
    6. De gekleurde secties met aqua polymount mount en laat het 's nachts voor polymerisatie bij kamertemperatuur in donker.
    7. Verwerven van beelden met behulp van een spectrale imaging confocale laser scanning microscoop systeem. Het analyseren van beelden met NIS elementen software (versie 4.3). Software zoals Photoshop kan worden gebruikt voor de generatie van montage cijfers.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

We hebben onlangs aangetoond dat angiopoietin-2 (Ang-2) winst-van-functie (GOF) muizen hogere vasculaire permeabiliteit van de hersenen dan controle muizen in gezonde omstandigheden10 hebben. In lijn-geïnduceerde muizen was het ook laat zien dat de muizen GOF had grotere maten van het infarct en grotere doorlaatbaarheid dan de controle nestgenoten. Deze resultaten tonen een kritische rol van Ang-2 in permeabiliteit bij de BBB. Het protocol is daarom gebruikt de GOF muizen en vergeleken ze om te bepalen van nestgenoten om te beschrijven de permeabiliteit in vivo bepaling. Echter, deze methode kan worden toegepast op elke ziekte model, transgeen muismodel of behandelingen die de BBB-permeabiliteit veranderen als we eerder 10,11,12,13 dedenvan de drug.

Een korte omloop tijd (15 min) voor doorlaatbaarheid analyse wordt voorgesteld, zoals langere tijden van het verkeer zal leiden tot een grotere afstand van de vasculaire compartiment, dat ook in eerdere studies16geconstateerd. De goedkeuring van de 3 kD FITC-dextran bij 2 h ()Figuur 2 C, D) is veel groter dan op 15 min ()Figuur 2 A, B) in nier ook in hersenweefsel. In de hersenen is er weinig extravascular tracer als gevolg van intact bloed - hersenbarrière bij deze volwassen WT muizen (Figuur B, D). Toepassing van deze methode, werd de doorlaatbaarheid van de tracer in Ang-2 GOF met WT nestgenoten vergeleken. Hogere tracer accumulatie in de hersenen van GOF muizen in vergelijking met WT muizen blijkt uit de resultaten gepresenteerd in een tabel (tabel 1). De fluorescentie van de nier is echter niet veranderd tussen deze groepen. Immunofluorescentie beelden bevestigen de toename van de extravascular tracer in GOF muizen ()Figuur 3 B, D) in vergelijking met WT muizen ()Figuur 3 A, C) waar de tracer is beperkt tot de vasculaire compartiment.

Figure 1
Figuur 1. Schematische voorstelling van de workflow voor de in vivo permeabiliteit assay met behulp van fluorescerende verklikstoffen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2. Tracer goedkeuring op korte en lange omloop tijden. Teneinde de tracer omloop tijd voor de permeabiliteit assay, een korte omloop tijd van 15 min werd (A, B) vergeleken met een lange omloop tijd van 2 h (C, D) post tracer injectie. De langere omloop tijd van 2 h leidde tot zeer lage hoeveelheden tracer ophoping in de nier (C) waar de basale permeabiliteit hoog is in vergelijking met een korte 15 min omloop tijd (A) potentieel als gevolg van een zeer hoge Goedkeuringvande FITC dextran-3 kD (groen kanaal) van de vasculaire compartiment. Dit effect werd nog dramatischer in de hersenen wordt gekenmerkt door de strakke bloed - hersen-barrière (B, D). CD31 kleuring (rode kanaal), bevestigde de aanwezigheid van schepen in de regio van belang. Representatieve beelden uit een enkel dier uit 2 wild-type volwassen CD1 muizen ingespoten met de tracer voor elk tijdstip en dieren werden opgeofferd zonder hen om te visualiseren de intravasculaire tracer zoogdierlevercellen. De schaal bar = 20 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3. Kleuring voor verklikstoffen aan hersenen permeabiliteit veranderingen in GOF muizen beoordelen immunofluorescentie. Verhoogde permeabiliteit van 3 kD TMR-dextran tracer (in rood) kan worden gevisualiseerd in Ang-2 GOF muizen (B, D) ten opzichte van WT nestgenoten (A, C) in de regio van de cortex. In WT dieren is de tracer beperkt tot de vaartuigen (A, C) Overwegende dat extravascular tracer kan worden waargenomen in GOF muizen (witte pijlen in B, D). Kleuring voor CD31 (in blauw) in de samengevoegde afbeeldingen bevestigt (A-D) de aanwezigheid van schepen. Figuur toont representatieve beelden van 2 WT en 2 GOF muizen ingespoten met verklikstoffen i.p en 15 min post injectie met perfusie opgeofferd. Schaal bar = 20 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Dierlijke ID Hersenen gewicht (g) Nier gewicht (g) Serum volume (mL) Serum RFU Nier RFU Hersenen RFU Perm. Index (10 ^-3 ml/g)
Nier Hersenen
GOF 1 0.195 0.252 0.02 38305 31051 154 64,4 0,352
GOF 2 0,177 0.249 0.02 42001 31411 126 60 0.278
WT 1 0.167 0.301 0.02 40904 31591 64 51.2 0.122
WT 2 0.146 0.294 0.02 39502 31768 70 54.8 0.164
SHAM 0.155 0.27 0.02 27 36 22,5 NB NB

Tabel 1. Weefsel permeabiliteit berekeningen. Permeabiliteit index berekeningen voor Ang-2 winst-van-functie (GOF) en wild-type nestgenoten (WT) muizen blijkt groter (ongeveer 2-fold) brain permeabiliteit in GOF muizen in vergelijking met WT muizen. De permeabiliteit van de nier is echter in hetzelfde bereik tussen de 2 groepen. De basale nier permeabiliteit is veel groter in vergelijking met de hersenen zoals verwacht als gevolg van fenêtré endotheel in nier die niet een strakke barrière.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bloed - hersenbarrière dysfunctie wordt geassocieerd met een aantal neurologische aandoeningen, met inbegrip van de primaire en secundaire hersentumor of beroerte. BBB-verdeling wordt vaak geassocieerd met levensbedreigende CNS oedeem. Het ontrafelen van de moleculaire mechanismen die leiden de opening tot of sluiting van de BBB wordt daarom van therapeutische belang in neurologische aandoeningen en vaak onderzocht door onderzoekers. Methoden te onderzoeken BBB permeabiliteit in vivo gemeld in de literatuur, zijn echter vaak geassocieerd met technische moeilijkheden die afhankelijk zijn van vervelende en subjectieve kwantificering van fluorescentie beelden17,18 , 19. Bovendien, sommige van de methoden omvatten hele hersenen fluorescentie imaging dat is misleidend omdat het meer kenmerkend voor doorlaatbaarheid van oppervlakkige hersenen vaartuigen die een strakke barrière niet uitmaken. Zelfs wanneer kwantificering is verricht op basis van de objectieve hersenen weefsel extinctie (b.v. evans blauwe permeabiliteit beoordeling) de dieren zijn vaak niet geperfundeerd wat leidt tot onjuiste interpretatie als gevolg van aanzienlijke bloed breuk. Gewicht van de hersenen is een andere variabele die is vaak niet opgenomen in de berekeningen van de permeabiliteit maar moet als oedeem ten gevolge van vasculaire permeabiliteit kan verhoging van het gewicht en de netto permeabiliteit wijzigen. Bovendien, seks en dier-aan-dier hersenen gewicht variaties kunnen wolk permeabiliteit verschillen. Radioactieve tracers zoals 14C sacharose en [3 H] inuline hersenen permeabiliteit index met succes zijn aangevraagd maar niet niet aanbod de brede waaier van grootte en kosten op basis van onderzoek van de permeabiliteit als met fluorescently geëtiketteerde traceurs20.

Om bovenstaande redenen hebben wij een methode die is eenvoudig, objectieve en kwantitatieve bij het schatten van bloed - hersenbarrière permeabiliteit in vivo in muizen met behulp van fluorescently geëtiketteerde traceurs aangenomen. Dextrans zijn hydrofiel polysacchariden gekenmerkt door hun matige tot hoge moleculaire gewicht (3-200 kD) en kan worden verkregen als geladen of ongeladen molecules op basis van het geconjugeerd fluorophore. Endotheel strakke kruispunten gevormd door voornamelijk claudins (1, 3, 5 en 12) en occludin, samen bepalen de grootte van de paracellular en opladen selectiviteit door de lading porie residuen aanwezig zijn op hun eerste extracellulaire lus (herzien in21). Permeabiliteit over de bloed - hersen barrière in vivo is ook afhankelijk van glycocalyx en de basale lamina, twee structuren die aanwezig op beide zijden van de BBB22,23 zijn. Luminally huidige glycocalyx is een gel zoals gevormd door negatief geladen oligosacchariden (heparine sulfaten) structuur die ook als een barrière tegen door bloed overgedragen macromoleculen zoals albumine fungeert. Wijzigingen in de glycocalyx dikte of de samenstelling houden ook verband met vasculaire permeabiliteit wijzigingen zoals we in angiopoietin-2 winst van functie muizen in vergelijking met wild type muizen10 waargenomen. De membraan van de kelder is aan de andere kant aanwezig op de abluminal kant van de endotheliale cellen bestaande uit zowel de vasculaire kelder membraan gemaakt door endotheliale cellen en pericytes, terwijl de parenchymal kelder membraan of astrocytic kelder membraan door astrocyten. Deze kelder membranen zijn ook negatief geladen en dus ook capaciteit hebben om te dienen als kosten barrières. In dit opzicht bieden geconjugeerd dextrans onderzoek van zowel de grootte en de kosten gebaseerde permeabiliteit. TMR-dextran 3 kD is bijvoorbeeld anionogene overwegende dat TXR-dextran 3 kD neutraal is, die een van deze verklikstoffen combineert met een geconjugeerd hoog moleculair gewicht dextran zoals FITC dextran 70 kD in dezelfde mix geïnjecteerd met de muizen, kan een evaluatie geven van de grootte gebaseerde permeabiliteit. We kunnen verder gebruik maken van de lysine-corrigeerbare aard van TL-label dextrans om te verkennen van de regionale verschillen in permeabiliteit in standaard immunofluorescentie kleuring. Dextrans ook in het algemeen vertonen lage immunogeniciteit en dus dienen als goede tracers. Lucifer geel, cadaverine, fluoresceïne-5-thiosemicarbazide (FTSC), zijn onder andere verklikstoffen zijn in het bereik laag molecuulgewicht (0,4-0,8 kD) en zijn muur.

In onze werkwijze, de traceurs waren geïnjecteerd door i.p route gevolgd door de muizen zoogdierlevercellen en verkrijgen van de fluorescentie van hersenen homogenates genormaliseerd naar het natte gewicht en de serum-fluorescentie. Dit is een eenvoudige maar zeer kwantitatieve en objectieve methode, aangezien er geen selectie van secties/beelden zoals in kwantificering door immunofluorescentie methode die klassiek wordt gebruikt. We gebruiken slechts één hemi-hersenen voor de bepaling van de waterdoorlatendheid en gebruik maken van de andere hemibrain voor immunofluorescentie kleuring door het analyseren van Sagittaal secties bieden regionale verschillen in hetzelfde dier. Het gebruik van elke hemi-hersenen voor verschillende gelijktijdige metingen is een van de belangrijkste voordelen in ons protocol. Ook, permeabiliteit van andere organen zoals nieren, lever, etc. dient als een goede interne controle zoals de basale permeabiliteit hoog in deze organen is. Om te vergelijken 2 groepen, zou men moeten eerst het aftrekken van de sham-dier (die geen tracer injectie) autofluorescence van alle dieren in zowel groepen en alle het weefsel (nieren, hersenen en serum) te typen voor elke tracer en vervolgens overgaan tot genormaliseerde berekeningen vergelijken van de 2 groepen. De permeabiliteit index (PI) wordt die wordt verkregen als een verhouding van weefsel serum fluorescentie genormaliseerd naar weefsel gewicht en serum volume gepresenteerd. Onze berekeningen opleveren een absolute waarde voor de tracer-permeabiliteit die kan worden vergeleken tussen experimenten en weefseltypes (HLA). Deze waarden kunnen echter gemakkelijk worden uitgedrukt als een ratio's of procent tussen de 2 groepen met elkaar worden vergeleken, zoals we ook gedaan hebben eerder12. Dit kan worden bereikt door het verdelen van de PI van elk dier in de beide groepen met de gemiddelde PI van alle dieren in de controlegroep. Dit zou de controlegroep PI via 1 rijden nog houden van de fout tussen de dieren en voor de experimentele groep geven waarden die ten opzichte van de controle groep gemiddelde van 1.

Injectie van verklikstoffen door i.p is gemakkelijker, maar intensiever kosten in vergelijking met i.v injectie, zoals de hoeveelheid tracer moet worden verhoogd. Onze gegevens (niet afgebeeld) in dit verband blijkt dat bijna 2-fold hogere bedrag in de tracer is vereist door i.p injectie i.v t.o.v. vergelijkbare serum fluorescentie om waarden te verkrijgen. Ook is de tijd van verkeer hoger in i.p route t.o.v. i.v als gevolg van de termijnen voor tracer absorptie in de bloedstroom. In dit verband serum fluorescentie waarden op 15 min post i.p injectie vergelijkbaar waren met 5 min post i.v injectie voor verklikstoffen in het bereik van de lage en gemiddelde molecuulgewicht tussen 0.4-4 kD (gegevens niet worden weergegeven). Wij stellen voor een korte omloop tijd omdat paracellular permeabiliteit lineair is en als aanzienlijke weefsel fluorescentie is gedetecteerde post perfusie na een korte omloop tijd (15 min), al betekent dit een fenotype permeabiliteit zoals we hebben gemeld onze eerdere publicaties10,12,13,14. Maar op hetzelfde moment kon men de fluorescentie serum voor normalisatie verkrijgen. Tijde langer omloop is weefsel klaring groot, dat serum fluorescentie aanzienlijk vermindert en dus kan van invloed zijn permeabiliteit waarden genormaliseerd naar serum. Terwijl de tijd van het verkeer ten opzichte van de grootte/heffing van de tracer worden geoptimaliseerd voor elk scenario moet, stellen wij voor een korte omloop tijd als uitgangspunt. Dit geldt ook voor hoger molecuulgewicht opgeloste stoffen zoals plasma IgGs en fibrinogeen (150-400 kD) waarvan permeabiliteit kenmerken in tegenstelling tot inerte dextran verklikstoffen als gevolg van hun uiterst grote grootte en specifieke interactie met cellulaire receptoren zoals Fc zijn receptoren die hun halfwaardetijd24 veranderen. Dextrans aan de andere kant hoeft niet elke specifieke vervoerssysteem op het endotheel niveau25 en zoals endothelial hersencellen ondergaan Pinocytose tot significante niveaus wijten aan zeer lage niveaus van plasmalemma vesikel geassocieerde eiwit (PLVAP)26 , de belangrijkste route voor het vervoer van dextrans is paracellular. We hebben de bovenstaande methode met succes in verschillende scenario's toegepast, zoals permeabiliteit in transgene muizen in vergelijking met wild-type nestgenoten en ook beoordeeld permeabiliteit veranderingen in wild type muizen na therapeutische interventie10, 12 , 13 , 14. Kortom, gecombineerd met de immunofluorescentie kleuring, de bepaling van de waterdoorlatendheid hier beschreven is een eenvoudige en een robuuste methode te beoordelen van de permeabiliteit van de muizen in vivo die ook kan worden toegepast op andere kleine dieren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

De auteurs wil erkennen Sphingonet consortium gefinancierd door de Leduq foundation ter ondersteuning van dit werk. Dit werk werd ook ondersteund door het Collaborative Research Center "vasculaire differentiatie en remodeling" (CRC / Transregio23, Project C1) en door de 7. FP, COFUND, Goethe internationale Postdoc programma GO-IN, No. 291776 financiering. Wij erkennen verder Kathleen Sommer voor haar technische bijstand met muizen, behandeling en genotypering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tetramethyl Rhodamine (TMR) dextran 3kD Thermosfisher D3308
Fluorescein isothiocyanate (FITC) dextran 3kD Thermosfisher D3306
Ketamine (Ketavet) Zoetis
Xylazine (Rompun) Bayer
0.9% Saline Fresenius Kabi Deutschland GmbH
1X PBS Gibco 10010-015
Tissue-tek O.C.T compound Sakura Finetek 4583
37% Formaldhehyde solution Sigma 252549-1L prepare a 4% solution
Bovine Serum Albumin, fraction V Roth 8076.3
Triton X-100 Sigma T8787
rat anti CD31 antibody, clone MEC 13.3 BD Pharmingen 553370
goat anti rat alexa 568 Molecular Probes A-11077
goat anti rat alexa 488 Molecular Probes A-11006
DAPI Molecular Probes D1306
Aqua polymount Polyscience Inc 18606
21-gauge butterfly needle BD 387455
serum collection tube Sarstedt 41.1500.005
2mL eppendorf tubes Sarstedt 72.695.500
Kimtech precision wipes tissue wipers Kimberley-Clark Professional 05511
384-well black plate Greiner 781086
slides superfrost plus Thermoscientific J1800AMNZ
PTFE pestle Wheaton 358029
electric overhead stirrer VWR VWR VOS 14
plate reader Tecan Infinite M200
Cryostat Microm GmbH HM 550
Nikon C1 Spectral Imaging confocal Laser Scanning Microscope System Nikon
peristaltic perfusion system BVK Ismatec
microcentrifuge eppendorf 5415R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  2. Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier. Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).
  3. Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).
  4. Devraj, K., Klinger, M. E., Myers, R. L., Mokashi, A., Hawkins, R. A., Simpson, I. A. GLUT-1 glucose transporters in the blood-brain barrier: differential phosphorylation. Journal of neuroscience research. 89 (12), 1913-1925 (2011).
  5. Banks, W. A. From blood-brain barrier to blood-brain interface: new opportunities for CNS drug delivery. Nature reviews. Drug discovery. 15 (4), 275-292 (2016).
  6. Zlokovic, B. V. Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer's disease and other disorders. Nature reviews. Neuroscience. 12 (12), 723-738 (2011).
  7. Paganetti, P., Antoniello, K., et al. Increased efflux of amyloid-β peptides through the blood-brain barrier by muscarinic acetylcholine receptor inhibition reduces pathological phenotypes in mouse models of brain amyloidosis. Journal of Alzheimer's disease: JAD. 38 (4), 767-786 (2014).
  8. Devraj, K., Poznanovic, S., et al. BACE-1 is expressed in the blood-brain barrier endothelium and is upregulated in a murine model of Alzheimer's disease. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (7), 1281-1294 (2016).
  9. Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease. Annals of neurology. 72 (5), 648-672 (2012).
  10. Gurnik, S., Devraj, K., et al. Angiopoietin-2-induced blood-brain barrier compromise and increased stroke size are rescued by VE-PTP-dependent restoration of Tie2 signaling. Acta neuropathologica. 131 (5), 753-773 (2016).
  11. Scholz, A., Harter, P. N., et al. Endothelial cell-derived angiopoietin-2 is a therapeutic target in treatment-naive and bevacizumab-resistant glioblastoma. EMBO Molecular Medicine. 8 (1), 39-57 (2016).
  12. Gross, S., Devraj, K., Feng, Y., Macas, J., Liebner, S., Wieland, T. Nucleoside diphosphate kinase B regulates angiogenic responses in the endothelium via caveolae formation and c-Src-mediated caveolin-1 phosphorylation. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (7), 2471-2484 (2017).
  13. Ziegler, N., Awwad, K., et al. β-Catenin Is Required for Endothelial Cyp1b1 Regulation Influencing Metabolic Barrier Function. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 36 (34), 8921-8935 (2016).
  14. Vutukuri, R., Brunkhorst, R., et al. Alteration of sphingolipid metabolism as a putative mechanism underlying LPS-induced BBB disruption. Journal of Neurochemistry. , (2017).
  15. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J Vis Exp. (65), e3564 (2012).
  16. Hoffmann, A., Bredno, J., Wendland, M., Derugin, N., Ohara, P., Wintermark, M. High and Low Molecular Weight Fluorescein Isothiocyanate (FITC)-Dextrans to Assess Blood-Brain Barrier Disruption: Technical Considerations. Translational stroke research. 2 (1), 106-111 (2011).
  17. Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  18. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  19. Bell, R. D., Winkler, E. A., et al. Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging. Neuron. 68 (3), 409-427 (2010).
  20. Banks, W. A., Gray, A. M., et al. Lipopolysaccharide-induced blood-brain barrier disruption: roles of cyclooxygenase, oxidative stress, neuroinflammation, and elements of the neurovascular unit. Journal of Neuroinflammation. 12, 223 (2015).
  21. Krause, G., Winkler, L., Mueller, S. L., Haseloff, R. F., Piontek, J., Blasig, I. E. Structure and function of claudins. Biochimica et biophysica acta. 1778 (3), 631-645 (2008).
  22. Johansson, B. B. Blood-Brain Barrier: Role of Brain Endothelial Surface Charge and Glycocalyx. Ischemic Blood Flow in the Brain. , 33-38 (2001).
  23. Fu, B. M., Li, G., Yuan, W. Charge effects of the blood-brain barrier on the transport of charged molecules. The FASEB Journal. 22 (1 Supplement), (2008).
  24. Goebl, N. A., Babbey, C. M., Datta-Mannan, A., Witcher, D. R., Wroblewski, V. J., Dunn, K. W. Neonatal Fc receptor mediates internalization of Fc in transfected human endothelial cells. Molecular biology of the cell. 19 (12), 5490-5505 (2008).
  25. Lopez-Quintero, S. V., Ji, X. -Y., Antonetti, D. A., Tarbell, J. M. A three-pore model describes transport properties of bovine retinal endothelial cells in normal and elevated glucose. Investigative ophthalmology & visual science. 52 (2), 1171-1180 (2011).
  26. Hallmann, R., Mayer, D. N., Berg, E. L., Broermann, R., Butcher, E. C. Novel mouse endothelial cell surface marker is suppressed during differentiation of the blood brain barrier. Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 202 (4), 325-332 (1995).

Tags

Neurowetenschappen kwestie 132 bloed - hersen barrière BBB in vivo permeabiliteit kwantitatieve fluorescerend verklikstoffen endotheliale cellen microvessels haarvaten intraperitoneaal perfusie
Een <em>In Vivo</em> bloed - hersenbarrière permeabiliteit Assay in muizen met behulp van Fluorescently label Tracers
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Devraj, K., Guérit, S., Macas,… More

Devraj, K., Guérit, S., Macas, J., Reiss, Y. An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers. J. Vis. Exp. (132), e57038, doi:10.3791/57038 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter