Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

В естественных условиях Blood - brain барьер проницаемость Assay мышей с использованием дневно помечены Трейсеры

Published: February 26, 2018 doi: 10.3791/57038
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1Institute of Neurology (Edinger Institute), Goethe University Hospital, 2Pharmazentrum Frankfurt, Institute for General Pharmacology and Toxicology, Goethe University Hospital

Summary

Здесь мы представляем пробирного сосудистой проницаемости мозга мыши, используя внутрибрюшинного введения флуоресцентных Трейсеры следуют перфузии, которая применима к Животные модели blood - brain барьер дисфункции. Один hemi мозг используется для количественной оценки проницаемость и другой для трассировочного визуализации/иммуноокрашивания. Процедура занимает 5-6 ч для 10 мышей.

Abstract

Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) является специализированным барьер, который защищает мозг микроокружения от токсинов и патогенных организмов в циркуляции и поддерживает гомеостаза головного мозга. Основные сайты барьера являются эндотелиальных клеток капилляров мозга, функции которого барьер результаты от плотные межклеточные соединения и измеряем транспортеров, выраженные на плазматической мембраны. Эта функция регулируется pericytes и астроциты, которые вместе образуют блок нервно-сосудистых (NVU). Несколько неврологических заболеваний, таких как инсульт, болезнь Альцгеймера (AD), опухоли мозга, связанные с нарушениями функции BBB. Поэтому оценка проницаемости BBB решающую роль в оценке тяжести неврологических заболеваний и успех стратегий лечения.

Мы представляем здесь простой, но надежные проницаемость assay, который успешно применялся для нескольких мыши модели оба, генетические и экспериментальных. Метод является высоко количественных и объективной по сравнению с трассирующими флуоресцентный анализ по микроскопии, который часто применяется. В этом методе мышей внутрибрюшинно вводили с сочетанием водный инертных флуоресцентные Трейсеры следуют обезболивающим мышей. Сердца перфузии животных производится до сбора урожая, мозга, почек и других органов. Органы гомогенизации и центрифугируют следуют измерения флуоресценции от супернатант. Кровь из сердца пункция перед перфузии служит для цели нормализации сосудистой отсек. Ткани флуоресценции нормируется для мокрой веса и сыворотки флуоресценции для получения количественных трассирующими индекса проницаемости. Для дополнительного подтверждения контралатеральной hemi мозга сохраняется для иммуногистохимии могут быть использованы для трассировочного флуоресценции визуализация целей.

Introduction

Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) состоит из микрососудистой эндотелиальных клеток (ECs), поддерживаемых тесно связаны pericytes (шт.), которые являются муфтами в базальной пластинки, и астроциты (АКГ), которые окутывают базальной мембраны с их конец ноги1 ,2. ECs взаимодействовать с несколькими типами клеток, которые поддерживают и регулируют функцию барьера, главным образом ACs и ПК, а также нейронов и микроглии, которые вместе формируют нервно-сосудистого блок (NVU). NVU имеет решающее значение для функции BBB, который ограничивает транспорта кровь токсинов и патогенных въезд в мозг. Эта функция является результатом жесткие соединения молекул, таких как Клаудин-5, occludin, zonula occludens-1, которые присутствуют, между ECs, а также из-за действий перевозчиков например р гликопротеина (P-gp), измеряем молекулы, которые вводят эндотелия обратно в судно просвета1,2,3. BBB однако позволяет для перевозки необходимых молекул, таких как питательные вещества (глюкозу, железа, аминокислоты) конкретных перевозчиками, выразили ЕС мембраны плазмы1,2,3. EC слой сильно поляризованных распространение различных перевозчиков между Люминал (кровь облицовки) и abluminal (оболочек мозга облицовки) для конкретных и векторных транспорта функция4,5 . В то время как BBB защитные отношении плотно регулирующих окружение ЦНС, это серьезной проблемой для доставки лекарств ЦНС при заболеваниях, таких как болезнь Паркинсона с функциональной BBB. Даже в неврологических заболеваний с BBB дисфункции нельзя предположить, что мозг доставки лекарств увеличивается особенно дисфункции барьер может включать урон целям конкретных транспортер, например, как болезнь Альцгеймера (AD). В AD несколько бета амилоида перевозчиков, таких как LRP1, ярость, P-gp известны как dysregulated и следовательно ориентация этих перевозчиков может быть бесполезным6,,78. BBB нарушениями в нескольких неврологических заболеваний, таких как инсульт, AD, менингит, склероза и в мозгу опухоли9,10,11. Таким образом важно его оценки и восстановление барьерной функции является важной частью терапевтические стратегии.

В этой работе мы описали объективную и количественный протокол для assay проницаемость грызунов, что мы успешно применяется несколько линий мыши оба заболевания трансгенных и экспериментальной модели10,12,13 ,14. Метод основан на простой внутрибрюшинного введения флуоресцентных Трейсеры следуют перфузии мышей для удаления Трейсеры из сосудистого отсека. Мозга и других органов являются собранные пост перфузии и проницаемость, оценивать объективную и абсолютной проницаемости индекс, основанный на измерениях флуоресценции гомогенатах ткани на тарелку читателя. Все сырье флуоресценции значения корректируются для фона с помощью ткани гомогенатах или сыворотки от Шам животных, которые не получают любой трассировщик. Достаточно нормировок включены в объем сыворотки, сыворотка флуоресценции и вес ткани, таким образом давая индекса проницаемости, которая является абсолютным и сопоставимых между экспериментов и типы тканей. Для облегчения сравнения между группами абсолютной проницаемости значения индекса могут быть легко преобразованы соотношений как мы выполняли ранее12. Одновременно хранимые hemi мозги и почек могут быть использованы для визуализации трассирующими микроскопии флуоресцирования10. Классический флуоресцентной микроскопии может быть ценным в получении региональные различия в проницаемости, хотя и громоздким из-за субъективный выбор разделов ткани и изображений для полуколичественного анализа. Подробные шаги представлены в протоколе и примечания добавлены при необходимости. Это обеспечивает необходимую информацию для успешного выполнения пробирного проницаемости в естественных условиях в мышей, которые можно масштабировать до других мелких животных. Assay может применяться для многих видов трассировщиков заряд и размер на основе оценки проницаемость сочетанием Трейсеры с спектры флуоресценции отдельных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все животные были обработаны с особой тщательностью, свести к минимуму боль или дискомфорт во время процедуры. Эта процедура руководящими животных ухода нашего института и был одобрен местным комитетом (Regierungspraesidium Дармштадт, номер официального утверждения FK/1044).

Схема работы шаги в vivo пробирного проницаемости в мышах показано на рисунке 1. Сведения о каждом шаге описаны ниже.

1. Транспортировка животных

  1. Подготовка и администрирование Трейсеры и анестетики
    1. Подготовьте помечены трубы и формы для встраивания по крайней мере за день до assay проницаемость тканей. Поддерживать стерильные условия во всем протокол, работая под чистой зонта и с помощью инструментов, очищены с 80% этанола. Использование мужского или женского пола одичал тип (WT) или Ангиопоэтин-2 (анг-2) получить из функция CD1 (Гоф) мышах в зрелых взрослых возрастной группе 3-6 месяцев для текущего протокола. Выполняют генотипирования мышей, как описано выше 10.
      Примечание: 80% алкоголя не приведет к стерильные инструменты, но позволит свести к минимуму загрязнение образцов подготовленных.
    2. Разбавить всех трассировщиков в стерильных PBS в акции 2 мм и хранить аликвоты, защищенном от света при-20 ° C.
    3. Выберите Трейсеры как (тетраметилсвинца родамин) ПМР и (флуоресцеин Изотиоцианаты) FITC с спектров различных возбуждения/выбросов и что являются лизин поправимо, что приводит к минимальным помех между красители по микроскопии флуоресцирования (с использованием ПМР или FITC фильтра соответственно) и флюометрия на тарелку читателя для assay проницаемости.
      Примечание: ПМР декстрана 3 kD и FITC декстрана 3 КД, используемые в исследовании как лизин поправимо и следовательно могут также использоваться для Иммуногистохимический анализ после фиксации с альдегиды с целью изучения региональных различий.
    4. Обрабатывать все животные с особой тщательностью инструкций институционального ухода. Придать внутрибрюшинно каждая мышь с 100 мкл трассирующими решение, которое может быть увеличено до 200 мкл, когда дополнительные трассирующими сочетается с помощью 100 мкл каждого трассировочного в смесь 1:110,13. Придать по крайней мере одно животное с PBS, только вместо Трейсеры служить Шам управления для аутофлюоресценция вычитание фона.
    5. 5 мин после инъекции трассирующими, анестезировать животное с i.p инъекции кетамина и ксилазина (5-10 мг и 100 мг в 0,9% физиологического раствора за кг тела соответственно, вес 150 мкл коктейль за 25 g мышь).
      Примечание: Vet мазь не применялась на глазах во время процедуры как краткий период между животных анестезии и перфузии/жертву (10 минут) где любой сушки глаз не наблюдалось.
  2. Коллекции и сердечная перфузии крови
    1. Готовить животных для сердца перфузии 10 мин после анестезии администрации. Проверьте отсутствие ответа дергаться лапы с тем чтобы обеспечить, что животное достиг хирургические плоскости анестезии.
    2. Положите животных на их обратно и применять 80% этанола на коже живота. С помощью маленькие ножницы, откройте брюшной стенки с небольшой разрез (2 см) чуть ниже грудной клетки. Отдельные функции печени от диафрагмы и затем медленно прорваться через диафрагму, подвергая плевральной полости 15.
    3. Разрезать грудную клетку на двусторонней основе и исправить отрезока грудины, чтобы разоблачить левого желудочка. Вставьте 21-калибруйте Бабочка иглы, подключенных к системе перистальтические перфузии в заднего левого желудочка.
    4. Прокол правого предсердия и быстро (в течение 10 s) собирать 200-300 мкл крови в грудной полости, используя советы Пипетка 1 мл (с конца отсечения) в сыворотке крови коллекции трубок и хранить его на льду.
      Примечание: Эта процедура перфузии является не выживание.
    5. Как только кровь собирается, переключитесь на системе перфузии (10-12 об/мин, 5 мл/мин) и perfuse животное на 3 мин с теплой (RT) 1 x PBS (бесплатно Ca2 +/мг2 + ионов).
      Примечание: PBS содержащие Ca2 +/Mg2 + ионы могут быть использованы для улучшения сердечной деятельности во время перфузии. Общее количество PBS для перфузии находится в диапазоне 15-20 мл.
    6. Оценить качество перфузии, отметив цвета печени, почек, которые появляются белые/Пале после перфузии.
      Примечание: Функции почек или печени перфузии не обязательно указывает перфузии мозга как артерии (сонной артерии/позвонков) достижение что мозг от аорты может получить разрыв во время подготовки в шаге 3 особенно во предсердий прокол.

2. ткань обработка

  1. Орган сбор и хранение
    1. В конце перфузии подтвердите смерть животного шейки матки вывихов и урожай мозга и почек. Проверка перфузии мозга по цвету мозги (не видимой крови в сосудах мозговых оболочек), с тем чтобы исключить животных от проницаемости анализа, когда качество перфузии не является хорошим. Разделите мозга на 2 hemibrains, с помощью скальпеля (рис. 1).
    2. Препарировать скальпелем один hemibrain бесплатно обонятельные лопастями и мозжечке и передачи hemicerebrum 2-мл пробирку. Хранить hemi мозжечка в дополнительной трубки, если необходимые для оценки мозжечковой проницаемости.
    3. Перевести одну почку в другой 2-мл пробирку. Храните образцы сразу на сухой лед.
    4. Внедряйте изначально оставшиеся почек и геми мозга (включая мозжечка и обонятельные доли) в ткани tek оптимального раскроя температуры (O.C.T) соединение на сухой лед.
    5. В конце концов Центрифугуйте образцы крови, хранящиеся на льду в сыворотке крови коллекции трубок на 10, 000 g, 10 мин при 4 ° C. Передача supernatants сыворотки для 1.5 мл пробирок и поместите их в контейнер сухого льда.
    6. Передача всех образцов, собранных на сухого льда в морозильной камере-80 ° C до дальнейшей обработки.
      Примечание: Важно, заморозить образцов, прежде чем приступать к гомогенизации шаги как повышение эффективности гомогенизации после, как замораживание оттаивания.
  2. Гомогенизация и центрифугирования
    1. Оттепель на льду образцы hemi головного мозга и почек, замороженные вниз на-80 ° C и весят пробирки, содержащие органов. От этих весов вычтите среднее значение нескольких пустых труб (около 20) чтобы получить вес ткани. Добавить 300 мкл и 200 мкл холодной 1 X PBS в пробирки, содержащие почек и геми-головного мозга, соответственно.
      Примечание: для более низких объемов ткани (как hemi мозжечка, ниже 100 мг) весом отдельные трубы рекомендуется.
    2. Однородный каждый образец в оригинальной eppendorf трубки с пестиком из политетрафторэтилена (ПТФЭ) придает электрические накладных мешалкой (1, 000 об/мин), выполняя около 15 ударов (1 ход = 1 вверх и вниз 1). Прополощите толкателем с PBS между образцы и протрите сухой перед переходом к следующему образцу.
      Примечание: Из-за возможных помех с флюометрия было избегать использования моющих средств во время гомогенизации. Однако внутриклеточный трассирующими также обнаружен в этот протокол, как ткань тщательно гомогенизированные, который является более эффективным, после того, как один раунд заморозить оттаивания.
    3. Храните гомогенизированных образцов на льду, защищенном от света и все вместе в конце на 15000 g, 20 мин, 4 ° C в центрифугу настольная центрифуга. Передавать supernatants новой 1.5 мл пробирок на льду для немедленного флюометрия или на-80 ° C до быть проанализированы позднее.
  3. Флуоресценции измерение и количественное определение
    1. Если заморожен в конце предыдущего шага, оттепели на льду супернатант и сыворотки образцов ткани, хранящиеся в-80 градусов, защищая их от света с фольгой.
    2. Пипетка 50 мкл разбавленного сыворотки (30 мкл ПБС + 20 мкл сыворотки) или supernatants ткани (как) 384-ну черный знаке. Включать по крайней мере один образец из Шам животного для сыворотки крови и тканей supernatants для обеспечения надлежащего фон вычитание, как этот фон огневки ткани обычно выше, чем у PBS, используется как растворитель.
      Примечание: В среднем 3 Шам животных может использоваться для аутофлюоресценция, хотя было отмечено очень немного изменчивости в Шам аутофлюоресценция значения (данные не показаны). Количество сыворотки используется может быть уменьшена разбавления с PBS, который также может увеличить соотношение сигнал-шум для образцов с низкой флуоресценции таких образцов мозга. До 10 мкл сыворотки был испытан, разбавляя его с 40 мкл PBS. Убедитесь, что нет пузырьков присутствуют в скважинах.
    3. Вставьте пластину 384-ну черный в пластине читатель и открыть новый сценарий выбора измерений флуоресценции.
    4. Установить коэффициент усиления для оптимального и использовать значения возбуждения/выбросов (Нм) 550/580 или 490/520 для ПМР или FITC dyee соответственно и начать измерения для получения сырья флуоресценции единиц (RFUs).
    5. Используйте сырой флуоресценции единиц (RFUs) от читателя пластины для вычисления индекса проницаемости (PI) после вычитания значения соответствующих Шам.
      1. * Индекса проницаемости (мл/г) = (Вес ткани ткани RFUs/г) / (сыворотка RFUs/мл сыворотки)
    6. Пример расчета индекса проницаемости мозга (PI) животного GOF1 (Таблица 1):
      1. GOF1 мозг RFUs - Шам мозга RFUs = 154-22,5 = 131,5
      2. GOF1 сыворотка RFUs - Шам сыворотки RFUs = 38305-27 = 38278
      3. Мозг вес (г) = 0.195
      4. Объем (мл) сыворотки = 0.02
      5. Мозг индекса проницаемости (10-3 мл/г) = (131.5/0.195)/(38278/0.02) = 0.352
        Примечание: Расчеты индекса проницаемости выход значений, которые являются абсолютными и сопоставимых между экспериментов и типы тканей. Однако они могут быть представлены как коэффициенты для облегчения сравнения между 2 группы 12. Это может быть достигнуто путем деления PI каждого животного в обеих группах с средняя PI контрольной группы, вождение средней группы управления через 1 еще сохраняя Интер животных вариации в контрольной группе. Это преобразование содержит значения для экспериментальной группы (или групп) по отношению к группе управления, равным 1.
  4. Визуализация иммунофлюоресценции трассировщика
    1. Вырежьте блоков почки/hemi мозг, изначально встроен в ткани tek соединения (O.C.T) (шаг 2.1) в 10 мкм разделы на криостата набор до-20 ° C и передать разделы слайды размещены при комнатной температуре. Как только разделы сушатся (около 30 мин), передача слайды морозильник-80 ° C до использования.
    2. В день окрашивания оттепель слайды при 37 ° C 10 мин и затем исправить разделы с 4% paraformaladehyde (PFA) для 10 мин при комнатной температуре, после быстрой стирки в PBS.
    3. Инкубируйте в подразделах permeabilization/блокирование буфера из стерильных PBS, содержащие BSA 1% и 0,5% Тритон X-100 pH 7.5 за 1 ч при комнатной температуре.
    4. Инкубируйте слайды для 1,5 ч при комнатной температуре с CD31 основное антитело (0.5 мг/мл, клонировать MEC 13.3), разводят в 1: 100 в буфер, содержащий стерильные PBS, BSA 0,5%, 0,25% Тритон X-100 (рН 7,2) следуют три автомойки 5 мин в PBS.
    5. Выполните вторичное антитело инкубации в буфере выше на 1 ч при комнатной температуре с вегетационных дневно помечены антитела разбавленных 1: 500 (2 мг/мл). Для CD31 коза анти крыса Alexa 568 или Alexa 488 может использоваться в разведении 1: 500. Включать DAPI (300 мкм) в вторичное антитело смесь (1:1, 000 разрежения из запаса) пятно для ядер.
    6. Маунт окрашенных участков с Аква polymount и оставить его на ночь для полимеризации при комнатной температуре в темноте.
    7. Получение изображений с помощью спектральных тепловизионных Конфокальная лазерная сканирующая система микроскопа. Анализ изображений с NIS элементы программного обеспечения (версия 4.3). Программное обеспечение как Photoshop может использоваться для генерации монтаж фигур.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Недавно мы показали, что Ангиопоэтин-2 (анг-2) получить из функции (Гоф) мышах имеют выше проницаемости сосудов мозга чем управления мышей в здоровых условий10. В ход наведенные мышей он был также показывает, что GOF мышей больше инфаркте размеры и большей проницаемостью чем однопометники управления. Эти результаты показывают важную роль анг-2 проницаемости на BBB. Протокол поэтому использовали мышей GOF и сравнили их контролировать однопометники описать пробирного проницаемости в естественных условиях . Однако этот метод можно применить к любой модели, трансгенные мыши модели болезни или наркотиков лечения, которые изменяют проницаемость BBB, как мы делали ранее, 10,11,12,13.

Краткое обращение времени (15 мин) для анализа проницаемость предлагается, как раза дольше циркуляции приведет к большей распродажа от сосудистых отделение, которое также было отмечено в предыдущих исследованиях16. Распродажа 3 kD FITC-декстрана в 2 h ()Рисунок 2 C, D) намного больше, чем на 15 мин ()Рисунок 2 A, B) в функции почек, а также ткани мозга. В головном мозге существует очень мало внесосудистой трассирующими связи нетронутыми blood - brain барьер в этих взрослых мышей WT (Рисунок B, D). Применяя этот метод, сравнивали трассировщик проницаемости в анг-2 GOF с WT однопометники. Результаты представлены в виде таблицы (Таблица 1) указывают выше трассирующими накопление в мозге мышей GOF, по сравнению с WT мышей. Однако флуоресценции почек не изменяется между этими группами. Иммунофлюоресценции изображения подтверждают увеличение внесосудистой трассирующими GOF мышей ()Рисунок 3 B, D) по сравнению с WT мышей ()Рисунок 3 , C) где трассировщик ограничивается сосудистой отсека.

Figure 1
Рис. 1. Схема рабочего процесса для в vivo assay проницаемости с использованием флуоресцентных трассировщики. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2. Распродажа трассировки на короткие и длинные циркуляции раз. Для того, чтобы установить время циркуляции трассировщик для assay проницаемости, короткой циркуляции время 15 мин (A, B) был по сравнению с длиной циркуляции время 2 h (C, D) пост трассирующими инъекции. Длиннее время тираж 2 ч привели к очень низкое количество трассирующими накопления в почки (C) , где высока базальной проницаемости по сравнению с короткой 15 мин время циркуляции (A) потенциально из-за очень высокой Распродажа FITC декстран-3 КД (зеленый канал) от сосудистых отсека. Этот эффект был даже более впечатляющим в головном мозге, характеризуется жесткой blood - brain барьер (B, D). CD31 окрашивание (красный канал) подтвердил наличие судов в регионе интереса. Представитель изображения из одного животного из 2 одичал тип взрослых мышей CD1 вводят с трассировщик для каждой точки время и животных были принесены в жертву без perfusing их визуализировать внутрисосудистого tracer. В баре шкалы = 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3. Пятнать для индикаторов для оценки изменения проницаемости мозга мышей GOF иммунофлюоресценции. Увеличение проницаемости 3 kD ПМР декстран трассировщик (в красном) могут быть визуализированы в анг-2 GOF мышей (B, D) по сравнению с однопометники WT (A, C) в регионе коры. В WT животных трассировщик ограничивается судов (A, C) в то время как внесосудистой tracer может наблюдаться в GOF мышей (белые стрелки в B, D). Пятнать для CD31 (в синем) в Объединенном изображения (A-D) подтверждает наличие судов. Рисунок показывает представитель изображения от 2 Вт и 2 GOF мышей вводят с i.p Трейсеры и жертву инъекции пост 15 мин с перфузии. Шкалы бар = 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Животных ID Мозг вес (г) Вес (г) почек Объем (мл) сыворотки Сыворотка РФС Почки РФС Мозг РФС Перми. Индекс (10 ^-3 мл/г)
Почка Мозг
GOF 1 0.195 0,252 0.02 38305 31051 154 64,4 0.352
ГОФ 2 0,177 0.249 0.02 42001 31411 126 60 0,278
WT-1 0,167 0.301 0.02 40904 31591 64 51.2 0.122
ВТ 2 0.146 0,294 0.02 39502 31768 70 54,8 0.164
ШАМ 0.155 0,27 0.02 27 36 22,5 NA NA

Таблицы 1. Вычисления проницаемость тканей. Индекса проницаемости, что расчеты анг-2 получить из функции (Гоф) и мышах одичал тип однопометники (WT) ясно показывают большую (около 2 раза) мозг проницаемость GOF мышей, по сравнению с WT мышей. Проницаемость почек, однако в том же диапазоне между 2 группами. Проницаемость базальной почек намного больше по сравнению с мозга как ожидалось вследствие перфорированную эндотелия в почках, которые не образуют плотный барьер.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Дисфункции Blood - brain барьер связан с рядом неврологических расстройств, в том числе начального и среднего мозга опухоли или инсульта. BBB разбивка часто ассоциируется с угрожающей жизни ЦНС отек. Выяснение молекулярных механизмов, которые вызывают открытие или закрытие BBB поэтому терапевтическое значение в неврологических расстройств и обычно исследуется исследователями. Однако методы расследования в литературе, о BBB проницаемости в естественных условиях часто связаны с техническими трудностями, которые зависят от утомительной и субъективные количественная оценка флуоресценции изображения17,18 , 19. Кроме того, некоторые методы включают весь мозг флуоресценции изображений, что ошибочно как он больше свидетельствует о проницаемости поверхностных сосудов головного мозга не образующих плотный барьер. Даже когда количественная оценка была проведена на основе объективных мозга ткани поглощения (например, оценка проницаемости Эванс синий) животные часто не являются увлажненную приводит к ошибочной интерпретации из-за значительных крови дроби. Вес мозга является другой переменной, которая часто не включена в расчеты проницаемости, но должен быть как отеки, обусловленные сосудистой проницаемости может увеличить вес и изменить чистой проницаемости. Кроме того секс и вариации веса животных и животных мозг может омрачить проницаемость различия. Радиоактивные Трейсеры как 14C сахарозы и инулина [3 H] успешно применялись для индекса проницаемости мозга, но сделать не предлагают широкий спектр размеров и заряд на основе проницаемости расследования как дневно обозначенные Трейсеры20.

По указанным выше причинам мы приняли метод, который прост, объективным и количественные оценки blood - brain барьер проницаемости в естественных условиях у мышей с использованием дневно обозначенные трассировщиков. Декстраны являются гидрофильные полисахаридов, характеризуются их умеренно высокий молекулярный вес (kD 3-200) и могут быть получены как заряженные или незаряженные молекул на основе конъюгированных Флюорофор. Эндотелиальные плотные соединения формируется главным образом Клаудины (1, 3, 5 и 12) и occludin, вместе определить размер параклеточный и заряд избирательностью заряда поры остатков на их первый внеклеточная петля (обзор в21). Проницаемость через гематоэнцефалический барьер в естественных условиях зависит также от Гликокаликс и базальной пластинки, две структуры, которые присутствуют на обеих сторон BBB22,23. Luminally настоящий Гликокаликс представляет собой гель, как структура, образованный отрицательно заряженных олигосахариды (гепарин сульфаты), которая также действует как барьер, чтобы кровь макромолекулы как альбумин. Изменения в Гликокаликс толщина или состав также связаны с сосудистой проницаемости изменения, как мы наблюдали в Ангиопоэтин-2 получить функция мышей, по сравнению с дикого типа мышей10. Базальной мембраны с другой стороны присутствует на abluminal стороне эндотелиальных клеток, включающий оба сосудистой базальной мембраны сделанные эндотелиальных клеток и pericytes, тогда как Паренхиматозный базальной мембраны или Астроцитарная базальной мембраны в астроциты. Эти подвале мембраны также отрицательно заряженные и таким образом также имеют способность служить заряда барьеров. В этой связи конъюгированных декстраны предлагают расследования как размер, так и на основе заряда проницаемости. Например, ПМР декстран 3 кд анионные, тогда как TXR-декстран 3 КД является нейтральным, сочетая один из этих индикаторов с конъюгированные высокой низкомолекулярного декстрана например FITC декстран 70 kD в том же смесь вводят для мышей, можно оценить на основе размера проницаемости. Мы далее воспользоваться лизин поправимо характер люминесцентные меченых декстраны изучить региональные различия в проницаемости в стандартных иммунофлюоресценции пятнать. Декстраны также обычно характеризуются низкой иммуногенностью и таким образом служить хорошим Трейсеры. Люцифер желтый, кадаверин, флуоресцеин-5-тиосемикарбазида (FTSC), являются среди других индикаторов, которые находятся в диапазоне от низкой молекулярной массой (0,4-0,8 КД) и поправимо.

В нашем методе Трейсеры вводили i.p маршрута следуют perfusing мышей и получения флуоресценции гомогенатах мозга нормализуется для сырого веса и флуоресценции сыворотки. Это простой, но весьма количественных и объективный метод, как выделение секции/изображений и в квантификации методом immunofluorecence, который используется в классическом стиле. Мы используем только один hemi мозг для assay проницаемость и использовать другие hemibrain для иммунофлюоресценции, окрашивание, анализируя сагиттальной секций, обеспечивая региональные различия в то же самое животное. Использование каждого hemi мозга для отдельных параллельных измерений является одним из главных преимуществ нашего протокола. Кроме того проницаемость таких других органов, как почки, печень и т.д. служит хорошим внутреннего контроля как базальную проницаемость высок в этих органах. Для того чтобы сравнить 2 группы, можно было бы сначала вычесть животное Шам (который не получил трассировочный инъекций) аутофлюоресценция из всех тканей и всех животных в группах как типы (почек, мозга и сыворотки) для каждого трассировочного и затем приступить к нормализованных расчеты, сравнение 2 групп. Индекса проницаемости (PI) представлен что получается как отношение ткани для флуоресценции сыворотке нормализуются вес и сыворотки тома ткани. Наши расчеты дают абсолютного значения для трассировочного проницаемости, которые могут быть сопоставлены между экспериментов и типы тканей. Эти значения однако, может быть легко выражен как коэффициенты или процентов между 2 группами, сравниваемых как мы также сделали ранее12. Это может быть достигнуто путем деления PI каждого животного в обеих группах с средняя PI животные в контрольной группе. Это будет диск в контрольной группе PI через 1 еще сохраняя ошибка между животными и для экспериментальной группы дать значений относительно среднего группы управления 1.

Инъекции трассировщиков, i.p легче, но более интенсивный стоимость по сравнению с i.v инъекции, как количество трассировочных необходимо увеличить. Наши данные (не показан), в этой связи указывает, что почти вдвое выше сумма в трассировщике впрыской i.p, по сравнению с i.v обязан получить аналогичные сыворотки флуоресценции значений. Кроме того время обращения выше маршруту i.p, по сравнению с i.v за время для трассировочного поглощения в поток крови. В этой связи значения флуоресценции сыворотки на 15 мин пост i.p инъекции были сопоставимы с 5 мин пост i.v инъекции для трассировщиков в диапазоне 0,4-4 низкой и средней молекулярной массой kD (данные не показаны). Мы предлагаем время короткой циркуляции, потому что параклеточный проницаемости линейной и если флуоресценцией значительных ткани перфузии обнаруженных пост после короткой циркуляции времени (15 мин), это уже указывает проницаемость фенотип, как мы уже сообщали в наших предыдущие публикации10,12,,1314. Но в то же время одно может получить сыворотки флуоресценции для нормализации. На более длительное время циркуляции тканей просвет значительные, которая значительно уменьшает сыворотке флуоресценции и таким образом может повлиять на значения проницаемости, нормализованы в сыворотке. Хотя время обращения по отношению к заряда размер трассировочного должен быть оптимизирован для каждого сценария, мы предлагаем короткой циркуляции время отправной точкой. Это относится также к более высокой молекулярной массой растворенных веществ как плазмы IgGs и фибриногена (150-400 кд), чьи характеристики проницаемости, в отличие от инертного декстрана Трейсеры из-за их чрезвычайно большого размера и специфическое взаимодействие с клеточных рецепторов, такие как ФК рецепторы, которые изменяют их полураспада24. Декстраны с другой стороны не имеют каких-либо конкретных транспортной системы в эндотелиальных уровня25 и как эндотелиальные клетки мозга не проходят Пиноцитоз значительного уровня из-за очень низкий уровень plasmalemma везикул связанные белком (PLVAP)26 , Главный маршрут транспортировки декстраны является параклеточный. Мы применили выше метод успешно в нескольких сценариях, таких как проницаемость у трансгенных мышей по сравнению с одичал тип однопометники и также оценены изменения проницаемости в дикого типа мышей после терапевтического вмешательства10, 12 , 13 , 14. в целом, в сочетании с пятнать иммунофлюоресценции, пробирного проницаемость, описанные здесь это простой и надежный метод для оценки проницаемость мышей в естественных условиях , также может применяться для других мелких животных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Acknowledgments

Авторы хотели бы признать Sphingonet консорциум, финансируемой Фондом Leduq для поддержки этой работы. Эта работа была также поддержана сотрудничество исследовательский центр «сосудистые дифференциации и реконструкции» (CRC / Transregio23, проект C1) и 7. FP, COFUND, Гете международного постдока программы GO-IN, № 291776 финансирования. Мы также признаете Кэтлин Sommer ее технической помощи с мышами, обработки и генотипирования.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tetramethyl Rhodamine (TMR) dextran 3kD Thermosfisher D3308
Fluorescein isothiocyanate (FITC) dextran 3kD Thermosfisher D3306
Ketamine (Ketavet) Zoetis
Xylazine (Rompun) Bayer
0.9% Saline Fresenius Kabi Deutschland GmbH
1X PBS Gibco 10010-015
Tissue-tek O.C.T compound Sakura Finetek 4583
37% Formaldhehyde solution Sigma 252549-1L prepare a 4% solution
Bovine Serum Albumin, fraction V Roth 8076.3
Triton X-100 Sigma T8787
rat anti CD31 antibody, clone MEC 13.3 BD Pharmingen 553370
goat anti rat alexa 568 Molecular Probes A-11077
goat anti rat alexa 488 Molecular Probes A-11006
DAPI Molecular Probes D1306
Aqua polymount Polyscience Inc 18606
21-gauge butterfly needle BD 387455
serum collection tube Sarstedt 41.1500.005
2mL eppendorf tubes Sarstedt 72.695.500
Kimtech precision wipes tissue wipers Kimberley-Clark Professional 05511
384-well black plate Greiner 781086
slides superfrost plus Thermoscientific J1800AMNZ
PTFE pestle Wheaton 358029
electric overhead stirrer VWR VWR VOS 14
plate reader Tecan Infinite M200
Cryostat Microm GmbH HM 550
Nikon C1 Spectral Imaging confocal Laser Scanning Microscope System Nikon
peristaltic perfusion system BVK Ismatec
microcentrifuge eppendorf 5415R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  2. Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier. Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).
  3. Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).
  4. Devraj, K., Klinger, M. E., Myers, R. L., Mokashi, A., Hawkins, R. A., Simpson, I. A. GLUT-1 glucose transporters in the blood-brain barrier: differential phosphorylation. Journal of neuroscience research. 89 (12), 1913-1925 (2011).
  5. Banks, W. A. From blood-brain barrier to blood-brain interface: new opportunities for CNS drug delivery. Nature reviews. Drug discovery. 15 (4), 275-292 (2016).
  6. Zlokovic, B. V. Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer's disease and other disorders. Nature reviews. Neuroscience. 12 (12), 723-738 (2011).
  7. Paganetti, P., Antoniello, K., et al. Increased efflux of amyloid-β peptides through the blood-brain barrier by muscarinic acetylcholine receptor inhibition reduces pathological phenotypes in mouse models of brain amyloidosis. Journal of Alzheimer's disease: JAD. 38 (4), 767-786 (2014).
  8. Devraj, K., Poznanovic, S., et al. BACE-1 is expressed in the blood-brain barrier endothelium and is upregulated in a murine model of Alzheimer's disease. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (7), 1281-1294 (2016).
  9. Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease. Annals of neurology. 72 (5), 648-672 (2012).
  10. Gurnik, S., Devraj, K., et al. Angiopoietin-2-induced blood-brain barrier compromise and increased stroke size are rescued by VE-PTP-dependent restoration of Tie2 signaling. Acta neuropathologica. 131 (5), 753-773 (2016).
  11. Scholz, A., Harter, P. N., et al. Endothelial cell-derived angiopoietin-2 is a therapeutic target in treatment-naive and bevacizumab-resistant glioblastoma. EMBO Molecular Medicine. 8 (1), 39-57 (2016).
  12. Gross, S., Devraj, K., Feng, Y., Macas, J., Liebner, S., Wieland, T. Nucleoside diphosphate kinase B regulates angiogenic responses in the endothelium via caveolae formation and c-Src-mediated caveolin-1 phosphorylation. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (7), 2471-2484 (2017).
  13. Ziegler, N., Awwad, K., et al. β-Catenin Is Required for Endothelial Cyp1b1 Regulation Influencing Metabolic Barrier Function. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 36 (34), 8921-8935 (2016).
  14. Vutukuri, R., Brunkhorst, R., et al. Alteration of sphingolipid metabolism as a putative mechanism underlying LPS-induced BBB disruption. Journal of Neurochemistry. , (2017).
  15. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J Vis Exp. (65), e3564 (2012).
  16. Hoffmann, A., Bredno, J., Wendland, M., Derugin, N., Ohara, P., Wintermark, M. High and Low Molecular Weight Fluorescein Isothiocyanate (FITC)-Dextrans to Assess Blood-Brain Barrier Disruption: Technical Considerations. Translational stroke research. 2 (1), 106-111 (2011).
  17. Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  18. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  19. Bell, R. D., Winkler, E. A., et al. Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging. Neuron. 68 (3), 409-427 (2010).
  20. Banks, W. A., Gray, A. M., et al. Lipopolysaccharide-induced blood-brain barrier disruption: roles of cyclooxygenase, oxidative stress, neuroinflammation, and elements of the neurovascular unit. Journal of Neuroinflammation. 12, 223 (2015).
  21. Krause, G., Winkler, L., Mueller, S. L., Haseloff, R. F., Piontek, J., Blasig, I. E. Structure and function of claudins. Biochimica et biophysica acta. 1778 (3), 631-645 (2008).
  22. Johansson, B. B. Blood-Brain Barrier: Role of Brain Endothelial Surface Charge and Glycocalyx. Ischemic Blood Flow in the Brain. , 33-38 (2001).
  23. Fu, B. M., Li, G., Yuan, W. Charge effects of the blood-brain barrier on the transport of charged molecules. The FASEB Journal. 22 (1 Supplement), (2008).
  24. Goebl, N. A., Babbey, C. M., Datta-Mannan, A., Witcher, D. R., Wroblewski, V. J., Dunn, K. W. Neonatal Fc receptor mediates internalization of Fc in transfected human endothelial cells. Molecular biology of the cell. 19 (12), 5490-5505 (2008).
  25. Lopez-Quintero, S. V., Ji, X. -Y., Antonetti, D. A., Tarbell, J. M. A three-pore model describes transport properties of bovine retinal endothelial cells in normal and elevated glucose. Investigative ophthalmology & visual science. 52 (2), 1171-1180 (2011).
  26. Hallmann, R., Mayer, D. N., Berg, E. L., Broermann, R., Butcher, E. C. Novel mouse endothelial cell surface marker is suppressed during differentiation of the blood brain barrier. Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 202 (4), 325-332 (1995).

Tags

Нейронауки выпуск 132 гематоэнцефалический барьер BBB в естественных условиях проницаемость количественных люминесцентные Индикаторы эндотелиальные клетки микрососудов капилляры внутрибрюшинного перфузии
<em>В естественных условиях</em> Blood - brain барьер проницаемость Assay мышей с использованием дневно помечены Трейсеры
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Devraj, K., Guérit, S., Macas,… More

Devraj, K., Guérit, S., Macas, J., Reiss, Y. An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers. J. Vis. Exp. (132), e57038, doi:10.3791/57038 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter